郭杰坤 方 向 彭小明 曾令國

骨髓間充質(zhì)干細胞是具有自我更新、分化和增殖能力的多功能干細胞[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化對正常生理條件下的骨發(fā)育和病理條件下的骨修復(fù)起著重要作用[2]。長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)是一種長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，在基因表達調(diào)控中起著重要作用[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs能調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化[4-5]。既往的報道表明，lncRNA-CWF19Ll與嬰兒早發(fā)性小腦共濟失調(diào)和小腦萎縮有關(guān)；發(fā)生lncRNA-CWF19L1突變的胎兒發(fā)現(xiàn)有單側(cè)六指畸形和脊椎畸形[6-8]。由此提示，lncRNA-CWF19L1可能與成骨分化相關(guān)。基于以上背景，在本研究中，我們將探討lncRNA-CWF19L1影響骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的具體機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要試劑：成骨誘導(dǎo)液(HyClone公司)；ALP、BMP2、Smad2及β-actin抗體(abcam公司)；Trizol試劑(Thermo Fisher公司)；RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher公司)；熒光定量試劑盒(Takara公司)；海腎熒光素酶載體、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega公司)；骨髓間充質(zhì)干細胞、茜紅素染色液、堿性磷酸酶檢測試劑盒(廣州賽業(yè)公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 ShRNA的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染與Smad抑制劑

ShRNAs由廣州賽哲生物科技合成。相關(guān)序列如下：

shRNA-1:

CWF19L1-shRNA-F1：GATCCGGCTTATCTGATGACCATGTTCAAGAGACATGGTCATCAGATAAGCTTTTTTG;

CWF19L1-shRNA-R1：AATTCAAAAAAGCTTATCTGA-TGACCATGTCTCTTGAACATGGTCATCAGATAAGCCG。

shRNA-2:

CWF19L1-shRNA-F2：GATCCGGTTGTTCCTATTTCT-ACATTCAAGAGATGTAGAAATAGGAACAACTTTTTTG;

CWF19L1-shRNA-R2：AATTCAAAAAAGTTGTTCCTA-TTTCTACATCTCTTGAATGTAGAAATAGGAACAACCG。

陰性對照組序列：

CWF19L1-shRNA-NC-F：GATCCGTTCTCCGAACGT-GTCACGTTCAAGAGACGTGACACGTTCGGAGAA-TTTTTTG;CWF19L1-shRNA-NC-R：AATTCAAAAAATTCTCCGAAC-GTGTCACGTCTCTTGAACGTGACACGTTCGGAGAACG。

慢病毒轉(zhuǎn)染嚴格按照制造商的說明進行。qRT-PCR檢測shRNA(lncRNA-CWF19L1-shRNA1)的轉(zhuǎn)染效率。由于MAPK抑制劑SB203580可以阻斷TGF-β/Smad通路[9]，我們選擇SB203580作為Smad2的抑制劑。

1.2.2 堿性磷酸酶活性測定

根據(jù)廠商說明，使用ALP檢測試劑盒檢測ALP活力。將骨髓間充質(zhì)干細胞接種于24孔板中，加入成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)14 d。將細胞裂解液加入到堿性磷酸酶試劑盒新鮮配制的底物中培養(yǎng)30 min，然后 NaOH停止。使用酶標儀讀數(shù)，吸光度為405 nm。經(jīng)過PBS洗滌兩次后，將收集的細胞固定10 min，在黑暗環(huán)境中使用BCIP/NBT試劑培養(yǎng)30 min后進行ALP染色。

1.2.3 茜素紅S(ARS)染色及其定量檢測

將骨髓間充質(zhì)干細胞在成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)28 d。用PBS洗滌后，70%冰酒精固定1 h。使用茜紅素染色液，37 ℃下對細胞進行染色25 min，然后用PBS清洗兩次。在光學(xué)顯微鏡拍攝細胞圖像，觀察鈣化結(jié)節(jié)并計數(shù)[10]。

1.2.4 RNA提取及實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

使用Trizol提取總細胞總RNA。然后根據(jù)試劑盒說明，使用RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。采用qRT-PCR檢測lncRNA-CWF19L1、BMP2、ALP、Runx2、smad2和β-actin的mRNA表達水平。引物序列如下：

lncRNA-CWF19L1, F: 5’-GCGGATTCGCATTCCCAATTT-3’ and R:5’-CTCCACAAGCCAAGAGGCG-3’;

BMP2,F: 5’-AGTTCTGTCCCCAGTGACGAGTTT-3’ and R: 5’-GTACAACATGGAGATTGCGCTGAG-3’; ALP, F: 5’-AGATGATGACTCTGAGCCTCCTT-3’ and R: 5’-GATGGGACAGCCTAAACTTGG-3’; Runx2, F: 5’-TTCTCCAACCCACGAATGCAC-3’ and R:5’-CAGGTACGTGTGGTAGTGAGT-3’；

Smad2, F: 5’-TCACAGTCATCATGAGCTCAAGG-3’ and R:5’-TGTGACGCATGGAAGGTCTCTC-3’；

β-actin, F: 5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3’ and R: 5’-GTACAACATGGAGATTGCGCTGAG-3’。

采集CT值，計算2-ΔΔct值，對數(shù)據(jù)進行定量分析。β-actin作為內(nèi)參。miR-132-3p的表達量采用標準Taqman MicroRNA分析法(Applied Biosystems)進行測量[11]。RNU48作為內(nèi)參。

1.2.5 蛋白免疫印跡反應(yīng)

使用RIPA裂解液在冰上對細胞進行裂解。經(jīng)過蛋白提取、蛋白濃度測定、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉等步驟后，加入一抗，在4 ℃條件下過夜孵育。然后在37 ℃下，繼續(xù)二抗體孵育2 h。使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)的相對表達。

1.2.6 雙熒光素酶反應(yīng)

按照制造商的說明進行熒光素酶報告分析。將對照組細胞和實驗組細胞接種于96孔板中，轉(zhuǎn)染2 d后收集細胞，清洗，每孔加入100 μL雙熒光素酶試劑盒中的細胞裂解液。取20 μL的細胞裂解產(chǎn)物，進行目報告基因螢火蟲熒光素酶及內(nèi)參海腎素?zé)晒馑孛笝z測，計算螢火蟲熒光素酶表達值與內(nèi)參海腎素?zé)晒馑孛副磉_值之間的比值。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，每個實驗重復(fù)3次。采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA-CWF19L1抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化

建立穩(wěn)定低表達lncRNA-CWF19L1的骨髓間充質(zhì)干細胞。圖1a所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組的lncRNA-CWF19L1顯著降低。堿性磷酸酶染色表明，低表達lncRNA-CWF19L1的骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)14 d后，形成的鈣結(jié)節(jié)增多；茜紅素染色表明，低表達lncRNA-CWF19L1的骨髓間充質(zhì)干細胞中成骨誘導(dǎo)后21 d，鈣化沉淀物顯著增加(圖1b、1c)。與對照組相比，低表達lncRNA-CWF19L1組的成骨基因BMP2和ALP的蛋白表達水平顯著上調(diào)(圖1d)。以上說明，lncRNA-CWF19L1抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。

注：a為人骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)染lncRNA-CWF19L1-shRNA后，用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染組和對照組的lncRNA-CWF19L1表達量。b為轉(zhuǎn)染組和對照組分別在人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化第21天進行茜素紅染色(ARS)和第14天進行堿性磷酸酶(ALP)染色。c為轉(zhuǎn)染組和對照組在堿性磷酸酶染色和茜素紅染色后的鈣化數(shù)定量。d為用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染組和對照組在人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)21 d后，成骨相關(guān)基因ALP和BMP2的蛋白表達量。*P<0.05和**P<0.01

2.2 lncRNA-CWF19L1調(diào)控miR-132-3p表達

為進一步探討了lncRNA-CWF19L1調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的機制，建立穩(wěn)定低表達miR-132-3p和高表達miR-132-3p的骨髓間充質(zhì)干細胞(見圖2a)。通過qRT-PCR檢測，相對于對照組，低表達lncRNA-CWF19L1的骨髓間充質(zhì)干細胞的miR-132-3p表達量顯著降低，而高表達lncRNA-CWF19L1的骨髓間充質(zhì)干細胞的miR-132-3p表達顯著升高(見圖2b)。根據(jù)生物信息學(xué)分析(見圖2c)，我們構(gòu)建野生型lncRNA-CWF19L1和突變型lncRNA-CWF19L1熒光素酶報告載體。雙熒光素酶報告結(jié)果表明，過表達miR-132-3p能顯著提高野生型lncRNA-CWF19L1轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性，而突變型lncRNA-CWF19L1的熒光素酶活性沒有變化(見圖2d)。以上結(jié)果表明lncRNA-CWF19L1直接與miR-132-3p結(jié)合，并促進其表達。

注：a為qRT-PCR檢測過表達miR-132-3p組、低表達miR-132-3p組及對照組在人骨髓間充質(zhì)干細胞的miR-132-3p表達量。b為qRT-PCR檢測過表達lncRNA-CWF19L組、低表達lncRNA-CWF19L1組及照組在人骨髓間充質(zhì)干細胞中miR-132-3p的表達量。c為熒光素酶報告載體中l(wèi)ncRNA-CWF19L1(wt，野生型)與(mut，突變型)結(jié)合位點序列。d為雙熒光素酶報告結(jié)果。*P<0.05和**P<0.01

2.3 miR-132-3p通過Smad2調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化

圖3a所示，在人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中，Smad2的表達持續(xù)增高。與對照組相比，過表達miR-132-3p能抑制Smad2的表達，而低表達miR-132-3p能提高Smad2的表達(見圖3b)。根據(jù)Targetscan預(yù)測，Smad2可能是miR-132-3p的下游靶基因(見圖3c)。我們建立野生型Smad2 和突變型Smad2 熒光素酶報告載體驗證miR-132-3p和Smad2之間的相互作用。轉(zhuǎn)染miR-132-3p過表達載體后，野生型Smad2的熒光素酶活性降低，而突變型Smad2的熒光素酶活性沒有變化(見圖3d)，以上表明miR-132-3p直接靶向Smad2并抑制其表達。此外，降低Smad2表達能降低成骨基因BMP2和ALP的蛋白表達量，而在低表達Smad2并低表達miR-132-3p的骨髓間充質(zhì)干細胞中，BMP2和ALP的蛋白表達量有所回升(見圖3e)。在茜素紅染色和ALP染色中，得到同樣的結(jié)果(見圖3f、3g)。圖3e～3g結(jié)果表明，低表達miR-132-3p能促進成骨分化，而低表達Smad2則抑制了成骨分化?？傊?，以上結(jié)果表明miR-132-3p直接靶向Smad2抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。

注：a為qRT-PCR檢測骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)過成骨誘導(dǎo)第0、2、4、6、8天Smad2的表達量。b為qRT-PCR檢測過表達miR-132-3p組、低表達miR-132-3p組及對照組的中Smad2的表達量。c為熒光素酶報告載體中Smad2(wt，野生型)與(mut，突變型)結(jié)合位點序列。d為雙熒光素酶報告結(jié)果。e為分別構(gòu)建低表達miR-132-3p組，低表達Smad2組和低表達miR-132-3p+Smad2組，分別檢測三組Smad2、BMP2、ALP的表達量。f為上述三組經(jīng)過成骨誘導(dǎo)14天后的堿性磷酸酶染色圖及經(jīng)過成骨誘導(dǎo)21 d后的茜素紅染色圖。g為上述三組的堿性磷酸酶染色和茜素紅染色后的鈣化量。*P<0.05，**P<0.01

2.4 lncRNA-CWF19L1通過miR-132-3p調(diào)控smad2抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化

分別構(gòu)建過表達miR-132-3p組，低表達lncRNA-CWF19L1組，過表達miR-132-3p+低表達lncRNA-CWF19L1組及對照組。低表達lncRNA-CWF19L1可顯著提高Smad2的蛋白和mRNA表達水平，而在低表達lncRNA-CWF19L1和過表達miR-132-3p的共同作用下，Smad2的蛋白和mRNA的表達水平有所下降(見圖4a、4b)。為了確定lncRNA-CWF19L1和miR-132-3p在調(diào)節(jié)成骨分化中的協(xié)同作用，使用qRT-PCR檢測BMP2和ALP的表達水平。如圖4c和4d所示，相對于對照組，過表達miR-132-3p能降低BMP2和ALP的表達，但在過表達miR-132-3p和低表達lncRNA-CWF19L1的共同作用下，BMP2和ALP的表達有所回升。以上結(jié)果說明，lncRNA-CWF19L1通過調(diào)控miR-132-3p，抑制smad2表達，進而抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。

注：分別構(gòu)建過表達miR-132-3p組，低表達lncRNA-CWF19L1，過表達miR-132-3p+低表達lncRNA-CWF19L1及對照組。a為用western blot檢測以上四組的Smad2蛋白表達量。b為用qRT-PCR檢測以上四組的Smad2表達水平。c、d為用qRT-PCR分別檢測上述4組的BMP2和ALP表達水平。*P<0.05

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA參與人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。例如，上調(diào)lncRNA-MEG3可促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[12]，而下調(diào)lncRNA-NONHSAT009968可抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化[4]。既往有報道顯示，lncRNA-CWF19Ll與小腦疾病、肝臟炎癥有關(guān)；胎兒的lncRNA-CWF19L1表達異常可致單側(cè)肢體六指畸形和脊椎畸形[6-8]。LncRNA-CWF19Ll可能與成骨分化相關(guān)。然而，lncRNA-CWF19L1影響人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的機制尚未確定。在本項研究中，我們通過降低骨髓間充質(zhì)干細胞中l(wèi)ncRNA-CWF19L1的表達，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨能力有所增強。由此提示，lncRNA-CWF19L1可影響骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。

已有研究表明miR-132-3p可負性調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[13-15]。在本研究中，過表達miR-132-3p可降低人骨髓間充質(zhì)干細胞Smad2、BMP2和ALP的表達量；而低表達miR-132-3p則促進了骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化，由此證明miR-132-3p是骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的負性調(diào)控因子[14]。實驗中的雙熒光素酶結(jié)果表明，lncRNA-CWF19L1與miR-132-3p直接相關(guān)，過表達miR-132-3p能提高lncRNA-CWF19L1的熒光素酶活性。同時，低表達lncRNA-CWF19L1能降低miR-132-3p的表達量。這些結(jié)果表明lncRNA-CWF19L直接與miR-132-3p結(jié)合，調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。

目前研究認為骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化受多種信號途徑調(diào)控，包括TGF-β、BMPs、Wnt、MAPK和Hedgehog等[16]；其中TGF-β通路是成骨的重要信號通路之一。Smad2作為是TGF-β信號通路的起始因子，將TGF-β從胞外傳遞到核內(nèi)，直接參與TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17-18]。目前有研究表明，Smad2作為miR-132-3p的靶基因，影響MC3T3-E1細胞成骨分化[19]；而抑制Smad2的表達能抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[20]。在當前研究中，通過TargetScan網(wǎng)站分析，Smad2作為miR-132-3p的下游靶基因，并通過雙熒光素酶實驗驗證了兩者間的靶控關(guān)系。過表達miR-132-3p能降低Smad2的表達；而抑制了miR-132-3p則增加Smad2表達。同時，低表達Smad2能降低骨髓間充質(zhì)干細胞中BMP2和ALP的表達量。鑒于我們已經(jīng)證明miR-132-3p和Smad2對人骨髓間充質(zhì)干細胞中的調(diào)節(jié)功能，我們進一步分析發(fā)現(xiàn)，低表達lncRNA-CWF19L1可降低miR-132-3p的表達，進而導(dǎo)致Smad2上調(diào)，進一步增加BMP2和ALP的表達，從而促進人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。由此，以上結(jié)果闡明了lncRNA-CWF19L1調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用機制。