雷雨晴，張業(yè)猛，王海慶

（1. 中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001）

干旱、寒冷、高鹽和水淹等非生物脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和地理分布的重要環(huán)境脅迫因子。當(dāng)受到外界環(huán)境的脅迫時(shí)，植物會(huì)啟動(dòng)多種信號(hào)途徑，激活轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[1]。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控一系列下游靶基因的表達(dá)在植物應(yīng)對(duì)不利環(huán)境脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用[2]。植物在進(jìn)化的過(guò)程中產(chǎn)生了脫落酸(abscisic acid，ABA)、鈣離子和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3]。ABA 與植物干旱、高鹽和寒冷等脅迫密切相關(guān)，除了通過(guò)調(diào)節(jié)植物的氣孔和促進(jìn)植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來(lái)幫助植物適應(yīng)逆境脅迫外，還參與植物體內(nèi)離子濃度平衡的調(diào)節(jié)[4]。ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可通過(guò)激活下游轉(zhuǎn)錄因子參與植物逆境脅迫調(diào)控[5]。擬南芥(Arabidopsis thaliana) AtABR1轉(zhuǎn)錄因子是參與調(diào)控ABA 信號(hào)途徑的乙烯應(yīng)答因子(ethylene responsive factor，ERF)亞家族成員，Choi等[6]研究表明MAP3K16 可通過(guò)磷酸化激活A(yù)tABR1轉(zhuǎn)錄因子。

植物中抵抗逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有AP2(APETALA 2)/ERF、WRKY、MYB、NAC 和bZIP 等[7]。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子超家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，包括AP2、ERF、RAV(Related to ABI3/VP1)、DREB (dehydration-responsive element binding protein)和Soloist 亞家族。ERF 亞家族僅包含一個(gè)保守的AP2結(jié)構(gòu)域，可與下游基因啟動(dòng)子的GCC-box 結(jié)合[8]，在植物響應(yīng)病原菌侵染、高鹽、干旱、損傷、低氧和高低溫等脅迫時(shí)發(fā)揮重要調(diào)控作用[9-10]。例如，外源性內(nèi)皮素、ABA 和鈣離子可誘導(dǎo)簇毛麥(Haynaldia villosa)ERF1-V的表達(dá)，在小麥(Triticum aestivum)中過(guò)表達(dá)ERF1-V提高了小麥對(duì)白粉菌的抗性和對(duì)鹽、干旱脅迫的耐受性，表明ERF1-V通過(guò)參與生物和非生物脅迫的不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用[11]；Zhuo 等[12]從黃花苜蓿(Medicago falcata)中克隆到MfERF1基因，MfERF1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性和抗氧化活性，進(jìn)一步研究表明MfERF1可通過(guò)調(diào)節(jié)多胺轉(zhuǎn)運(yùn)、提高抗氧化酶活性和促進(jìn)脯氨酸積累來(lái)提高轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性。此外，ERF 亞家族還參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)控。例如，SmERF115是丹參(Salvia miltiorrhiza)中次級(jí)代謝產(chǎn)物酚酸生物合成的正向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，SmERF115 通過(guò)與SmRAS1基因啟動(dòng)子中的GCC-box 結(jié)合激活其表達(dá)來(lái)控制酚酸的生物合成[13]；擬南芥中的ERF 亞家族成員AtABR1 轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)創(chuàng)傷信號(hào)并誘導(dǎo)生長(zhǎng)素的合成，促進(jìn)根的再生[14]。解析ERF 轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員在植物逆境響應(yīng)中的功能，對(duì)于揭示植物適應(yīng)逆境機(jī)制和農(nóng)作物抗逆改良具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。

扁蓿豆(Medicago ruthenica)為豆科(Leguminosae)苜蓿屬矩莢苜蓿組的多年生草本植物[15]，分布于西伯利亞、蒙古國(guó)和我國(guó)北方高緯度高寒地區(qū)[16-17]。其枝葉繁茂，葉片柔軟，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，與黃花苜蓿和紫花苜蓿(Medicago sativa)相比，扁蓿豆對(duì)包括干旱、寒冷等不利環(huán)境具有更強(qiáng)的耐受性，是有望在紫花苜蓿等苜蓿屬栽培種無(wú)法越冬地區(qū)人工馴化利用的優(yōu)質(zhì)豆科牧草資源[18]。趙麗麗等[19]通過(guò)相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)活力指數(shù)和半致死滲透脅迫強(qiáng)度3 個(gè)指標(biāo)對(duì)扁蓿豆和黃花苜蓿進(jìn)行抗旱性鑒定，結(jié)果表明在種子萌發(fā)期4 份扁蓿豆種質(zhì)材料的抗旱性均強(qiáng)于黃花苜蓿；于潔等[20]利用復(fù)鹽溶液模擬鹽脅迫對(duì)10 份不同地區(qū)的野生紫花苜蓿和扁蓿豆材料進(jìn)行耐鹽性綜合評(píng)價(jià)，通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)分析法和加權(quán)隸屬函數(shù)法等分析表明，扁蓿豆萌發(fā)期的耐鹽性較紫花苜蓿強(qiáng)。

目前對(duì)扁蓿豆的抗逆性研究多集中在形態(tài)解剖、生長(zhǎng)發(fā)育以及生理生化水平[21-22]，在分子水平上解釋扁蓿豆適應(yīng)極端逆境的機(jī)制，發(fā)掘逆境適應(yīng)相關(guān)基因，對(duì)于苜蓿屬栽培種的抗逆改良具有重要的參考價(jià)值。過(guò)去10 年中，高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和檢測(cè)成本的不斷下降，為分離和分析非模式植物中逆境相關(guān)基因的功能提供了方便。本研究根據(jù)此前低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果，在對(duì)青藏扁蓿豆中的一個(gè)編碼AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子基因MrERF1轉(zhuǎn)錄激活活性和亞細(xì)胞定位分析的基礎(chǔ)上，對(duì)其在多種非生物脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。所獲得的結(jié)果為今后鑒定該基因在非生物脅迫下的功能提供了信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

扁蓿豆種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所孫啟忠研究員提供。將種子用98%濃硫酸處理8 min，無(wú)菌水沖洗多次去除殘余的硫酸后，置于鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿上于4 ℃暗處理24 h，而后轉(zhuǎn)移到21 ℃、16 h光照/8 h 黑暗條件下萌發(fā)。3 d 后將發(fā)芽種子移栽于蛭石 ∶ 營(yíng)養(yǎng)土(3 ∶ 1)的混合基質(zhì)中培養(yǎng)。生長(zhǎng)3 周后對(duì)幼苗進(jìn)行非生物脅迫和脫落酸處理。將幼苗置于4 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗條件的培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理；將整株幼苗洗凈后，轉(zhuǎn)移到鋪有多層吸透200 mmol·L-1NaCl 溶液的吸水紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行高鹽脅迫處理；脫落酸處理將整株幼苗轉(zhuǎn)移到鋪有多層吸水紙的培養(yǎng)皿中，用含有0.05% Tween20 (V/V)的50 μmol·L-1脫落酸溶液噴霧后，封蓋以防植株脫水；干旱處理將整株幼苗轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，在室溫條件下進(jìn)行自然脫水；水淹處理將整株幼苗轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中并淹沒(méi)于水中；對(duì)照組將整株幼苗轉(zhuǎn)移到鋪有多層吸水紙的培養(yǎng)皿中。上述處理在不同時(shí)間分別對(duì)整株幼苗、幼苗地上部分和根進(jìn)行取樣，液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。此外，將處于開(kāi)花期的扁蓿豆植株于4 ℃處理8 h 后，收集根、莖、葉、頂芽和花序樣品，用于不同器官中的基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)。

1.2 MrERF1 基因cDNA 克隆與序列分析

總RNA 提取使用TRIzol 試劑進(jìn)行，提取的總RNA按照說(shuō)明利用Recombinant DNase I (TaKaRa，大連)處理去除基因組DNA，cDNA 第一鏈的合成按照M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(生工，上海)的說(shuō)明操作。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期扁蓿豆低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)正向引物MrERF-F(5′-TGAAGAGGGACAAG AACTATCG-3′)和反向引物MrERF-R(5′-AATCA TAACGGAAGTAGGGACC-3′)，以4 ℃處理8 h 幼苗的cDNA 為模板，使用PyrobestDNA 聚合酶(TaKaRa，大連)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后，連接到pBluescript Ⅱ SK+/-載體進(jìn)行測(cè)序。

利用DNAMAN8.0 軟件分析核酸序列、編碼的氨基酸序列以及開(kāi)放閱讀框；通過(guò)NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行蛋白序列相似性檢索，利用網(wǎng)址(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)查找保守結(jié)構(gòu)域；利用WoLF PSORT網(wǎng)站(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)進(jìn)行核定位信號(hào)預(yù)測(cè)[23]；ExPASy 的ProtParam 程序(http://web.expasy.org/protparam/)用于對(duì)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析；通過(guò)SignalP5.0 Server 網(wǎng)站 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預(yù)測(cè)該蛋白是否有信號(hào)肽；在擬南芥網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org)進(jìn)行MrERF1保守結(jié)構(gòu)域序列的相似性檢索；通過(guò)MEGA7.0 軟件中Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)各個(gè)節(jié)點(diǎn)的檢驗(yàn)使用自舉法(Bootstrapping)，程序重復(fù)1 000 次，其他參數(shù)默認(rèn)。

1.3 轉(zhuǎn)錄激活活性驗(yàn)證

根據(jù)已測(cè)序的MrERF1cDNA 序列設(shè)計(jì)含EcoRⅠ位點(diǎn)的正向引物ERF1 (5′-GAATTCGGATCCATG CCATTGCCAATGATGTT-3′)和反向引物ERF2 (5′-GAATTCGAGCTCTCACCCTGAGGGAGAGGAG CT-3′)，擴(kuò)增MrERF1基因編碼區(qū)。擴(kuò)增的片段測(cè)序確認(rèn)后用EcoR Ⅰ酶切，將酶切后的片段插入到經(jīng)EcoR Ⅰ酶切后并使用熱敏磷酸酶(NEB，北京)處理的pGBKT7 (BD Biosciences，美國(guó))酵母表達(dá)載體內(nèi)，轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)，挑選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，酶切鑒定后，獲得重組的酵母表達(dá)載體pGBKT7-MrERF1。

通過(guò)PEG/LiAc 法[24]將pGBKT7-MrERF1 轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母AH109 感受態(tài)細(xì)胞(Clontech，美國(guó))，同時(shí)轉(zhuǎn)化pGBKT7 空質(zhì)粒為陰性對(duì)照，涂布在SD/-Trp固體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)3 d 后挑取單菌落重懸于100 μL滅菌ddH2O 中，分別取2 μL 重懸液點(diǎn)在SD/-Trp 及含X-α-gal (Solarbio，北京)的SD/-His 固體培養(yǎng)基上，根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況及是否變藍(lán)來(lái)驗(yàn)證MrERF1的轉(zhuǎn)錄激活活性。

1.4 亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)已測(cè)序的MrERF1cDNA 序列設(shè)計(jì)含BamHⅠ位點(diǎn)的正向引物MrERF1 (5′-GAATTCGGATCC ATGCCATTGCCAATGATGTTT-3′)和含KpnⅠ位點(diǎn)的反向引物MrERF2 (5′-GAATTCGGTACCTGAG GGAGAGGAGCTATATC-3′)，擴(kuò)增MrERF1基因編碼區(qū)。擴(kuò)增的片段測(cè)序確認(rèn)后用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切，將酶切后的片段插入到經(jīng)BamHⅠ/KpnⅠ雙酶切的PBI121-EGFP 載體內(nèi)，轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)，挑選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，酶切鑒定后，獲得重組表達(dá)載體35S∶∶MrERF1∶EGFP。

將構(gòu)建好的35S∶∶MrERF1∶EGFP 重組載體及35S∶∶EGFP 陰性對(duì)照載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽(yáng)性單克隆菌落于含50 μg·mL-1Kan 和25 μg·mL-1Gent 的LB 液體培養(yǎng)基中28 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6。離心收集菌體，用0.5 mol·L-1的2-N-嗎啡乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid,MES) (pH = 5.7)、1 mol·L-1的MgCl2和100 mmol·L-1的乙酰丁香酮(pH = 5.7)配制的溶液重懸菌體使重懸液OD600為0.5。用無(wú)針頭注射器吸取重懸液于葉背面注入生長(zhǎng)3 周的本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉片內(nèi)，在黑暗條件下培養(yǎng)3 d 后于熒光顯微鏡下觀察葉片細(xì)胞中熒光的分布。

1.5 MrERF1 基因的表達(dá)分析

在不同非生物脅迫和ABA 處理下分別用整株扁蓿豆幼苗、幼苗的地上部分和根為樣品分析MrERF1的表達(dá)。將材料中所述樣品合成cDNA，稀釋至100 ng·μL-1為模板，用TaqDNA 聚合酶(TaKaRa，大連)進(jìn)行半定量RT-PCR，反應(yīng)體系20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。MrERF1基因的上游引物和下游引物分別為MrERF-F (5′-TGAAGAGGGACAAGAACTAT CG-3′)和MrERF-R (5′-AATCATAACGGAAGTAG GGACC-3′)，Actin基因的上游引物和下游引物分別為MrActin-F (5′-TGCTTCTAACTGAGGCTCCAC T-3′)和MrActin-R (5′-AAAGGACTTCTGGGCAA CG-3′)。反應(yīng)完成后使用濃度為0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MrERF1 基因的克隆和生物信息學(xué)分析

根據(jù)已有的扁蓿豆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)方法從低溫處理8 h 的扁蓿豆幼苗中擴(kuò)增得到約1 200 bp 的特異片段，將其命名為MrERF1(GenBank 登錄號(hào)：MW600721)。測(cè)序結(jié)果顯示該cDNA 長(zhǎng)1 225 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?48 bp，編碼316 個(gè)氨基酸。MrERF1 的氨基酸序列在NCBI 網(wǎng)站上查詢，發(fā)現(xiàn)MrERF1 含有1 個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域(圖1A)，具有ERF 轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員的特性，與蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、大豆(Glycine max)、紅車軸草(Trifolium pratense)、鷹嘴豆(Cicer arietinum)等豆科植物ERF 家族成員高度同源；對(duì)MrERF1 的核定位序列預(yù)測(cè)表明，在78～81位(KRRR)、141～147 位(PKRKYRG)存在核定位信號(hào)(圖1A)；用DNAMAN8.0 軟件進(jìn)行的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示(圖1A)，比對(duì)的序列均含有一個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域，其中與蒺藜苜蓿同源蛋白的相似性達(dá)91%。采用ProtParam 工具預(yù)測(cè)MrERF1 蛋白的分子量為35.05 kDa、理論等電點(diǎn)為6.45，其中陰性氨基酸(Asp + Glu) 30 個(gè)、陽(yáng)性氨基酸(Arg + Lys) 28 個(gè)，總平均親水性-0.81，屬于親水性蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，MrERF1 不含信號(hào)肽。

用MEGA7.0 對(duì)豆科同源ERF 蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1B)，表明MrERF1 與蒺藜苜蓿ERF 蛋白的親緣關(guān)系最近。在擬南芥網(wǎng)站對(duì)MrERF1保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列相似性檢索，用MEGA7.0 對(duì)擬南芥同源蛋白的AP2 保守結(jié)構(gòu)域序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1C)，表明MrERF1 與擬南芥中AtABR1同源性最高。

圖1 MrERF1 序列分析Figure 1 Sequence analysis of MrERF1

2.2 MrERF1 轉(zhuǎn)錄激活活性分析

將轉(zhuǎn)pGBKT7-MrERF1 質(zhì)粒和pGBKT7 質(zhì)粒的酵母菌液分別點(diǎn)在SD/-Trp 和含X-α-gal 的SD/-His固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 后，酵母生長(zhǎng)情況如圖2 所示。在SD/-Trp 固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的兩個(gè)酵母均能夠正常生長(zhǎng)；在含X-α-gal 的SD/-His 固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)pGBKT7 質(zhì)粒的酵母不能正常生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)pGBKT7-MrERF1 質(zhì)粒的酵母能夠正常生長(zhǎng)并且變藍(lán)。

圖2 MrERF1 轉(zhuǎn)錄激活活性驗(yàn)證Figure 2 Validation of MrERF1 transcriptionalactivation activity

2.3 MrERF1 蛋白的亞細(xì)胞定位

本氏煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示(圖3)，35S 驅(qū)動(dòng)下的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP) (35S∶∶EGFP)的熒光信號(hào)分布于整個(gè)葉片細(xì)胞中，而MrERF1 與EGFP 的融合蛋白(35S∶∶MrERF1∶EGFP)其熒光信號(hào)分布于葉片細(xì)胞核上。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，MrERF1 轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核。

圖3 MrERF1 的亞細(xì)胞定位Figure 3 Subcellular localization of MrERF1

2.4 MrERF1 表達(dá)模式分析

2.4.1MrERF1在不同組織中及光周期下的表達(dá)

此前轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)MrERF1受到低溫誘導(dǎo)表達(dá)，為了揭示不同組織中MrERF1的表達(dá)情況，以4 ℃處理8 h 的扁蓿豆各組織為樣品進(jìn)行半定量RT-PCR 分析。結(jié)果顯示(圖4A)，MrERF1不在根中表達(dá)，在莖、葉、芽和花序中均有表達(dá)。由于植株地上部分易受到光刺激，為了探究MrERF1的表達(dá)是否受光周期或者生物節(jié)律的影響，對(duì)室溫下正常生長(zhǎng)的扁蓿豆植株地上部分組織進(jìn)行半定量RT-PCR分析。結(jié)果表明(圖4B)，MrERF1的表達(dá)不受光周期或生物節(jié)律的調(diào)節(jié)。

圖4 MrERF1 基因在各組織中及光周期下的表達(dá)Figure 4 Expression of MrERF1 in various tissues and photoperiod

2.4.2MrERF1在不同非生物脅迫和ABA 處理下的表達(dá)

為了進(jìn)一步探討不同非生物脅迫和ABA 處理對(duì)MrERF1表達(dá)的影響，對(duì)低溫、高鹽、干旱、水淹和ABA 處理以及對(duì)照組的整株扁蓿豆幼苗進(jìn)行半定量RT-PCR 分析。結(jié)果顯示(圖5A)，除對(duì)照組外MrERF1的表達(dá)均受到了誘導(dǎo)，并且其表達(dá)均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)；在ABA、水淹、高鹽、干旱和低溫處理后MrERF1受到誘導(dǎo)開(kāi)始表達(dá)的時(shí)間分別為0.5、0.5、1、1、8 h。

此外，之前的研究結(jié)果表明，在低溫處理下MrERF1不在根中表達(dá)，因此對(duì)扁蓿豆幼苗進(jìn)行除低溫外的ABA、高鹽、干旱和水淹處理后，分別以幼苗的根和地上部分為樣品對(duì)MrERF1轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖5B)，不同處理下MrERF1在扁蓿豆幼苗的地上部分表達(dá)，不在根中表達(dá)。

圖5 MrERF1 基因在不同非生物脅迫和ABA 處理下的表達(dá)Figure 5 Transcription response of MrERF1 gene to abiotic stress and ABA treatment

3 討論與結(jié)論

本研究從低溫處理8 h 的扁蓿豆中克隆到了MrERF1基因，對(duì)其編碼的蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果表明其含有一個(gè)保守的AP2 結(jié)構(gòu)域，屬于ERF 亞家族。與擬南芥中同源ERF 蛋白的AP2結(jié)構(gòu)域構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，MrERF1 與擬南芥中AtABR1 同源性最高。在酵母中的研究結(jié)果表明，報(bào)告基因HIS和LacZ的轉(zhuǎn)錄被激活，MrERF1 與擬南芥AtABR1[25]相同且具有轉(zhuǎn)錄激活活性，而其激活活性序列在N 端或C 端有待進(jìn)一步研究。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明MrERF1 屬于核定位蛋白，與AtABR1蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致[26]，具有典型的轉(zhuǎn)錄因子特性。

MrERF1的組織特異性表達(dá)分析結(jié)果與AtABR1不同。MrERF1不在根中表達(dá)，在莖、葉、芽和花序中均有表達(dá)且不受光周期或生物節(jié)律的調(diào)節(jié)；而AtABR1在擬南芥所有器官中均表達(dá)，在角果和種子中的表達(dá)量非常低[27]。張文慧等[28]對(duì)白樺(Betula platyphylla)bERF1/2/3的3 個(gè)基因研究表明，在高鹽脅迫下，bERF1基因在根、莖、葉中的表達(dá)均呈下調(diào)趨勢(shì)；bERF2的表達(dá)在葉中呈上調(diào)趨勢(shì)、根中呈下調(diào)趨勢(shì)而在莖中無(wú)明顯變化；bERF3的表達(dá)在莖和葉中呈上調(diào)趨勢(shì)，在根中無(wú)明顯變化。這表明，盡管這些基因均屬于ERF 亞家族成員，但在不同植物組織中的表達(dá)模式存在差異，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著不同的功能。

擬南芥AtABR1 蛋白最初被Pandey 等[27]報(bào)道為ABA 信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子，在擬南芥中AtABR1蛋白是與MrERF1 同源性最高的ERF 蛋白。本研究表明在ABA、脫水、高鹽和低溫處理下，MrERF1的表達(dá)均受到了誘導(dǎo)，這與Pandey 等[27]對(duì)相同處理下AtABR1表達(dá)的研究結(jié)果一致，表明MrERF1 蛋白與AtABR1 蛋白可能具有同源功能。最近B?umler等[29]研究表明AtABR1還受到水淹誘導(dǎo)表達(dá)。與Pandey 等[27]研究結(jié)果不同的是，B?umler 等[29]認(rèn)為AtABR1不參與ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并且與干旱脅迫響應(yīng)無(wú)關(guān)，而是幼苗從花盆中取出時(shí)受到損傷誘導(dǎo)其表達(dá)，因此本研究在對(duì)扁蓿豆進(jìn)行處理時(shí)使用整株幼苗且輕柔操作避免幼苗受到損傷脅迫，高鹽和ABA處理的幼苗避免受到水淹脅迫。半定量RT-PCR 結(jié)果顯示，對(duì)照組中MrERF1的表達(dá)沒(méi)有受到誘導(dǎo)，這表明不同處理下MrERF1的表達(dá)沒(méi)有受到損傷誘導(dǎo)的影響，因此推測(cè)MrERF1基因參與了依賴于ABA 的逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這更傾向于Pandey 等[27]的研究結(jié)果。水淹是一種復(fù)合脅迫，除了會(huì)引發(fā)低氧脅迫外還可能引起植物營(yíng)養(yǎng)缺乏、機(jī)械脅迫和增加感染風(fēng)險(xiǎn)等[30]。當(dāng)植物遭受水淹時(shí)會(huì)迅速積累高水平的植物激素乙烯引發(fā)進(jìn)一步的信號(hào)級(jí)聯(lián)[31]，因此還可對(duì)扁蓿豆進(jìn)行乙烯、茉莉酸甲酯和水楊酸等處理進(jìn)一步分析MrERF1的表達(dá)。

綜上所述，本研究克隆了扁蓿豆ERF 轉(zhuǎn)錄因子基因MrERF1，開(kāi)放閱讀框?yàn)?48bp，編碼316 個(gè)氨基酸。MrERF1編碼的蛋白定位于細(xì)胞核且具有轉(zhuǎn)錄激活活性。半定量RT-PCR 結(jié)果表明MrERF1的轉(zhuǎn)錄與光周期和生物節(jié)律無(wú)關(guān)且存在組織特異性表達(dá)；MrERF1受到高鹽、干旱、水淹、低溫和脫落酸的誘導(dǎo)表達(dá)。盡管MrERF1在扁蓿豆的發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用仍未知，但可以推測(cè)MrERF1在調(diào)節(jié)扁蓿豆抵抗干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫中行使了一定的功能。本研究為MrERF1轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步揭示扁蓿豆非生物脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制，對(duì)扁蓿豆抗逆種質(zhì)資源的進(jìn)一步應(yīng)用及苜蓿屬牧草的抗逆育種具有重要意義。