關(guān)鼎鯤，楊國旺

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，北京 100010)

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院楊國旺主任總結(jié)個人臨床上對于肺癌的治療經(jīng)驗處方，從中提煉出一對化痰散結(jié)、解毒化瘀的藥對——山慈菇、皂角刺，其在肺癌的治療過程中常能夠發(fā)揮控制腫瘤的作用。山慈菇味甘、微辛，性涼，歸肝、脾經(jīng)，功擅清熱解毒、化痰散結(jié)，臨床上多用以抗腫瘤，如肺癌、胃癌和肝癌等，并常以復(fù)方的形式使用[1-2]。皂角刺味辛，性溫，歸肝、胃經(jīng)，功擅消腫托毒、排膿、殺蟲，現(xiàn)代研究結(jié)果表明，其成分可有效抑制多種腫瘤[1，3]。中醫(yī)認(rèn)為，肺癌的4個基本病機為“虛、瘀、痰、毒”[4]。皂角刺有消腫解毒之功，山慈菇有解毒化痰散結(jié)之力，二者相須配伍，可以增強解毒化瘀的效果[5-6]?，F(xiàn)代臨床藥物研究結(jié)果表明，山慈菇、皂角刺均有抗肺癌的作用，然而對二者抗肺癌的靶點尚不清晰，本研究意在探討二者配伍治療肺癌的相關(guān)靶點及通路[7-8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)生物學(xué)角度出發(fā)，觀察藥物對病理網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響, 其對組合藥物研究有極大幫助[9]，如已有研究探討了左金丸對反流性食管炎的治療[10]、葶藶大棗瀉肺湯對于肺癌的治療[11]等。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，通過在數(shù)據(jù)庫中挖掘山慈菇-皂角刺藥對的化學(xué)成分、作用靶標(biāo)及利用該藥對與肺癌交集靶點富集相關(guān)信號通路，闡述二者配伍的治療效果。

1 資料與方法

1.1 山慈菇、皂角刺成分篩選

以“山慈菇”“皂角刺”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索二者成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18作為活性化合物的篩選條件[12]。

1.2 藥物相關(guān)靶點的獲得

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集相關(guān)靶點信息，并將收集到的山慈菇、皂角刺蛋白靶點信息通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://sparql.uniprot.org/)進(jìn)行蛋白與基因名稱的轉(zhuǎn)換，剔除重復(fù)值。

1.3 肺癌疾病靶點的獲得

在人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheri-tance in man，OMIM)數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中以“l(fā)ung cancer”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，并下載相關(guān)疾病基因，進(jìn)行歸納整理。

1.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建和分析

將得到的藥物主要活性成分、對應(yīng)基因靶點與疾病基因靶點交集錄入Cytoscape 3.7.2中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，以不同節(jié)點形狀區(qū)分藥物、成分、基因靶點及疾病，連線作為具有相關(guān)關(guān)系的表示。

1.5 核心靶點富集分析

將上述得到的基因靶點錄入Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org)中，對其進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 山慈菇、皂角刺有效活性成分

在TCMSP篩選出山慈菇潛在有效活性成分3種，皂角刺潛在有效活性成分12種，其成分見表1—2。二者相同有效活性成分2種，為“beta-sitosterol”(β-谷甾醇)、“Stigmasterol”(豆甾醇)。

表1 山慈菇的潛在有效活性成分Tab 1 Potentially effective active ingredients of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus

2.2 相關(guān)靶點收集

在OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得相關(guān)基因靶點503個，GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得相關(guān)靶點22 399個。對GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得的靶點以“Relevance score”>13.84為篩選條件，獲得相關(guān)靶點1 856個。將上述2個數(shù)據(jù)庫獲得基因靶點合并，并剔除重復(fù)項，共獲得肺癌疾病相關(guān)靶點2 232個。通過在線繪制Venn圖網(wǎng)站Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)獲得藥物基因靶點與肺癌疾病基因靶點的Venn圖，獲得交集靶點141個，見圖1。

2.3 核心靶點篩選及靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將收集到的交集靶點通過String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)繪制肺癌與藥物交集靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein Interaction，PPI)，見圖2。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，對PPI節(jié)點的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，圖中節(jié)點面積越大代表其度值越大。以Degree(DG)>74(二倍中位數(shù))為篩選條件篩選出核心基因靶點20個，對這20個核心基因靶點制作蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖3。上述20個靶點可作為山慈菇-皂角刺藥對治療肺癌的關(guān)鍵基因靶點。

圖2 山慈菇-皂角刺藥對治療肺癌的PPI圖Fig 2 PPI diagram of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer

圖3 山慈菇-皂角刺藥對治療肺癌的核心基因篩選圖Fig 3 Core gene screening diagram of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer

2.4 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)模型

山慈菇-皂角刺藥對治療肺癌的“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)模型圖見圖4。圖中，圓形節(jié)點為皂角刺、山慈菇，正八邊形靶點為皂角刺、山慈菇潛在有效活性成分，正八邊形A1、A2靶點為皂角刺、山慈菇相同潛在活性成分，正方形節(jié)點為皂角刺、山慈菇潛在有效活性成分對應(yīng)靶點與肺癌疾病靶點交集基因；模型中，圖形的面積越大，表示其相關(guān)聯(lián)成分及靶點更多，其度值越大，290條邊代表潛在活性成分與靶點存在的相互作用關(guān)系。

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

將上述研究中得到的21個核心基因靶點輸入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析，按照P<0.01進(jìn)行篩選。GO功能富集分析結(jié)果顯示，生物分子功能方面，主要涉及一氧化氮合酶活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子受體結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，見圖5、表3。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，涉及信號通路14條，主要為癌癥通路、乙型肝炎通路、IL-17信號通路、膀胱癌、乳腺癌、內(nèi)分泌抵抗、丙型肝炎、小細(xì)胞肺癌、VEGR通路及p53通路等，見圖6、表4。

表4 山慈菇-皂角刺藥對治療肺癌的KEGG通路富集分析前20位名稱Tab 4 Top 20 KEGG function analysis of gene target of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer

表3 山慈菇-皂角刺藥對治療肺癌的GO功能富集分析前20位名稱Tab 3 Top 20 GO function analysis of gene target of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer

scg1為MOL007991，zjc1為MOL013179，zjc2為MOL013296；zjc3為MOL013297；zjc4為MOL001736；zjc5為MOL002914；zjc6為MOL000359；zjc7為MOL000422；zjc8為MOL000073；zjc9為MOL000098；A1為MOL000358；A2為MOL000449scg1 indicates MOL007991, zjc1 indicates MOL013179, zjc2 indicates MOL013296; zjc3 indicates MOL013297; zjc4 indicates MOL001736; zjc5 indicates MOL002914; zjc6 indicates MOL000359; zjc7 indicates MOL000422; zjc8 indicates MOL000073; zjc8 indicates MOL000073; zjc8 indicates MOL000073; zjc9 indicates MOL000098; A1 indicates MOL000358; A2 indicates MOL000449圖4 山慈菇-皂角刺藥對治療肺癌的“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)模型圖Fig 4 Drug-component-target network of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer

圖5 山慈菇-皂角刺藥對治療肺癌的GO功能富集分析(排序前20位)Fig 5 GO function analysis of gene target of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer(Top 20)

圖6 山慈菇-皂角刺藥對治療肺癌的KEGG通路富集分析(排序前20位)Fig 6 KEGG function analysis of gene target of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer(Top 20)

3 討論

研究結(jié)果顯示，山慈菇-皂角刺藥對的有效活性成分槲皮素(MOL000098)、(+)-表兒茶素(MOL000073)、黃顏木素(MOL013296)、漆黃素(MOL013179)及花旗松素(MOL001736)的OB值排序居前5位，由此可以推測，上述成分可能在山慈菇-皂角刺藥對治療疾病中起主要作用。且由“藥物-成分-靶點”圖中可以看出，度值最高的為槲皮素，度值為113，表明其與網(wǎng)絡(luò)中其他靶點關(guān)聯(lián)最強。以往研究結(jié)果顯示，槲皮素存在抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)，能通過調(diào)控抑癌基因、原癌基因發(fā)揮抗腫瘤的作用[13]；漆黃素可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤[14]，可以調(diào)節(jié)由笨并(a)芘誘發(fā)的肺癌中的線粒體酶和凋亡信號[15]。由此可見，山慈菇、皂角刺相須為用有一定的藥理學(xué)基礎(chǔ)。

從PPI圖中可以看出，核心基因等度值較高的基因均為與肺癌發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系的基因。AKT1作為AKT的亞型[16]，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；AKT1作為一種癌基因參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程[17]。TP53基因作為一種抑癌基因，在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)其突變[18]；JUN作為即刻早期基因，其包含c-JUN等原癌基因，與多種細(xì)胞因子及生長因子的轉(zhuǎn)變相關(guān)，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)[19]。VEGFR基因作為血管內(nèi)皮生長因子受體基因，與肺癌發(fā)展中血管生成關(guān)系密切，為多種腫瘤治療藥物作用靶點；VEGFA主要通過ERK、PI3K/Akt通路誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖或存活，影響腫瘤的進(jìn)展[20]。山慈菇-皂角刺藥對通過上述靶點對肺癌產(chǎn)生作用，可能通過抑制原癌基因的表達(dá)及控制腫瘤的增殖基因，從而抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展。

GO功能富集分析與KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，山慈菇-皂角刺藥對通過多種生物進(jìn)程影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。MAPK通路是肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵途徑[21]。高水平的VEGF以旁分泌的形式刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)血管形成，促進(jìn)腫瘤持續(xù)生長，提高血管通透性，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[22]。目前，臨床上多種靶向藥物通過影響EGFR信號通路治療肺癌。山慈菇-皂角刺藥對也可能通過上述通路作用于肺癌，通過抑制腫瘤分裂生長、抑制腫瘤附近血管生成以及控制腫瘤轉(zhuǎn)移等途徑治療肺癌。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了山慈菇-皂角刺藥對治療肺癌的可能潛在作用機制，分析其作用于肺癌的核心靶點；山慈菇-皂角刺藥對可提高肺癌的治療效果；在中醫(yī)臨床上可以嘗試作為常規(guī)藥對使用，為今后的實驗室研究及臨床研究提供思路。其中，VEGF等通路為本課題組的關(guān)注通路，可待日后明確其機制。