邱連建，王 銀，陳會(huì)朋

[北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（龍崗），廣東 518033]

鴨跖草收載于《中國藥典》一部，為鴨跖草科植物鴨跖草Commelina communisL.的干燥地上部分，夏、秋二季采收，曬干。本品甘、淡，寒，歸肺、胃、小腸經(jīng)。具有清熱瀉火，解毒，利水消腫的作用。用于感冒發(fā)熱，熱病煩渴，咽喉腫痛，水腫尿少，熱淋澀痛，癰腫疔毒［1］。鴨跖草中主要含有黃酮類、生物堿、酚酸類成分［2-8］。

其中的黃酮類成分具有一定的藥理活性，如文獻(xiàn)報(bào)道蘆丁具有抗氧化、血管舒張、抗病毒、抗急性胰腺炎等作用［9］，牡荊苷具有心腦血管保護(hù)、抗腫瘤、抗病毒、降壓、抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛等作用［10］，葒草苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、保肝等作用［11］。有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

《中國藥典》中未對(duì)其含量進(jìn)行控制，文獻(xiàn)中也有對(duì)其部分成分進(jìn)行測定報(bào)道［12-14］。本文首次采用高效液相色譜法對(duì)鴨跖草中異牡荊素、蘆丁和異葒草苷3種有效成分進(jìn)行測定，建立了HPLC法同時(shí)測定鴨跖草中的3種有效成分，為鴨跖草的質(zhì)量研究提供參考。

1 儀器與材料

1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），Welchrom C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm，上海月旭公司），BK2000超聲波清洗器（濟(jì)南巴克公司）；BD303型十萬分之一天平（德國賽多利斯公司）；甲醇、庚烷磺酸鈉與乙腈均為色譜純（天津希恩斯）。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-202012，含量以91.6%計(jì)，購自中國食品藥品檢定研究院）；異葒草苷對(duì)照品（批號(hào)111974-201401，含量以94.0%計(jì)，購自中國食品藥品檢定研究院）；異牡荊素對(duì)照品（批號(hào)20200903，含量以98.0%計(jì)，購自天津一方科技有限公司）；七批藥材的批號(hào)分別為20200922（產(chǎn)地：吉林長春）、20200928（產(chǎn)地：江西樟樹）、20201016（產(chǎn)地：安徽績溪）、20201122（產(chǎn)地：湖北襄樊）、20201212（產(chǎn)地：四川瀘縣）、20201225（產(chǎn)地：遼寧大連）、20201226（產(chǎn)地：山東臨沂）采購于安徽亳州中藥材批發(fā)市場，經(jīng)深圳市中醫(yī)院陳香玲老師鑒定為鴨跖草Commelina communisL.的干燥地上部分。

2 方法

2.1 色譜條件 所用色譜柱為Welchrom C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相A相為乙腈-甲醇（1∶1），流動(dòng)相B相為5 mmol/L庚烷磺酸鈉水溶液，進(jìn)行等度模式與梯度模式混合洗脫：0～5.0 min，85% B；5.1～25.0 min，85%→70% B；流速為0.7 ml/min；檢測波長為350 nm；柱溫45℃；進(jìn)樣量10 μl。

2.2 溶液的制備方法

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別稱取異牡荊素對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品和異葒草苷對(duì)照品適量，將甲醇作為稀釋劑，超聲溶解，定容至刻度，混合均勻，制備成含異牡荊素50 μg/ml、蘆丁20 μg/ml和異葒草苷200 μg/ml的溶液，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液1。分別稱取異牡荊素對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品和異葒草苷對(duì)照品適量，將甲醇作為稀釋劑，超聲溶解，定容至刻度，混合均勻，制備成含異牡荊素160 μg/ml、蘆丁80 μg/ml和異葒草苷320 μg/ml的溶液，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液2。取對(duì)照品儲(chǔ)備液2，精密移取1 ml，置于10 ml量瓶中，甲醇定容至刻度，混合均勻，制備成含異牡荊素16 μg/ml、蘆丁8 μg/ml和異葒草苷32 μg/ml的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取鴨跖草藥材進(jìn)行粉碎處理，稱取粉碎物約1.0 g，置100 ml燒瓶中，加入70%乙醇50 ml進(jìn)行回流提取，回流提取的時(shí)間為3 h，溶劑蒸干，放冷，加甲醇進(jìn)行溶解，定容至25 ml，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，置于2 ml進(jìn)樣小瓶中，在“2.1”色譜條件下，液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣10 μl，記錄相關(guān)的色譜圖。異牡荊素、蘆丁和異葒草苷3種成分均能夠有效分離，分離度均大于1.5，3中成分色譜峰的理論塔板數(shù)均大于5 000。色譜圖見圖2。

圖2 空白對(duì)照(A)混合對(duì)照品(B)供試品(C)HPLC圖譜

2.4線性試驗(yàn) 取對(duì)照品儲(chǔ)備液1，分別精密移取1、2、5、10、15和20 ml，置于20 ml量瓶中，以甲醇作為稀釋劑，定容至刻度，搖勻，即得不同濃度的線性溶液，分別置于2 ml進(jìn)樣小瓶中，在“2.1”色譜條件下，液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣10 μl，記錄相關(guān)的色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性試驗(yàn)，線性方程與線性范圍見表1。

表1 3種成分的線性數(shù)據(jù)

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液1份，置于2 ml進(jìn)樣小瓶中，在“2.1”色譜條件下，液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄相關(guān)的色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明，異牡荊素、蘆丁和異葒草苷3種有效成分的RSD值分別為0.44%、0.68%與0.35%，RSD均小于0.5%。試驗(yàn)結(jié)果表明本方法的精密度很好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下產(chǎn)地為吉林長春的鴨跖草（批號(hào)20200922）供試品溶液，將6份供試品溶液分別置于2 ml進(jìn)樣小瓶中，在“2.1”色譜條件下，液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣10 μl，記錄相關(guān)的色譜圖。異牡荊素、蘆丁和異葒草苷3種有效成分的RSD值分別為1.37%、1.03%與0.88%。試驗(yàn)結(jié)果表明該方法的重復(fù)性符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液1份，置于2 ml進(jìn)樣小瓶中，在不同的時(shí)間點(diǎn)（0、2、4、6、8、12、24和48 h）進(jìn)行測定，在“2.1”色譜條件下，液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣10 μl，記錄相關(guān)的色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明，異牡荊素、蘆丁和異葒草苷3種有效成分的RSD值分別為0.87%、0.63%與0.38%，RSD均小于1%。說明該供試品溶液在冷藏條件下48 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.8 回收率試驗(yàn) 取已知3種成分含量的產(chǎn)地為吉林長春的鴨跖草（批號(hào)20200922）粉碎物9份，每份約1 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下進(jìn)行供試品溶液的制備，分別制備供試品溶液，9份供試品溶液分別精密加入高、中、低3個(gè)水平的對(duì)照品溶液，每個(gè)水平3份，共9份，即得試驗(yàn)溶液。置于2 ml進(jìn)樣小瓶中，在“2.1”色譜條件下，液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣10 μl，記錄相關(guān)的色譜圖，對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行回收率計(jì)算。結(jié)果表明異牡荊素、蘆丁和異葒草苷3種有效成分的RSD值分別為1.24%、1.34%與0.80%，RSD均小于2%，回收率分別為99.47%、100.72%與100.22%。說明該方法的準(zhǔn)確度良好，見表2-4。

表2 異牡荊素回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表3 蘆丁回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表4 異葒草苷回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.9 樣品測定結(jié)果 基于前期的方法學(xué)驗(yàn)證，表明該分析方法是準(zhǔn)確的。對(duì)于不同產(chǎn)地的藥材進(jìn)行3種成分的測定。按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別置于2 ml進(jìn)樣小瓶中，在“2.1”色譜條件下，液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣10 μl，記錄相關(guān)的色譜圖，按外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明3種成分由于產(chǎn)地的不同略有差異，特別是異葒草苷的含量差異比較明顯。測定結(jié)果見表5。

表5 3種成分的測定結(jié)果

3 討論

本文建立的高效液相色譜法測定鴨跖草中3種有效成分的分析方法，通過全面的分析方法驗(yàn)證，表明該方法可以應(yīng)用于鴨跖草的質(zhì)量研究。

3.1 提取工藝優(yōu)化

3.1.1 提取溶劑 基于《中國藥典》［1］和文獻(xiàn)［12-14］，本文采取回流提取的方式，在提取溶劑的選擇上進(jìn)行了較為系統(tǒng)的考查，分別對(duì)甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇和70%乙醇進(jìn)行了考查，優(yōu)選70%乙醇作為提取溶劑。

3.1.2 提取時(shí)間 確定提取溶劑后，對(duì)回流提取的時(shí)間進(jìn)行了考查，分別考查了0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 h。當(dāng)提取時(shí)間為3 h的時(shí)候，提取效率達(dá)到最高，3種成分的含量達(dá)到最大值，當(dāng)提取時(shí)間大于3 h的時(shí)候，提取效率基本沒有變化，3種成分的含量沒有增加。

3.2 色譜條件優(yōu)化

3.2.1 流動(dòng)相種類 對(duì)于流動(dòng)相的篩選，主要基于文獻(xiàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)，分別對(duì)甲醇-水、乙腈-水、乙腈-乙酸、乙腈-磷酸、乙腈-庚烷磺酸鈉和甲醇-乙腈-庚烷磺酸鈉，優(yōu)選甲醇-乙腈-庚烷磺酸鈉體系，進(jìn)一步確定了離子對(duì)的濃度［12-14］。

3.2.2 色譜柱溫度 色譜柱溫度對(duì)于該方法有比較大的影響，溫度越高分離效果越好，鑒于溫度過高會(huì)對(duì)色譜柱造成損傷，本文優(yōu)選45℃度作為最終的柱溫，在柱子溫度為45℃時(shí)，異牡荊素與異葒草苷的分離度達(dá)到1.5以上。

3.2.3 色譜柱填料 對(duì)于不同的色譜柱填料進(jìn)行了選擇，包括苯基柱、氨基柱、C30、C8、C18等，優(yōu)選十八烷基硅烷鍵合硅膠填料，進(jìn)一步對(duì)不同廠家的色譜柱進(jìn)行篩選，最終選擇Welchrom C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），使用該類型的色譜柱，異牡荊素與異葒草苷的分離度可以達(dá)到2.0以上。