祝俠麗，李玲華，王莎莎，王白燕，關(guān)延彬，賈永艷

(河南中醫(yī)藥大學 1.藥學院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學院，鄭州 450046)

脂質(zhì)體(liposomes，Lip)具有靶向性、良好的生物相容性和生物可降解性[1]，被認為是目前最成熟與最具前景的納米遞藥系統(tǒng)[2]。但是，如何提高脂質(zhì)體的腫瘤靶向效率，確保藥物在腫瘤細胞內(nèi)的有效濃度仍是目前研究的重點[3]。研究證明，以甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)修飾的目標化合物可通過細胞內(nèi)吞作用與細胞膜上的甘草次酸受體特異性結(jié)合進入細胞內(nèi)而發(fā)揮藥理作用[4]。腫瘤光熱治療(photothermal therapy，PTT)是在臨床上繼手術(shù)、放射治療(放療)和化學治療(化療)之后的又一具有很大潛力的腫瘤治療新手段[5]，是目前腫瘤治療領(lǐng)域研究的熱點[6]。本課題以親水性納米硫化銅(PVP/CuS)為光敏劑，GA為腫瘤靶向分子，多烯紫杉醇(DTX)為模型藥物，制備近紅外光響應(yīng)性多烯紫杉醇主動靶向脂質(zhì)體(GA-DTX-PVP/CuS-Lip)，并對其理化性質(zhì)、體外釋藥特性及抗腫瘤活性等進行研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 BSA224S-CW型天平(感量：0.1 mg，賽多利斯科學儀器有限公司)；N-1100-OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)；92-llN型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司，Nano-ZS90電位及粒度分析儀(英國Malvern公司)；JEM-1400型透射電鏡(日本電子)；MW-GX-808/3000mW型激光器(中國科學院長春激光所)；SHA-C型水浴振蕩器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；E191型細胞培養(yǎng)箱(美國Corning公司)；CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；22331 Hamburg小型臺式高速冷凍離心機(德國艾本德股份公司)；iMark BIO RAD型酶標儀(北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司)。

1.2試藥 甘草次酸(GA，含量>98%，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司，批號：405310)；多烯紫杉醇(DTX，含量>98%，上海瀚香生物科技有限公司，批號：C338774)；豆磷脂(天津市光夏精細化工研究所，批號：20180417)；膽固醇(鄭州奇華頓化工產(chǎn)品有限公司，批號：20150527)；親水性納米硫化銅(PVP/CuS，本課題組制備，批號：20180317)；甘珀酸十八醇酯(18-GA-Suc，課題組制備，批號：20190112)；RPMI-1640 培養(yǎng)基(上海索萊寶生物科技有限公司，批號：20190124)；無噬菌體胎牛血清(北京四季青生物科技有限責任公司，批號：18090506)；3-(4，5-二甲噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，美國Sigma公司，批號：298-93-1)；細胞培養(yǎng)級二甲亞砜(DMSO，北京鼎國昌盛生物科技有限公司，批號：8A800160)；甲醇、乙腈、聚山梨酯-80、超純水等均為分析純。

1.3細胞 SMMC-7721人肝癌細胞(中國科學院細胞庫)。

2 方法與結(jié)果

2.1GA-DTX-PVP/CuS-Lip的制備與表征 本實驗采用薄膜分散法制備近紅外光響應(yīng)性多烯紫杉醇主動靶向脂質(zhì)體[7]，具體步驟如下：精密稱取磷脂、膽固醇、18-GA-Suc和DTX置于250 mL茄形瓶中，加入氯仿10 mL使其全部溶解。40 ℃下旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)以除去有機溶劑，至形成均勻的薄膜。然后加入PVP/CuS的pH值7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)5 mL，超聲(功率500 W，頻率40 KHz)水合15 min，后再探頭超聲處理60 s(功率250 W，頻率25 KHz)每次超聲3 s，間歇3 s，即得近紅外光響應(yīng)性多烯紫杉醇主動靶向脂質(zhì)體。

2.2GA-DOX-PVP/CuS-Lip的表征

2.2.1分散性及形態(tài)觀察 采用透射電鏡(TEM)法觀察GA-DTX-PVP/CuS-Lip的微觀形態(tài)，具體方法如下[8]：取適量空白脂質(zhì)體、GA-DTX-PVP/CuS-Lip，加純化水探超1 min。經(jīng)稀釋10倍后，取適量滴至TEM 專用銅網(wǎng)上，用3%磷鎢酸染色2 min，自然干燥。然后置于透射電鏡下觀察，并記錄結(jié)果(圖1)。

由圖1-A可見，GA-PVP/CuS-Lip(左)和GA-DTX-PVP/CuS-Lip(右)水分散性及穩(wěn)定性良好。由圖1-B和圖1-C可見，GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/ CuS-Lip均呈圓球形結(jié)構(gòu)，大小較為均勻，平均粒徑約200 nm。

2.2.2粒徑及電位 分別取空白脂質(zhì)體GA-PVP/CuS-Lip、GA-DTX-PVP/CuS-Lip適量，用超純水稀釋后[9]，采用Nano-ZS90型電位及粒度分析儀測其粒徑和電位，結(jié)果見圖2。

由圖2A-B所知，GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip的平均粒徑分別為(114.3±0.35) nm 和(226.7±0.17)nm。由圖2A-B所知，GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip的平均Zeta電位分別為(-13.8±0.27)mV和(-4.05±0.57)mV。結(jié)果表明制備的GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip穩(wěn)定性良好。

2.2.3包封率和載藥量 采用超濾離心法測定GA-DTX-PVP/CuS-Lip的包封率，具體操作如下[10]：將GA-DTX-PVP/CuS-Lip置于超濾管(截留相對分子質(zhì)量30 000)，5000 r·min-1離心15 min，HPLC法測定濾液中游離藥物量，記為W游。高效液相色譜(HPLC)條件如下[11]，色譜柱：Venusil XBP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長：230 nm；流動相：乙腈-水(50：50)，流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。GA-DTX-PVP/CuS-Lip中總的藥量記為W總，載體GA-PVP/CuS-Lip的質(zhì)量記為W載體。按照下列公式計算包封率和載藥量：包封率(%) =[(W總-W游)/W總]×100%；載藥量 (%) =[(W總-W游)/(W總+W載體)]×100%。測定結(jié)果顯示GA-DTX-PVP/CuS-Lip的包封率和載藥量分別為(96.33±0.21)%和(6.63±0.39)%。

A.GA-PVP/CuS-Lip(左)和GA-DTX-PVP/CuS-Lip(右)的外觀照片；B.GA-PVP/CuS-Lip的透射電鏡照片；C.GA-DTX-PVP/CuS-Lip的透射電鏡照片。

圖1 不同制劑的外觀照片及透射電鏡照片(×25 000)

A.The appearance of GA-PVP/CuS-Lip (left) and GA-DTX-PVP/CuS-Lip (right)；B.TEM photo of GA-PVP/CuS-Lip；C.TEM photo of GA-DTX-PVP/CuS-Lip.

Fig.1 The appearance and TEM photos of different preparations(×25 000)

A-B.GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip 粒徑分布圖；C-D.GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip 電位分布圖。

2.3GA-DOX-PVP/CuS-Lip的光熱轉(zhuǎn)換試驗 取所制備的GA-DTX-PVP/CuS-Lip，用超純水稀釋成藥物濃度分別為0.1，0.3，0.5 mg·mL-1的溶液，分別取出3 mL置于樣品池中[12]，采用808 nm[2.50 W·(cm2)-1]的激光照射，每0.5 min記錄一次溫度。同時設(shè)純化水為空白對照組。以時間作為橫坐標，溫度作為縱坐標來繪制光熱轉(zhuǎn)換曲線，如圖3所示。

由圖3可知，與純化水比較，GA-DTX-PVP/CuS-Lip的溫度隨時間的延長而明顯上升，且濃度越大，溫度上升越快，說明GA-DTX-PVP/CuS-Lip具有濃度時間依賴性的光熱轉(zhuǎn)換特性。

2.4GA-DOX-PVP/CuS-Lip的體外釋放度試驗 采用透析法進行GA-DTX-PVP/CuS-Lip的體外釋放度試驗，具體方法如下[13]：精密量取DTX溶液或GA-DTX-PVP/CuS-Lip 1 mL，分別置于透析袋(截留相對分子質(zhì)量3000)中，進行釋放度試驗。釋放介質(zhì)為pH值7.4的PBS 50 mL(含0.5%聚山梨酯-80)，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，溫度37 ℃或45 ℃，取樣點0.5，1，2，4，6，8，12，24，48 h，取樣體積0.5 mL，每次取樣后及時補充同溫同體積的空白介質(zhì)。HPLC法測定樣品中的藥物濃度，計算累積釋放百分率，以時間為橫坐標，累積釋放百分率為縱坐標繪制釋藥曲線。

圖3 GA-DTX-PVP/CuS-Lip的光熱轉(zhuǎn)換曲線

由圖4-A可見，37 ℃條件下，DTX溶液釋藥速度較快，12 h時累積釋放百分率已達到98.56%；DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip釋藥速度較為緩慢，12 h的累積釋放百分率分別為23.63%和28.94%。表明與DTX溶液比較，DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip均具有明顯的緩釋作用。數(shù)學模型擬合結(jié)果顯示DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip 均符合 Korsmeyer-Peppas模型，相關(guān)系數(shù)r分別為0.959 1和0.992 7。

由圖4-B可見，DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip在45 ℃釋放速度高于37 ℃釋放速度。如24 h，DTX-PVP/CuS-Lip在37 ℃和45 ℃累積釋放百分率分別為33.49%和57.47%，GA-DTX-PVP/CuS-Lip在37 ℃和45 ℃累積釋放百分率分別為35.41%和51.29%。說明高溫可促進DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip中藥物的釋放?？蔀槠浣Y(jié)合近紅外光照射進行腫瘤光熱化聯(lián)合治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

2.5GA-DTX-PVP/CuS-Lip的細胞抑制率試驗 選擇SMMC-7721肝癌細胞作為細胞模型，采用MTT法測定不同濃度空白載體GA-PVP/CuS-Lip、DTX 溶液、DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip對細胞生長的影響[14]。將處于對數(shù)期的SMMC-7721細胞接種到96孔板(每孔8×103個)，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

A.37 ℃下的釋藥曲線；B.37 ℃和45 ℃下的釋藥曲線。

每孔加入50，25，10，0.5 μg·mL-1GA-PVP/CuS-Lip或100，50，20，1 μg·mL-1DTX-PVP/CuS-Lip、GA-DTX-PVP/CuS-Lip 200 μL，每個濃度設(shè)6個復孔，激光組加藥后立即用808 nm激光[2.5 W·(cm2)-1]照射3 min[15]，空白對照組加培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24，48或72 h，每孔加5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL，置搖床上振蕩10 min。然后用酶標儀在490 nm處測量吸光度(A值)。按照下列公式計算細胞存活率和細胞抑制率[16]：細胞存活率(%) =(實驗組A值/空白組A值)×100%；細胞抑制率(%) =[(實驗組A值-空白組A值)/空白組A值]×100%。

不同制劑組孵育24 h對SMMC-7721細胞生長活性的影響如圖5所示。

由圖5-A可知，隨著GA-PVP/CuS-Lip空白載體的濃度增加，SMMC-7721細胞的生存率呈降低趨勢。但是當其中PVP/CuS濃度在10 μg·mL-1以下時，對SMMC-7721細胞生長的影響較小。由圖5-B可知，GA-DTX-PVP/CuS-Lip濃度越高，對SMMC-7721細胞的生長抑制作用越強(P<0.01)，同時各濃度結(jié)合808 nm激光照射后對SMMC-7721細胞的生長抑制作用增強。

圖5 GA-PVP/CuS-Lip(A)和GA-DTX-PVP/CuS-Lip(B)孵育24 h后對SMMC-7721細胞生長的影響(n=6)

另外，DTX 溶液、DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip孵育24，48或72 h對SMMC-7721細胞生長的影響如圖6所示。

由圖6-A(24 h)和圖6-B(48 h)可知，相同濃度下，GA-DTX-PVP/CuS-Lip組SMMC-7721的細胞抑制率均高于DTX溶液(P<0.01)，表明將DTX制成GA-DTX-PVP/CuS-Lip可增加其對SMMC-7721細胞的生長抑制作用。圖6-C為DTX-PVP/ CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip孵育72 h 時的細胞抑制率，由圖6-

A.24 h；B.48 h；C.72 h。

C可見，當DTX濃度為1 μg·mL-1和20 μg·mL-1時，GA-DTX-PVP/CuS-Lip組對SMMC-7721細胞的抑制率高于DTX-PVP/CuS-Lip組(P<0.01)，表明相對于DTX-PVP/CuS-Lip普通靶向制劑，GA-DTX-PVP/CuS-Lip主動靶向制劑對SMMC-7721細胞的生長抑制作用更強。當DTX濃度為50和100 μg·mL-1時，DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip兩組的細胞抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均接近于100%。

3 討論

本實驗以親水性PVP/CuS為光敏劑，GA為腫瘤靶向分子，DTX為模型藥物，采用薄膜分散法制備了近紅外光響應(yīng)性多烯紫杉醇主動靶向脂質(zhì)體(GA-DTX-PVP/CuS-Lip)。透射電鏡下觀察到GA-DTX-PVP/CuS-Lip為類圓球形結(jié)構(gòu)，平均粒徑和電位分別為(226.73± 0.17)nm 和(-4.05±0.57)mV，包封率和載藥量分別為(96.33±0.21)%和(6.63±0.39)%，符合納米制劑設(shè)計要求。結(jié)合808 nm激光照射進行了光熱轉(zhuǎn)換實驗，結(jié)果顯示GA-DTX-PVP/CuS-Lip具有濃度時間依賴性的光熱轉(zhuǎn)換特性。

GA-DTX-PVP/CuS-Lip的體外釋放度試驗中，進行了37 ℃和45 ℃兩個溫度的釋放度試驗，分別模擬人體生理環(huán)境和結(jié)合外加熱條件下制劑的釋藥特性。實驗結(jié)果顯示，與DTX溶液比較，GA-DTX-PVP/CuS-Lip具有明顯的緩釋特征，45 ℃時釋藥速度明顯高于37 ℃釋藥速度。表明GA-DTX-PVP/CuS-Lip給藥后結(jié)合局部高溫可促進其中藥物的釋放。因DTX水溶性較差，參考文獻[17]，選擇含有0.5%聚山梨酯-80的磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)為釋放介質(zhì)。

GA-DTX-PVP/CuS-Lip的體外細胞抑制率試驗中，除進行了GA-PVP/CuS-Lip空白載體對SMMC-7721細胞毒性試驗以外，還設(shè)計進行不同實驗組不同濃度下的試驗，并作兩兩對比分析[18]。如DTX溶液組和GA-DTX-PVP/CuS-Lip制劑組，GA-DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip+激光組，DTX-PVP/CuS-Lip普通制劑組和GA-DTX-PVP/CuS-Lip 主動靶向制劑組。實驗結(jié)果顯示，與DTX溶液比較，GA-DTX-PVP/CuS-Lip具有較強的細胞抑制作用，并具有濃度和時間依賴性。結(jié)合808 nm激光照射，GA-DTX-PVP/CuS-Lip對SMMC-7721細胞的抑制率增高。綜上，本實驗制備的GA-DTX-PVP/CuS-Lip 的工藝穩(wěn)定、可行，可為進一步進行腫瘤光熱化聯(lián)合治療提供一定的理論依據(jù)。