韓美子， 姜小天， 夏婷， 張立秋， 施溯筠

(延邊大學 藥學院，吉林 延吉 133002)

0 引言

人體皮膚受到外界刺激或受到內分泌因素影響時會導致體內產生過量的黑色素，進而在皮膚表面形成色斑.研究顯示，黑色素合成的路徑主要是由酪氨酸酶催化氧化酪氨酸生成氧自由基，繼而生成黑色素；因此，抑制酪氨酸酶活性、減少氧自由基的數(shù)量可顯著減少黑色素的生成[1-2].古代方劑“三白湯”是一種經(jīng)典的美膚方劑，具有良好的美白祛斑效果[3].該方劑主要由白術、白芍、白茯苓3種藥材組成，輔藥為甘草.現(xiàn)代藥學研究表明，這4種藥材都有較好的抗氧化和抑制酪氨酸酶的功效[4-7].研究表明，人參中的熊果苷可有效抑制酪氨酸酶的活性和阻斷多巴及多巴醌的合成，因而對抑制黑色素的生成具有良好的作用[8-9].目前，在市場上還未發(fā)現(xiàn)利用上述幾種中藥復配制成的祛斑霜產品；為此，本文利用DPPH法和酪氨酸酶抑制實驗從上述5種藥材中篩選出對自由基清除率最高，且對酪氨酸酶抑制率最優(yōu)的中藥及其復配比例，并通過實驗驗證了所制備的中草藥祛斑霜的有效性和安全性.

1 藥材與試劑

白術、白芍、白茯苓、甘草，購于北京同仁堂延邊連鎖藥店有限公司(北京仟草中藥飲片有限公司)；人參購于吉林省延吉市西市場.DPPH，Sigma-Aldrich公司；酪氨酸酶、L-多巴(純度≥98%)、熊果苷，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇，沈陽市試劑三廠；甘油、卡波姆940、三乙醇胺、十八醇、硬脂酸、丙二醇、苯氧乙醇，山東優(yōu)索化工科技有限公司.

高速臺式離心機(Z-36HK)，天津市醫(yī)療器械廠；紫外-可見分光光度計(UV-2201)，日本島津公司；AP-HX七英寸控濕控溫試驗箱，東莞市愛佩試驗設備有限公司；數(shù)字皮膚水分測試儀(SK-III)，深圳凱爾電子有限公司；多功能超純水系統(tǒng)(RODI)，廈門銳思捷科學儀器有限公司.

2 實驗

2.1 5種藥材提取液的制備

取人參、白術、白芍、白茯苓、甘草各50 g，粉碎，過1.40 mm篩，加純化水500 mL；于80 ℃水浴加熱提取2次，第1次提取2 h，第2次提取1.5 h；合并2次濾液，將濾液蒸發(fā)濃縮后冷藏備用[10-11].

2.2 藥材的篩選

2.2.15種藥材的DPPH自由基清除率

配制生藥質量濃度為0.5 g/mL的5種藥材提取液(作為樣品溶液)和0.1 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液.參照鄧明玉等[12]的方法進行篩選實驗.配置反應體系S、S1、S2，各體系的溶液組分如表1所示.每個體系在室溫下避光反應30 min后在517 nm波長下測定各體系的吸光度，各體系均測定3次并取平均值.以無水乙醇作為空白對照.計算DPPH自由基清除率(R)的公式為：

表1 DPPH實驗溶液體系的配制 mL

2.2.2白芍復配人參、白術、甘草的抗氧化活性

將白芍提取液分別同人參、白術、甘草提取液按照1∶1的體積比進行混合，并將各混合液作為待測樣品.測定各混合液的吸光度，并計算各混合液的DPPH自由基清除率.

2.3 白術和白芍提取液的體外抗氧化活性

利用DPPH自由基清除實驗測定白術和白芍提取液的抗氧化活性.取白術和白芍提取液，以純化水為溶劑分別配制質量濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10、12、14、16、18、20 mg/mL的10個樣品.在517 nm波長下，測定上述不同質量濃度樣品的DPPH自由基清除率.

2.4 酪氨酸酶抑制率的測定及提取液用量的確定

稱取白術和白芍提取液各2 g，分別置于25 mL容量瓶內；加入10 mL超純水，振搖；繼續(xù)加超純水，將溶液配制成質量濃度為80 mg/mL的待測液.使用待測液時，按所需的質量濃度再對其稀釋.配制酪氨酸酶溶液及L-多巴溶液，并參考文獻[13]中的方法進行酪氨酸酶實驗.分別配置3 mL甲、乙、丙、丁反應體系，各體系的溶液組分見表2.實驗時，首先在30 ℃水浴中對各體系中的PBS溶液和L-多巴溶液進行溫育(10 min)，然后再向其中加入樣品溶液和酪氨酸酶溶液；各組分充分混合后，在475 nm波長下測定各體系的吸光度.實驗中使用0.1 mg/mL的熊果苷作為陽性對照組.計算酪氨酸酶抑制率(I)的公式為：

表2 酪氨酸酶實驗溶液體系的配制 mL

通過上述實驗篩選出白術和白芍提取液的最佳質量濃度后，分別以1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2、1∶4、4∶1的體積比進行復配，并再次測定其對酪氨酸酶的抑制率，以此確定這2種提取液的最佳復配比例.

2.5 祛斑霜的制備

將卡波姆940預先用純化水溶脹，然后加入Ⅰ相的其他物質，并于70 ℃水浴中加熱攪拌至完全溶解；將Ⅱ相于70 ℃水浴中加熱攪拌至完全溶解后，將Ⅰ相和Ⅱ相混合并攪拌至均勻(形成的為霜劑)；將所制備的祛斑霜移至實驗臺，在室溫下繼續(xù)攪拌3 min,所得即為祛斑霜基質.在祛斑霜基質中加入適量Ⅲ相(白芍和白術的提取液)攪拌，所得即為祛斑霜成品.Ⅰ相、Ⅱ相和Ⅲ相如表6所示.

2.6 祛斑霜的感官和理化性能評價

感官評價主要根據(jù)祛斑霜的外觀狀態(tài)、味道、滋潤性以及后期使用性對祛斑霜進行評價[11].理化評價主要通過檢測祛斑霜的耐熱性、耐寒性、離心穩(wěn)定性以及pH值對祛斑霜進行評價[14].將霜劑分別于(40±1)℃、-10 ℃環(huán)境下放置24 h后取出，待恢復至室溫后觀察霜劑是否出現(xiàn)分層或顆粒析出等現(xiàn)象；取適量霜劑放入離心機，以轉速3 000 r/min離心5 min，然后觀察霜劑是否出現(xiàn)油水分離等現(xiàn)象；參考文獻[15]中的方法測定霜劑的pH值.

2.7 祛斑霜保濕性能的測定

按文獻[16]中的方法，選擇8名無過敏史且無皮膚病的20～30歲的健康志愿者進行祛斑霜的保濕性能測定.測定時，將所制的祛斑霜設置為樣品組，將市售護手霜(RNW乳木果護手霜)設置為對照組，將未添加提取液的祛斑霜基質作為空白組.測試前，受試者用清水洗凈前手臂內側皮膚(保證無其他化妝品殘留)，并做好測量標記(3 cm×3 cm)，然后在溫度為(25±1)℃和相對濕度為(40±2)%的條件下靜坐30 min.樣品組、對照組和空白組隨機分布，試驗樣品量為0.1 g，區(qū)域間隔為1 cm.涂抹后立即用數(shù)字皮膚水分測試儀(SK-III)測量空白組、樣品組和對照組的皮膚含水量.每組均測定7次,每次間隔30 min.測試過程中受試者不能劇烈運動和大量飲水，同時要保持情緒穩(wěn)定.

3 實驗結果

3.1 5種藥材提取液的抗氧化活性

表3為5種藥材對DPPH自由基的清除率.由表3可以看出：在0.5 g/mL質量濃度下，白芍提取液對DPPH自由基的清除率最強(76.57%)，白茯苓對DPPH自由基的清除率最弱(32.65%).故本文選取白芍提取液分別與人參、白術、甘草3種提取液按1∶1的體積比進行復配，并通過測定其抗氧化活性篩選出復配效果最優(yōu)的組合.

表3 5種藥材提取液對DPPH自由基的清除率

3.2 復配組合藥材的抗氧化活性

復配試驗結果如表4所示.由表4可以看出，白術與白勺復配時其抗氧化活性最強(80.39%)，故本文選取白術與白勺復配用于祛斑霜的制備，并進一步分析其最佳的復配比例.

表4 復配組合對DPPH自由基的清除率

3.3 體外DPPH自由基清除率的測定

白術和白芍提取液對DPPH自由基的清除率如圖1所示.由圖1可以看出，當白術的質量濃度為10 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率達到最大值(51.63%)；當白芍的質量濃度為14 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率達到最大值(72.01%).另外，由圖1還可以看出白術和白芍提取液對DPPH自由基的清除率達到最大值后，隨著二者質量濃度的升高，二者對DPPH自由基的清除率基本保持在相對平穩(wěn)的狀態(tài)，由此表明白術和白芍提取液具有穩(wěn)定的抗氧化性.

圖1 白術和白芍提取液對DPPH自由基的清除率

3.4 白術和白芍提取液對酪氨酸酶的抑制率

表5為白術和白芍提取液對酪氨酸酶的抑制率.由表5可以看出：白術和白芍提取液對酪氨酸酶的抑制率均隨濃度的升高而增加；當白術、白芍的質量濃度分別為80 mg/mL時，其對酪氨酸酶的抑制率達到最高.本文未對超過80 mg/mL時的白術、白芍提取液進行測定，其原因是當白術、白芍提取液的質量濃度分別超過80 mg/mL時，其對霜劑的顏色有較大影響.

表5 白術、白芍提取液對酪氨酸酶的抑制率

圖2為不同體積配比的白術、白芍提取液對酪氨酸酶的抑制率.對復配后的抑制率結果總體進行單因素方差分析顯示，P<0.05，說明總體組間呈顯著性差異.對各組數(shù)據(jù)間進行單因素方差分析顯示，1∶2、2∶3、1∶4比例組間的P值和1∶1、2∶1、3∶2、4∶1比例組間的P值均大于0.05(呈非顯著性差異)，而1∶2、2∶3、1∶4與1∶1、2∶1、3∶2、4∶1比例組間的P值則小于0.05(呈顯著性差異)，由此說明不同配比的白術、白芍提取液對酪氨酸酶的抑制率具有不同影響.本文選取對酪氨酸酶抑制率最高的配比組(白術與白芍的配比為3∶2)作為霜劑的配比.

圖2 不同體積配比的白術、白芍提取液對酪氨酸酶的抑制率

3.5 白術白芍祛斑霜的制備

參考文獻[17-18]的方法并結合本文實驗結果制備祛斑霜.祛斑霜的制備配方如表6所示.

表6 祛斑霜配方

3.6 祛斑霜的感官與理化性能評價

所制祛斑霜色澤均勻，無異味，易涂抹且無顆粒感.涂抹后，膚感水潤無油膩感，無任何不良反應.穩(wěn)定性實驗結果顯示，祛斑霜膏體未出現(xiàn)水分析出和分層現(xiàn)象.pH測定顯示，祛斑霜的pH值為5.65.

3.7 保濕性能測定

受試者涂抹2種祛斑霜后其皮膚角質層水分含量隨時間的變化如圖3所示.由圖3可以看出：在涂抹后180 min內，樣品組的保濕性能總體優(yōu)于對照組(RNW乳木果護手霜)，由此表明本實驗制備的祛斑霜具有較好的保濕性能，且具有良好的保濕持久度.

圖3 皮膚角質層的水分含量隨時間的變化

4 結論

實驗表明，當以白術和白芍提取液的質量濃度均為80 mg/mL，二者的生藥量比為3∶2(體積比)進行復配組合時，其抗氧化性能和對酪氨酸酶的抑制率為最佳.經(jīng)檢測表明，本文制備的祛斑霜的感官、理化性能良好，符合中華人民共和國輕工行業(yè)標準(QB/T 2872—2017)中的相關標準，且具有較好的保濕功效.因此，本文制備的祛斑霜可作為一種良好的護膚類產品進行開發(fā)利用.