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        不同的樣品前處理方式在氯霉素殘留快速檢測中的應(yīng)用情況探討

        2021-07-29 06:43:08張家意丘韶麟陳苑廖瑋
        農(nóng)業(yè)與技術(shù) 2021年14期
        關(guān)鍵詞:檢測線氯霉素膠體金

        張家意丘韶麟陳苑廖瑋

        (1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司,廣東 廣州 511442;2.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站,廣東 廣州 511442; 3.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 511442)

        引言

        氯霉素(Chloramphenicol,CAP)是一種廣譜抗菌藥物,對大部分細(xì)菌有抑制、殺菌作用。正因其抑菌性強(qiáng)、藥效佳,氯霉素曾在水產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用,使得養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定增益。從應(yīng)用演化成濫用,氯霉素殘留對動(dòng)物、人體都有著極大危害,至今仍威脅我國水產(chǎn)品的安全,危害著產(chǎn)業(yè)發(fā)展和群眾生命健康的同時(shí)也對我國國際地位造成影響。根據(jù)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部第250號(hào)公告[1]《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》,嚴(yán)禁氯霉素藥物在動(dòng)物源食品中使用,可見政府對違禁藥物的監(jiān)管力度大,也從側(cè)面表現(xiàn)問題的嚴(yán)峻性。2016年高裕鋒等[2]對廣東省部分地區(qū)市場銷售的150批次水產(chǎn)品進(jìn)行氯霉素殘留情況調(diào)查,調(diào)查結(jié)果顯示,氯霉素檢出率為11.33%。2019年宋安華等[3]對廣州市農(nóng)貿(mào)市場抽檢的2702批次水產(chǎn)品進(jìn)行快篩分析,分析結(jié)果得出,蝦類的氯霉素殘留不合格率達(dá)到17.39%。

        目前,最常見檢測氯霉素殘留的方法有微生物法、免疫分析法、色譜法、串聯(lián)質(zhì)譜法,以及新型技術(shù),如分子印跡法、電化學(xué)傳感器、生物芯片法、拉曼光譜等[4]。其中,免疫分析法主要包括酶聯(lián)分析法(ELISA)、膠體金免疫分析法(GICA)等。國家市場監(jiān)管總局發(fā)布的2019年第41號(hào)公告[5]《保健食品中西地那非和他達(dá)拉非的快速檢測 膠體金免疫層析法》等13項(xiàng)食品快速檢測方法里發(fā)布了《KJ201905水產(chǎn)品中氯霉素的快速檢測 膠體金免疫層析法》。膠體金免疫層析法是應(yīng)用于快速快篩方法和產(chǎn)品中最多的快檢技術(shù),其優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測時(shí)間短,適用于現(xiàn)場大批量樣品的篩查檢測。隨著國家推動(dòng)快速檢測方法,對快速檢測工作的規(guī)范管理要求也在不斷提高。李濤等[6]對于水產(chǎn)品中氯霉素快速檢測產(chǎn)品的驗(yàn)證性評價(jià)及分析中表明,通過對氯霉素快速檢測試劑盒進(jìn)行技術(shù)指標(biāo)的評價(jià),符合要求的適宜在現(xiàn)場實(shí)際監(jiān)管中推廣使用。

        膠體金免疫層析法也存在缺點(diǎn),產(chǎn)品性能方面,會(huì)出現(xiàn)假陽性、假陰性的現(xiàn)象;產(chǎn)品呈現(xiàn)效果方面,會(huì)出現(xiàn)顯色效果不佳、斷線影響結(jié)果判斷等。因此,此方法對于樣品基質(zhì)的適用性和前處理方法仍需要不斷改進(jìn)。本次實(shí)驗(yàn)是通過使用符合國家規(guī)定的快速檢測方法以及性能評價(jià)符合規(guī)范要求的快檢產(chǎn)品來完成水產(chǎn)品中氯霉素殘留的快檢實(shí)驗(yàn),在氯霉素快檢試劑盒產(chǎn)品說明書規(guī)定的操作步驟基礎(chǔ)上通過2種不同的樣品前處理方式,分別在樣品提取前、凈化后進(jìn)行改良,觀察膠體金卡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的呈現(xiàn)效果,以使基層快檢員在使用膠體金免疫層析法檢測氯霉素殘留的過程中能夠提高使用效果,對可能存在基質(zhì)干擾樣品的檢測結(jié)果判讀更有把握。

        1 材料與方法

        1.1 試劑與儀器設(shè)備

        氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(1mg·mL-1,北京曼哈格生物科技有限公司);石油醚、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甲醇(色譜純,美國霍尼韋爾B&J公司);氯霉素殘留檢測試紙條(內(nèi)含試劑及檢測卡,北京勤邦生物技術(shù)有限公司)。

        搗樣機(jī)(JYL-C020E,九陽);電子天平(AR323CN,奧豪斯儀器有限公司);旋渦混合器(MS3 basic S025,德國IKA公司);離心機(jī)(2-4,上海拖莫斯科學(xué)儀器有限公司);樣品濃縮儀(Pro-12L,南京百思威科技發(fā)展有限公司);單道手動(dòng)可調(diào)移液器(20~200μL、1~5mL,芬蘭biohit實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司);恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

        1.2 快檢試劑盒的選擇

        本實(shí)驗(yàn)所使用的快檢試劑盒氯霉素殘留檢測試紙條為廣東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布《食品快速檢測已評價(jià)產(chǎn)品目錄》中的合格快檢產(chǎn)品,產(chǎn)品標(biāo)示檢出限0.1μg·kg-1。

        1.3 2種前處理方式

        原提取和脫脂提取。

        1.4 實(shí)驗(yàn)過程

        1.4.1 樣品的選取及制備

        本次實(shí)驗(yàn)的樣品共3種,分別是牡蠣(生蠔)、鳙魚(大頭魚)、豬肉。獲取方式是在當(dāng)?shù)夭煌r(nóng)貿(mào)市場所銷售的產(chǎn)品中進(jìn)行隨機(jī)采購,采購數(shù)量要同時(shí)滿足快檢實(shí)驗(yàn)及本次實(shí)驗(yàn)需求。

        每種樣品經(jīng)過去頭、去皮、去內(nèi)臟,取可食部位約100~150g,用搗樣機(jī)均勻絞碎,絞碎后的樣品冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4.2 提取

        1.4.2.1 原提取

        稱取1.4.1制備好的樣品2.00g(±0.01g)置于15mL離心管中,加入4mL提取劑(乙酸乙酯);使用旋渦混合器渦動(dòng)2min后,4000r·min-1離心5min。

        1.4.2.2 脫脂提取

        把1.4.1制備好的樣品放置玻璃燒杯中,加入石油醚,浸沒過杯中樣品高度,使用玻璃棒讓樣品與石油醚混勻反應(yīng);開啟水浴鍋,溫度調(diào)至60℃,把石油醚與樣品混勻后的樣品燒杯放在水浴鍋孔上,讓石油醚充分揮發(fā)。

        1.4.3 濃縮

        移取3mL上層有機(jī)相至10mL離心管中,再置于50~60℃的樣品濃縮儀通過氮?dú)饬骰蚩諝饬飨麓蹈伞?/p>

        1.4.4 復(fù)溶

        向吹干的試管中依次加入0.2mL樣本復(fù)溶液(磷酸鹽緩沖液),用旋渦混合器渦動(dòng)2min充分混勻,使試管內(nèi)壁上的殘留物溶解,靜置后待測。

        1.4.5 測定

        從原包裝中取出氯霉素快速檢測試紙條,吸取75μL樣品待測液于試紙條的加樣孔中,液體流動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí),反應(yīng)10min,根據(jù)結(jié)果示意圖進(jìn)行判讀。從原包裝中取出的氯霉素快速檢測試紙條使用時(shí)應(yīng)回溫至室溫,并在1h內(nèi)使用。

        1.4.6 判讀

        通過對比試紙條的控制線(C線)和檢測線(T線)的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判讀。由于長時(shí)間放置會(huì)引起檢測線顏色的變化,需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判讀,結(jié)果判讀分3種情況。陰性(-):檢測線(T線)顏色比控制線(C線)顏色深或者檢測線(T線)顏色與控制線(C線)顏色相當(dāng),表明樣品中氯霉素含量低于方法檢測限,見圖1。陽性(+):檢測線(T線)不顯色或檢測線(T線)顏色比控制線(C線)顏色淺,表明樣品中氯霉素含量高于方法檢測限,見圖2。無效:控制線(C線)不顯色,表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效,見圖3。

        圖1 陰性結(jié)果圖 圖2 陽性結(jié)果圖 圖3 無效結(jié)果圖

        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        通過使用氯霉素快速檢測試紙條分別按照2種方法對本次3種基質(zhì)的樣品分別完成了3組(每組4份)的快速檢測實(shí)驗(yàn),添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品到各組分樣品中,添加濃度分別是0μg·kg-1、0.05μg·kg-1(0.5倍檢出水平)、0.1μg·kg-1(1.0倍檢出水平),每個(gè)濃度做2個(gè)平行樣。具體結(jié)果見表1。

        表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總

        3 結(jié)論

        3種基質(zhì)的樣品使用原提取或脫脂提取進(jìn)行前處理得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均能符合說明書的判定要求,通過添加對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)得出的陰陽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均能達(dá)到試劑盒標(biāo)示的檢測水平要求。

        原提取的樣品點(diǎn)板效果比經(jīng)過脫脂提取后的樣品點(diǎn)板效果要好,具體體現(xiàn):C/T線顏色較深,2條線對比較為明顯,易于結(jié)果判定;C/T線不易出現(xiàn)斷線情況,不容易影響結(jié)果判定;即使過了有效判定時(shí)間,結(jié)果也不會(huì)改變。

        石油醚是低沸點(diǎn)烷烴組成的非極性有機(jī)溶劑,加入樣品后可以與動(dòng)物中的脂肪酸互溶,石油醚沸點(diǎn)較低,容易揮發(fā),故可以通過加入石油醚至樣品中進(jìn)行脫脂。脫脂后的樣品再按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測,可以提高判定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

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