謝 緯 唐明文 郭竹英 陳 生 黃俊浩 曾梓苑
特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種病因不明、慢性進(jìn)行性纖維化性間質(zhì)性肺炎,病變局限于肺臟,其肺組織學(xué)及胸部高分辨CT表現(xiàn)為以普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)為特征的一種慢性間質(zhì)性肺疾病,主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、肺泡單位結(jié)構(gòu)紊亂和肺纖維化[1]。在各種形式的間質(zhì)性肺病中,IPF作為最常見(jiàn)的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎,IPF因其獨(dú)特的不良預(yù)后和對(duì)傳統(tǒng)療法無(wú)反應(yīng)性而受到較多關(guān)注[2]。至今導(dǎo)致IPF發(fā)生的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確,對(duì)于IPF 目前尚無(wú)肯定顯著有效的治療藥物,目前治療藥物主要有糖皮質(zhì)激素、吡非尼酮、尼達(dá)尼布和N-乙酰半胱氨酸等,但療效仍不理想,且部分藥物不良反應(yīng)大。肺移植可以延長(zhǎng)具有適應(yīng)癥IPF患者的生存期,改善其生活質(zhì)量,提高其生存率,但技術(shù)要求高,供體稀缺,費(fèi)用昂貴,限制了肺移植在臨床上的實(shí)施[1]。中醫(yī)藥治療IPF有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)并展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。目前已經(jīng)有不少關(guān)于中醫(yī)藥治療肺纖維化的實(shí)驗(yàn)和臨床研究[3],但關(guān)于中藥對(duì)成纖維細(xì)胞的影響未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)前期探索應(yīng)用博來(lái)霉素建立肺纖維化小鼠模型結(jié)果的基礎(chǔ)上[4],以博來(lái)霉素(8 mg/kg)建立肺纖維化小鼠模型,觀察中藥肺纖方干預(yù)后對(duì)小鼠肺泡炎和肺纖維化程度的影響,同時(shí)擬通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法來(lái)探討不同濃度的肺纖方煎劑對(duì)細(xì)胞增殖的影響以及是否存在抑制成纖維細(xì)胞CyclinDl表達(dá)和改善MMPs/TIMPs系統(tǒng)失衡等可能,進(jìn)一步探討其可能存在的作用機(jī)制。
SPF級(jí)雄性KM小鼠,體重20~22 g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;小鼠NIH3T3細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;肺纖方煎劑(桃仁10 g、紅花10 g、當(dāng)歸10 g、生地黃10 g、牛膝10 g、川芎10 g、桔梗10 g、赤芍10 g、枳殼10 g、柴胡10 g、黃芪30 g、黨參15 g、法半夏10 g、化橘紅10 g、茯苓10 g、石菖蒲10 g、膽南星10 g、天竺黃10 g、甘草10 g組成,由深圳市中醫(yī)院提供),本院制備,劑型為濃縮袋裝煎液(為成人劑量150 毫升/袋,按1 g/mL劑量,每天2次,每次1袋,按成人60 kg體質(zhì)量計(jì)算,給藥量相當(dāng)于5 g/kg,中劑量組為原液再次濃煎成一半劑量制備,以此法再次濃縮制備高劑量中藥液);注射用鹽酸博萊霉素(上海生工;A606211);甲潑尼龍(主要成分甲潑尼龍琥珀酸鈉;Pfizer Manufacturing Belgium NV;注冊(cè)證號(hào)H20170197);羥脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)測(cè)定試劑盒;兔抗小鼠CyclinD1多克隆抗體(ab16663);兔抗小鼠MMP2多克隆抗體(ab97779);兔抗小鼠TIMP1多克隆抗體(ab38978);以上抗體購(gòu)自abcam 公司。
雄性KM小鼠60只,正常飼養(yǎng)1周后,其中取出50只小鼠,隨機(jī)分為模型組、甲潑尼龍組、肺纖方低、中、高劑量組,每組10只,使用腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后固定于操作臺(tái),以動(dòng)物喉鏡壓下小鼠舌根暴露聲門,將霧化器(針頭灌胃器)從聲門插入氣管噴入博來(lái)霉素溶液(8 mg/kg),間隔10 d后第二次給同等劑量博萊霉素造模,第二次給藥14 d(第一次給藥后24 d)后成模[3];成模后第二天(即第一次給藥第25天)將造模動(dòng)物隨機(jī)分為5組:模型組、甲潑尼龍組、肺纖方低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組各10只??瞻讓?duì)照組10只小鼠用相同的方法氣管內(nèi)霧化等容生理鹽水,25 d后給予開(kāi)始每天給予相同體積(和低劑量中藥煎劑等同)生理鹽水灌胃14 d;肺纖方低、中、高劑量組每日分別給予肺纖方高、中、低劑量(20、10、5 g/kg)q12h灌胃;模型組給予相同體積生理鹽水(和低劑量中藥煎劑等同)灌胃,qd;甲潑尼龍組給予甲潑尼龍1 mg/kg溶于相同體積生理鹽水(和低劑量中藥煎劑等同)灌胃,qd;治療14 d后上述各組小鼠于第38天后處死,留取肺臟標(biāo)本。
1.3.1 肺組織染色及肺泡炎及纖維化評(píng)價(jià)方法 常規(guī)肺病理組織標(biāo)本固定、脫水、透明、包埋、切片,分別進(jìn)行HE及Masson染色,鏡下觀察HE及Masson染色結(jié)果并照相。根據(jù)肺泡炎評(píng)價(jià)方法[5]:3級(jí):重度改變,病變范圍占全肺的50%以上,計(jì)3分;2級(jí):中度改變,病變范圍占全肺的 20%~50%,計(jì)2分;1 級(jí):輕度改變,病變范圍小于全肺的20%,計(jì)1分;0級(jí):無(wú)明顯病理改變,肺泡結(jié)構(gòu)正常,肺泡透亮,計(jì)0分。根據(jù)纖維化程度評(píng)價(jià)方法[6],纖維化程度:8級(jí):完全纖維化,計(jì)8分;7級(jí):肺泡腔充斥纖維組織,出現(xiàn)肺大皰,計(jì)7分;6級(jí):纖維灶面積大于50%,計(jì)6分;5級(jí):纖維灶面積大于10%~50%,計(jì)5分;4級(jí):纖維灶面積小于10%,計(jì)4分;3 級(jí):連續(xù)纖維區(qū)域,計(jì)3分;2級(jí):明顯纖維化出現(xiàn),計(jì)2分;1級(jí):肺泡輕微腫脹,局部輕微纖維出現(xiàn),計(jì)1分;0級(jí):正常肺,計(jì)0分。
1.3.2 小鼠肺組織羥脯氨酸(Hyp)測(cè)定 將小鼠處死后剖開(kāi)取右肺中葉組織,使用4 ℃生理鹽水進(jìn)行沖洗,濾紙吸濕后,稱取0.3 g,采用微量電動(dòng)組織勻漿器研磨,如光鏡下未見(jiàn)完整細(xì)胞后即可將其制成10%的肺組織勻漿。4 ℃環(huán)境下6 000 r/min離心5 min,提取上清液并置于-20 ℃條件下保存,用比色法測(cè)定Hyp含量。
1.3.3 小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 通過(guò)將含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在濕飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到90%時(shí)用胰蛋白酶消化,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞種于孔板中,待細(xì)胞貼壁后,分別進(jìn)行不同處理。分為對(duì)照組、肺纖方低濃度劑量組、肺纖方中濃度劑量組、肺纖方高濃度劑量組,分別給予肺纖方煎劑低濃度劑量(終濃度5 μg/mL)、中濃度劑量(終濃度10 μg/mL)、高濃度劑量(終濃度20 μg/mL),對(duì)照組在同樣條件下給予相同體積的生理鹽水進(jìn)行干預(yù),一定時(shí)間點(diǎn)后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。
1.3.4 MTS法檢測(cè)肺纖方對(duì)細(xì)胞存活力的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIH3T3細(xì)胞用胰蛋白酶消化,消化后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度以2×104接種于96孔板中,舍棄周邊孔。待細(xì)胞貼壁后,吸出培養(yǎng)基,分別換為含有低、中、高濃度的肺纖方的培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別在4、24、48、72 h每孔中加入10 μL的MTS檢測(cè)溶液。37 ℃孵育3 h,用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值(A)。R細(xì)胞存活=A加藥細(xì)胞/A對(duì)照細(xì)胞。
1.3.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 接種對(duì)數(shù)期細(xì)胞到10 cm培養(yǎng)皿,每個(gè)皿接種1×104個(gè)細(xì)胞。接種完后十字晃動(dòng)使細(xì)胞均勻分散,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)1~2周,期間觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,以免生長(zhǎng)過(guò)度。單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)增殖6代以上,其后代所組成的細(xì)胞群體,成為克隆或集落。染色:預(yù)冷的PBS洗滌兩次;甲醇固定15 min,棄去固定液;Giemsa 染色10 min;自來(lái)水沖洗,空氣干燥后計(jì)數(shù)。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。
1.3.6 Western blot法測(cè)定細(xì)胞CyclinD1、MMP2、TIMP1蛋白的表達(dá)水平 培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIH3T3細(xì)胞系于6孔板中,經(jīng)不同濃度的肺纖方煎劑干預(yù)48 h后,用細(xì)胞組織裂解液RIPA提取細(xì)胞總蛋白,行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜,5%脫脂奶粉封閉,加入CyclinD1、MMP2、TIMP1和GAPDH抗體,4 ℃過(guò)夜孵育;第二天洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗,孵育1 h;用濾紙拭去膜上過(guò)多的液體,加上發(fā)光底物均勻覆蓋在PVDF膜上,避光反應(yīng)3~5 min。Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)取像,用Scion Image軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行光密度分析。
采用SPSS 22.0版統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量數(shù)據(jù)中符合正態(tài)分布的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,通過(guò)單因素方法分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1.1 肺組織肺泡炎及肺纖維化評(píng)分比較 與對(duì)照組比較,模型組肺泡炎及肺纖維化評(píng)分顯著升高(P<0.05);與模型組比較,甲潑尼龍組和肺纖方各劑量組肺泡炎及肺纖維化評(píng)分降低(P<0.05),且隨著肺纖方劑量的升高,肺纖方各劑量組肺泡炎及肺纖維化評(píng)分逐漸降低,呈劑量依賴性(P<0.05);與甲潑尼龍組比較,肺纖方低、中劑量組肺泡炎及肺纖維化評(píng)分升高(P<0.05),肺纖方高劑量組肺泡炎及肺纖維化評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。
表1 各組小鼠肺泡炎及肺纖維化評(píng)分比較
2.1.2 HE染色 ①A1對(duì)照組:肺組織結(jié)構(gòu)正常。②A2對(duì)照組:肺泡間隔明顯增厚,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),重度纖維組織增生,可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞聚集,病變區(qū)肺泡結(jié)構(gòu)破壞紊亂,肺泡間隔變薄或斷裂。③A3甲潑尼龍組:肺泡間隔略增厚,少量纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡結(jié)構(gòu)基本正常。④A4肺纖方低劑量組:肺泡間隔明顯增厚,纖維組織增生明顯,可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞聚集,部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡間隔變薄或斷裂。⑤A5肺纖方中劑量組:肺泡間隔輕-中度增厚,輕到中度度纖維組織增生,可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞,較低劑量組減輕。⑥A6肺纖方高劑量組:肺泡間隔輕微增厚,少量纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺組織形態(tài)接近正常(見(jiàn)圖1)。
2.1.3 Masson染色 ①B1對(duì)照組:除支氣管及血管壁偶有膠原沉積外,肺泡間隔無(wú)明顯膠原纖維增生。②B2對(duì)照組:肺泡間隔中可見(jiàn)大量膠原纖維增生。③B3甲潑尼龍組:肺泡間隔中可見(jiàn)少量膠原纖維增生。④B4肺纖方低劑量組:肺泡間隔中可見(jiàn)中等量-大量膠原纖維增生。⑤B5肺纖方中劑量組:肺泡間隔中可見(jiàn)少量-中等量膠原纖維增生。⑥B6肺纖方高劑量組:肺泡間隔中可見(jiàn)少量膠原纖維增生(見(jiàn)圖2)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著肺纖方劑量的增加,小鼠Hyp含量隨之降低,但高劑量組Hyp仍明顯高于對(duì)照組(P<0.05),低劑量組Hyp含量明顯低于模型組(P<0.05)(見(jiàn)表2)。
表2 各組肺組織Hyp含量比較
MTS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:藥物干預(yù)4 h時(shí),肺纖方各劑量組細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比,差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;干預(yù)24 h及以上,肺纖方各劑量組與對(duì)照組相比,能明顯抑制細(xì)胞的存活率,且隨時(shí)間延長(zhǎng)(72 h),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但肺纖方不同濃度的抑制作用差異不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肺纖方具有抑制NIH3T3細(xì)胞的增殖能力,且呈時(shí)間依賴,但無(wú)濃度依賴性(見(jiàn)表3及圖3)。
圖3 MTS法檢測(cè)肺纖方對(duì)細(xì)胞存活率的影響
NIH3T3成纖維細(xì)胞經(jīng)1周培養(yǎng)形成類圓形細(xì)胞集落,后逐漸增大。培養(yǎng)2周結(jié)果:與對(duì)照組(C1)相比,肺纖方低劑量組(C2)、中劑量組(C3)、高劑量組(C4)NIH3T3成纖維細(xì)胞克隆數(shù)均明顯降低(P<0.05),但隨著肺纖方濃度劑量增加,細(xì)胞克隆數(shù)略有增加,證實(shí)肺纖方可抑制NIH3T3成纖維細(xì)胞的增殖能力,但各藥物濃度劑量組比較差異不明顯(P>0.05)(見(jiàn)圖4)。
圖4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果
與正常對(duì)照組相比,肺纖方各組對(duì)CyclinD1和MMP2蛋白的表達(dá)均有下調(diào),且一定范圍內(nèi)隨藥物濃度增加,CyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào)越明顯;同時(shí)肺纖方各組TIMP1蛋白的表達(dá)有所增加,但是差異不顯著;而肺纖方各組GAPDH條帶灰度比值無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖5)。
圖5 Western blot法測(cè)定細(xì)胞CyclinD1、MMP2、TIMP1蛋白的表達(dá)水平的影響
IPF是一種病因不明、以UIP為特征的一種慢性間質(zhì)性肺疾病,IPF患者從診斷開(kāi)始中位生存期僅 2~3 年[1]。在目前尚缺乏有效治療藥物情況下,中醫(yī)藥在改善患者癥狀、提高患者生活質(zhì)量、減輕患者病情等方面取得一定的療效,并開(kāi)展了大量的實(shí)驗(yàn)研究[3]。筆者2014年入選廣東省首批名中醫(yī)師承項(xiàng)目學(xué)術(shù)繼承人,跟師“龍江醫(yī)派”學(xué)術(shù)傳承人曲敬來(lái)教授,通過(guò)長(zhǎng)期跟師學(xué)習(xí),總結(jié)曲教授對(duì)肺纖維化臨床經(jīng)驗(yàn),認(rèn)為肺纖維化中醫(yī)屬“肺痹、肺痿”范疇,其基本病機(jī)為“氣虛痰結(jié)絡(luò)瘀”,為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證,臨床突出“虛、痰、瘀”等病理特點(diǎn)[7]。治療上強(qiáng)調(diào)益氣滌痰逐瘀為基本大法,結(jié)合“怪病多痰”、“百病多由痰作祟”、“久病從痰論治”、“胸中血府血瘀之證”的觀點(diǎn),以血府逐瘀湯合滌痰湯、補(bǔ)中益氣湯組成肺纖方主方,進(jìn)行辨證論治,取得一定療效。
肺纖維化是多種肺部疾病的共同結(jié)局,其特征是的成纖維細(xì)胞增殖活化和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉積,導(dǎo)致正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞[8-10]。成纖維細(xì)胞作為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成及分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、基金蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)的主要細(xì)胞,其活化、增殖以及通過(guò)釋放介質(zhì)及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起決定性作用[11]?;|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解的作用,而TIMPs可抑制MMPs活性。研究表明, MMPs與TIMPs的過(guò)度高表達(dá)以及 MMPs/TIMPs的比例失衡是纖維化發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵[12], 其中以 MMP2/TIMP1為代表。生理情況下,肺內(nèi)膠原蛋白的合成和降解處于平衡狀態(tài)。肺纖維化過(guò)程中,成纖維細(xì)胞能夠分泌MMPs,MMPs/TIMPs比例升高,其中MMP2/MMP9可降解肺泡壁ECM和基底膜中的蛋白,使更多的成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞移行侵入肺間質(zhì)并增殖,分泌更多的MMPs,MMPs可以促進(jìn)異常上皮細(xì)胞的遷移和其他異常的修復(fù)過(guò)程,而且可以增加肺水平或促纖維化介質(zhì)活動(dòng)或減少肺抗纖維化介質(zhì)水平,加重纖維化[13-14]。
在細(xì)胞增殖周期中,有兩個(gè)關(guān)鍵性限制點(diǎn)(G1/S期和G2/M期限制點(diǎn)),CyclinD1作為G1期中兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白之一[15],在細(xì)胞周期進(jìn)程中起重要的正性調(diào)節(jié)作用,CyclniD1表達(dá)增加可推動(dòng)細(xì)胞周期跨越R點(diǎn),由S期向G1期轉(zhuǎn)換,推動(dòng)細(xì)胞的有絲分裂,促進(jìn)細(xì)胞增殖[16]。有研究指出IPF患者體內(nèi)RhoA介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞CyclinD1表達(dá)增加,進(jìn)而導(dǎo)致成纖維細(xì)胞數(shù)目的增殖[17]。因此,通過(guò)針對(duì)抑制成纖維細(xì)胞病態(tài)增殖的研究對(duì)于IPF的治療有一定的研究?jī)r(jià)值。
本研究應(yīng)用前期造博萊霉素二次造模建立穩(wěn)定肺纖維化小鼠模型,給予不同劑量肺纖方煎劑干預(yù),對(duì)肺組織切片進(jìn)行肺泡炎及肺纖維化評(píng)分,并測(cè)定肺組織羥脯氨酸含量,評(píng)價(jià)肺纖方對(duì)小鼠模型肺泡炎及纖維化的影響。研究結(jié)果顯示:采用肺纖方干預(yù)的小鼠評(píng)分和羥脯氨酸含量均明顯低于模型組(P<0.05),且上述指標(biāo)值隨著肺纖方劑量的增加而降低,HE染色和Masson染色結(jié)果亦顯示采用肺纖方干預(yù)小鼠肺組織肺泡炎和纖維化程度均有明顯改善,但與強(qiáng)的松組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,結(jié)果提示肺纖方對(duì)于抑制小鼠肺纖維化程度有一定作用,且具有一定的濃度依賴性。同時(shí)本研究對(duì)小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞培養(yǎng)并進(jìn)行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和Western blot測(cè)定細(xì)胞蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,肺纖方可明顯抑制NIH3T3成纖維細(xì)胞增殖,對(duì)CyclinD1和MMP2蛋白的表達(dá)均有下調(diào),且一定范圍內(nèi)隨藥物濃度增加,CyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào)越明顯;同時(shí)提高TIMP1蛋白的表達(dá),但是各組差異不顯著;而肺纖方各組GAPDH條帶灰度比值無(wú)明顯差異。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,肺纖方能有效抑制NIH3T3細(xì)胞的增殖,對(duì)于抑制CyclinD1蛋白的表達(dá)和MMP2/TIMP1產(chǎn)生一定逆調(diào)節(jié)作用,一定程度反向調(diào)節(jié)MMP2/TIMP1比率,促進(jìn)失衡MMPs/TIMPs比例的恢復(fù)。進(jìn)一步說(shuō)明肺纖方可能參與矯正MMPs/TIMPs比例,并阻斷成纖維細(xì)胞持續(xù)遷移激活狀態(tài)的作用機(jī)制。
綜上所述,中藥復(fù)方肺纖方能夠有效抑制博來(lái)霉素致小鼠肺泡炎和肺纖維化,降低其纖維化程度;同時(shí)可抑制NIH3T3細(xì)胞的增殖和矯正失衡MMPs/TIMPs比例,提示肺纖方可能通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞持續(xù)遷移激活狀態(tài),從而改善肺纖維化,為進(jìn)一步研究中藥復(fù)方治療肺纖維化的作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。