馬果果，馬志強(qiáng)，李忍萍

（河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 洛陽 471000）

我國是胃癌（gastric carcinoma）高發(fā)國家，每年新發(fā)病例占全球的40%[1]。近年來，隨著對惡性腫瘤研究的不斷深入，越來越多的學(xué)者認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞也具有固體腫瘤特征，胃癌可能是一種干細(xì)胞疾病[2]。因此研究胃癌干細(xì)胞內(nèi)的自我更新相關(guān)分子信號通路，對于胃癌的針對性治療具有重要意義。胃癌的高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性及高復(fù)發(fā)性是本病高致死率的主要因素?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)是基質(zhì)金屬蛋白酶之一，能降解細(xì)胞外基質(zhì)。MMP-2是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤供血血管新生過程中的重要參與因子[3]。研究顯示[4],MMP2可能是腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)活性的重要促進(jìn)因子。但是MMP2對胃癌干細(xì)胞的影響，以及在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制少有報(bào)道，因此本研究探討MMP2在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)水平的意義，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 胃癌細(xì)胞系 選取胃癌MNK28細(xì)胞系，購自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍消化研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞系MKN28解凍后，置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境如下：37℃飽和濕度，CO 2體積分?jǐn)?shù)為5%,每兩天傳代一次。2.5g/L胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代。

1.2.2 無血清懸浮培養(yǎng) 取胃癌細(xì)胞系MKN28對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，PBS洗兩次之后，置于含EGF(15ng/ml)、bFGF(8ng/ml)、B27(1∶50)的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基內(nèi)，隨后以500個/孔接種于低黏附24孔板中,在37℃、50ml/L CO2孵箱中培養(yǎng)，每4d換液1次。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取胃癌細(xì)胞系MKN28對數(shù)期生長的細(xì)胞，鋪到6孔板，每孔35萬個細(xì)胞，使用LipofectaminTM 2000轉(zhuǎn)染，操作步驟參照相應(yīng)說明書。

1.2.4 Western blot檢測 將無血清培養(yǎng)1周后發(fā)育成形的懸浮球取出，置于15 ml離心管中，選用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，純化后采用4～12% Bis-Tris蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳凝膠操作，電泳電壓120V，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿接觸到分離膠底部時停止。30V室溫下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，持續(xù)1h，5%脫脂奶封閉，TBST漂洗后進(jìn)行一抗操作，試劑為MMP2(sc-80210)小鼠抗人單克隆抗體(1∶500)，內(nèi)參為MMP2(1∶2000)，4℃過夜孵育，隨后選用HRP偶聯(lián)進(jìn)行二抗，室溫環(huán)境中孵育1h，TBST漂洗，按ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Santa Cruz公司)內(nèi)附說明書進(jìn)行顯色,采用Alpha Imager 2200軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 無血清懸浮培養(yǎng)成球?qū)嶒?yàn) 取MKN28胃癌細(xì)胞樣本接種到96孔板中，每孔1000個細(xì)胞。無血清環(huán)境懸浮培養(yǎng)，時長1周，隨后記錄每個孔懸浮球數(shù)目。

1.2.6 平板克隆實(shí)驗(yàn) 將MKN28胃癌細(xì)胞樣本接種至8 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，每孔細(xì)胞數(shù)約2000個。培養(yǎng)2周后，克隆計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)采用SPSS19.0軟件，MMP2相對表達(dá)等資料采用（)表示，組間比較使用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 懸浮球細(xì)胞和普通貼壁細(xì)胞MMP2表達(dá)MKN28胃癌細(xì)胞在無血清、低粘附環(huán)境內(nèi)，依然有較少數(shù)細(xì)胞可形成懸浮球體，隨培養(yǎng)時間延長，球體增大。懸浮球MKN28細(xì)胞MMP2表達(dá)量明顯高于貼壁MKN28細(xì)胞（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 懸浮球細(xì)胞和普通貼壁細(xì)胞MMP2表達(dá)

圖1 Western blot檢測圖（A：懸浮球細(xì)胞；B：貼壁細(xì)胞）

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后MMP2表達(dá) 轉(zhuǎn)染組MMP2表達(dá)量明顯低于對照組和空白轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 Western blot檢測圖（A：轉(zhuǎn)染組；B：空白轉(zhuǎn)染組；C：對照組）

表2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后MMP2表達(dá)

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞懸浮成球率 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞懸浮成球率明顯低于對照組和空白轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。見表3、圖3。

表3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞懸浮成球率

圖3 細(xì)胞懸浮成球率檢測圖（A：轉(zhuǎn)染組；B：空白轉(zhuǎn)染組；C：對照組）

2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞克隆形成率 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞細(xì)胞克隆形成率為（2.82±0.89）%，明顯低于對照組和空白轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。見表4、圖4。

表4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞克隆形成率

圖4 細(xì)胞克隆形成率檢測圖（A：轉(zhuǎn)染組；B：空白轉(zhuǎn)染組；C：對照組）

3 討論

腫瘤，尤其是惡性腫瘤復(fù)發(fā)是本病治療難點(diǎn)之一，隨著對惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的深入，大量研究表明[5,6]，腫瘤本質(zhì)可能是一種干細(xì)胞疾病。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)是一種可進(jìn)行自我更新，并可啟動腫瘤生成的細(xì)胞，雖僅占腫瘤細(xì)胞的極少部分，但是由于其具有對放化療的抵抗、高轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，因此腫瘤干細(xì)胞活性對于對腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有著重要作用。目前研究顯示[7,8]，腫瘤干細(xì)胞存在于多種惡性腫瘤中，例如結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌以及肺癌等。研究腫瘤干細(xì)胞內(nèi)具有自我更新作用的相關(guān)子信號通路對于闡明腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，帶來腫瘤治療療效的突破具有重要意義。

研究顯示[9]，胃干細(xì)胞是一種具有自我更新、復(fù)制能力細(xì)胞。胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)理與胃干細(xì)胞自我更新能力有一定相關(guān)性?；|(zhì)金屬蛋白酶家族與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial mesenchymal transition,EMT）過程息息相關(guān)，而EMT與惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)屏障則是腫瘤細(xì)胞侵入其他血管的必要過程，而MMPs促進(jìn)ECM降解。研究顯示[10,11]，MMPs改變了腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP2與胃癌密切相關(guān)的一種基質(zhì)金屬蛋白酶，MMP2可以降解Ⅳ型膠原，它是脈管基底膜的一種重要的組成成分。研究顯示[12]，MMP2表達(dá)水平直接影響著胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度，MMP2促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Jiang[13]等研究顯示，MMP2可以增強(qiáng)胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。但是目前尚未證實(shí)MMP2在胃癌腫瘤干細(xì)胞自我更新中的作用機(jī)制。因此本研究設(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn)探討MMP2在胃癌干細(xì)胞中表達(dá)水平的意義。體外克隆球生成能力是當(dāng)前應(yīng)用最廣的腫瘤干細(xì)胞鑒定方案。細(xì)胞在體外無血清、低粘附培養(yǎng)條件下，如該細(xì)胞可生成克隆球則表示其具有自我更新能力[14]，即屬于腫瘤干細(xì)胞表現(xiàn)型。本組研究發(fā)現(xiàn)，MKN28胃癌細(xì)胞在無血清、低粘附培養(yǎng)條件下，依然有較少數(shù)細(xì)胞可形成懸浮球體，證實(shí)了該細(xì)胞屬于腫瘤干細(xì)胞表現(xiàn)型。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，懸浮球MKN28細(xì)胞MMP2表達(dá)量明顯高于貼壁MKN28細(xì)胞（P＜0.05）；表明MMP2在胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)本研究所分離的是干細(xì)胞樣亞群。與Rybarczyk[15]等研究結(jié)果相一致。通過對轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染MMP2干擾質(zhì)粒，空白轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組MMP2表達(dá)量明顯低于對照組和空白轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞懸浮成球率明顯低于對照組和空白轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞細(xì)胞克隆形成率明顯低于對照組和空白轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。表明MMP2在胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中的高表達(dá)特征與干細(xì)胞自我更新能力和增殖能力密切相關(guān)，但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，MMP2在胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞內(nèi)存在明顯高表達(dá)現(xiàn)象，并且與干細(xì)胞自我更新和增殖能力密切相關(guān)。