孔瀟，彭欣，李媛媛,，吳毅，王藝穎，簡(jiǎn)鼎，張光莉，羅征秀*

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科，重慶 400014

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，Sp)是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染最常見(jiàn)的細(xì)菌病原體，感染后可急劇增加肺部細(xì)菌數(shù)量，促使大量白細(xì)胞流入肺部，引起彌漫性肺泡上皮細(xì)胞損傷[1]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，新生兒攜帶和(或)感染肺炎鏈球菌后，5歲內(nèi)發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[2-3]。但LaCanna等[4]研究發(fā)現(xiàn)，成年期小鼠患肺炎鏈球菌肺炎(Streptococcus pneumoniaepneumonia，S.pp)，肺組織在感染后2周恢復(fù)正常，對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘的發(fā)生無(wú)明顯影響。S.pp后肺組織是否完全恢復(fù)不僅依賴(lài)于病原微生物是否被徹底清除，也依賴(lài)于受損肺組織是否完全再生修復(fù)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新生期S.pp可導(dǎo)致成年期氣道上皮完整性缺失，主要表現(xiàn)為上皮E鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白(ZO-1)表達(dá)降低[5]，因此推測(cè)肺泡上皮可能已經(jīng)發(fā)生了損傷。新生期肺炎鏈球菌感染促進(jìn)哮喘發(fā)生是否與感染后肺組織結(jié)構(gòu)及功能異常有關(guān)目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究探討了新生期S.pp對(duì)肺組織結(jié)構(gòu)、上皮源性細(xì)胞因子表達(dá)水平及氣道反應(yīng)性的影響，以及新生期S.pp與哮喘發(fā)生的關(guān)系，以期為改善兒童S.pp的遠(yuǎn)期預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 只清潔級(jí)B A L B/c 孕鼠(約2 8 ～3 2 g)購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(渝)2018-0003]，飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣的消毒飼養(yǎng)盒中。飼養(yǎng)條件：恒溫25 ℃，濕度50%～65%，光照12 h/d，飼料及飲水充足且均經(jīng)過(guò)消毒處理。自購(gòu)買(mǎi)后開(kāi)始觀察并準(zhǔn)確記錄孕鼠的生產(chǎn)時(shí)間。所有實(shí)驗(yàn)操作均于超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合單位和國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。

1.2 菌株 肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株(D39)由重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。取1 ml標(biāo)準(zhǔn)株接種至THY培養(yǎng)基中，在5%CO2、37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期(6～8 h)，與50%甘油按7:3混勻后，以1 ml/支分裝儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

1.3 新生期非致死性S.pp模型的建立 方法參考本課題組前期研究并適當(dāng)改進(jìn)[6]。將出生后第7天的50只BALB/c小鼠隨機(jī)分為S.pp組與對(duì)照組，每組25只，分別給予鼻腔滴注5 μl共計(jì)2×107cfu肺炎鏈球菌或等量PBS。建立模型后監(jiān)測(cè)各組小鼠生命體征，以及是否出現(xiàn)安靜少動(dòng)、體重不增、脫毛等感染表現(xiàn)，感染第2天從S.pp組小鼠中通過(guò)簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法抽取3只小鼠，取全肺進(jìn)行細(xì)菌載量檢測(cè)，有且僅有肺炎鏈球菌生長(zhǎng)提示建模成功[6]，所有實(shí)驗(yàn)操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

1.4 標(biāo)本收集 兩組于建模后3周(幼年期)、5周(成年期)各取8只小鼠麻醉處死，摘取眼球放盡血液，仰臥位固定頭部及四肢，暴露胸腔，眼科鉗夾閉左肺門(mén)，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，氣管插管后用PBS洗5次，取BALF 1.2 ml，2500 r/min離心5 min，取上清液保存于-80 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。打開(kāi)胸腔，暴露心臟和肺部，剪開(kāi)左心室，將25號(hào)針頭插入右心室以PBS沖洗直至肺部顏色變?yōu)榉奂t色或白色。取出右肺，儲(chǔ)存于-80 冰箱，將完整的左肺浸入4%多聚甲醛中，4 ℃下固定48 h，乙醇脫水后包埋在石蠟中，用于后續(xù)肺組織病理檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞因子檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)成年期小鼠BALF上清液IL-25、IL-33及胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)水平，實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。IL-25、IL-33及TLSP試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)公司。

1.6 HE染色觀察肺組織炎癥情況及肺泡結(jié)構(gòu) 選取S.pp組及對(duì)照組小鼠各8個(gè)左肺組織進(jìn)行石蠟包埋，肺組織連續(xù)切為4 μm的石蠟切片，將石蠟切片脫蠟至水，每只小鼠隨機(jī)選取3張組織切片進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取上、中、下、左、右5個(gè)視野(×200)，觀察肺泡周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)情況及肺泡結(jié)構(gòu)。炎癥嚴(yán)重程度按以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量分析[7]：0分，正常；1分，少數(shù)炎性細(xì)胞；2分，炎性細(xì)胞成環(huán)，厚度為1個(gè)細(xì)胞層；3分，炎性細(xì)胞成環(huán)，厚度為2～4個(gè)細(xì)胞層；4分，炎性細(xì)胞環(huán)＞4個(gè)細(xì)胞層。采用軟件Image-Pro? 6.0測(cè)量輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(radial alveolar count，RAC：指從細(xì)支氣管到其最近胸膜所連接直線(xiàn)穿過(guò)的肺泡數(shù))、平均肺泡直徑(mean alveolar diameter，MAD：在每個(gè)視野下隨機(jī)取6個(gè)肺泡，測(cè)量每個(gè)肺泡直徑，最后取平均值)、平均肺泡截距(mean linear intercept，MLI：參考Dunnil[8]的方法，以視野正中為中心劃“+”交叉線(xiàn)，計(jì)數(shù)經(jīng)此交叉線(xiàn)的肺泡隔數(shù)NS，測(cè)出“+”字線(xiàn)總長(zhǎng)度L，以公式MLI=L/NS計(jì)算平均肺泡截距，用于估計(jì)單個(gè)肺泡大小的平均直徑)以及平均肺泡間隔厚度(在每個(gè)視野下隨機(jī)選取6個(gè)肺泡，測(cè)量每個(gè)肺泡四周4個(gè)點(diǎn)的肺泡間隔厚度，取平均值)。

1.7 Masson染色檢測(cè)肺泡周?chē)z原纖維沉積水平

分別從兩組中各選取3個(gè)肺組織進(jìn)行Masson染色，檢測(cè)肺泡周?chē)z原纖維沉積水平。在200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用圖像分析軟件Image-Pro?6.0測(cè)定藍(lán)染色區(qū)域(為膠原纖維沉積)，取5個(gè)視野平均值[9]。

1.8 小鼠肺功能檢測(cè) 采用EMKA動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)成年期(6周)小鼠肺阻力，在小鼠意識(shí)清醒、自主呼吸正常的狀態(tài)下，使用梯度乙酰甲膽堿(0、3.125、6.25、12.5、25及50 mg/ml)霧化給藥，其中0 mg/ml為生理鹽水霧化吸入以測(cè)量氣道反應(yīng)性基線(xiàn)，通過(guò)生物記錄儀檢測(cè)小鼠呼吸氣流及壓力變化。每霧化3 min后休息2 min，連續(xù)記錄5 min，取平均值，得到小鼠通氣肺阻力值(lung resistance，LR)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prim 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；肺阻力指標(biāo)分析采用雙因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 新生期S.pp對(duì)小鼠肺泡結(jié)構(gòu)的影響 HE染色結(jié)果顯示，S.pp組小鼠發(fā)育至幼年期(3周)，RAC較對(duì)照組明顯減少[(8.00±1.10)個(gè)vs. (3.53±0.35)個(gè)，P=0.018]，MLI、MAD及肺泡間隔厚度較對(duì)照組明顯增加[分別為88.99±5.55vs. 127.10±9.54，P=0.042；(167±8.85) μmvs. (193.40±5.14) μm，P=0.042；(2.38±0.18) μmvs. (3.28±0.13) μm，P=0.002]。S.pp組小鼠發(fā)育至成年期(5周)，RAC較對(duì)照組明顯減少[(13.73±2.49)個(gè)vs. (4.02±0.21)個(gè)，P=0.018]，MLI和肺泡間隔厚度較對(duì)照組明顯增加[分別為74.45±4.84vs. 131.30±17.86，P=0.020；(3.41±0.60) μmvs. (5.78±0.75) μm，P=0.0 2 3]，兩組間M A D 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(155.50±6.39) μmvs. (173.70±14.62) μm，P=0.317](圖1)。

圖1 新生期肺炎鏈球菌肺炎后3周及5周小鼠肺泡結(jié)構(gòu)(HE ×200，n=6)Fig.1 Alveolar structure of mice 3 and 5 weeks post neonatal Streptococcus pneumoniae pneumonia (HE ×200, n=6)

2.2 新生期S.pp對(duì)小鼠肺泡周?chē)z原纖維沉積的影響 Masson染色結(jié)果顯示，新生期S.pp組小鼠發(fā)育至幼年期肺泡周?chē)z原纖維沉積(即藍(lán)染區(qū)域面積)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.04±0.01) mm2vs. (0.07±0.01) mm2，P=0.077]，但是發(fā)育至成年期肺泡周?chē)z原纖維沉積較對(duì)照組小鼠明顯增多[(0.01±0.01) mm2vs. (0.44±0.01) mm2，P<0.0001]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 新生期肺炎鏈球菌肺炎后3周及5周小鼠肺泡周?chē)z原纖維沉積情況比較(Masson ×200，n=3)Fig.2 The collagen fiber deposition around alveoli of mice 3, 5 weeks post neonatal Streptococcus pneumoniae pneumonia(Masson ×200, n=3)

2.3 新生期S.pp對(duì)小鼠肺泡周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)的影響 HE染色結(jié)果顯示，新生期S.pp組小鼠幼年期及成年期肺泡周?chē)仔约?xì)胞評(píng)分較對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[分別為(0.72±0.12)分vs. (1.68±0.24)分，P=0.002；(0.67±0.23)分vs.(1.88±0.30)分，P=0.006，圖3]。

圖3 新生期肺炎鏈球菌肺炎后3周及5周小鼠肺泡周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)情況比較(HE ×200，n=5)Fig.3 Infiltration of inflammatory cells around alveoli of mice 3, 5 weeks post neonatal Streptococcus pneumoniae pneumonia(HE ×200, n=5)

2.4 新生期S.pp對(duì)成年期小鼠BALF中IL-25、IL-33、TSLP表達(dá)水平的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，S.pp組小鼠發(fā)育至成年期，BALF中IL-25、IL-33、TSLP水平較對(duì)照組明顯升高[分別為(36.16±2.80) pg/mlvs.(45.16±1.74) pg/ml，P=0.024；(52.06±1.70) pg/mlvs.(61.42±1.50) pg/ml，P=0.004；(13.32±0.74) pg/mlvs.(16.71±0.54) pg/ml，P=0.007]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 新生期S.pp對(duì)成年期小鼠氣道阻力的影響采用無(wú)創(chuàng)肺功能儀分析新生期S.pp對(duì)成年期小鼠氣道阻力的影響，結(jié)果顯示，乙酰甲膽堿濃度≤6.25 mg/ml時(shí)兩組肺阻力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)乙酰甲膽堿濃度達(dá)12.5 mg/ml時(shí)，新生期S.pp組小鼠氣道阻力較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖4)。

圖4 新生期肺炎鏈球菌肺炎對(duì)成年期小鼠氣道阻力的影響(n=5)Fig.4 Effect of neonatal Streptococcus pneumoniae pneumonia on the airway resistance of adulthood mice (n=5)

3 討 論

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，新生期肺炎鏈球菌感染后發(fā)生持續(xù)性喘息或哮喘的風(fēng)險(xiǎn)增加[10]，而臨床研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者更易發(fā)生S.pp，可能與上皮損傷導(dǎo)致肺炎鏈球菌清除率降低有關(guān)[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新生期肺炎鏈球菌感染可促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性哮喘的發(fā)生[12]。肺泡是肺部氣體交換的主要部位，具有結(jié)構(gòu)支撐、氣體交換、分泌等多種功能。肺部細(xì)菌數(shù)量急劇增加導(dǎo)致中性粒細(xì)胞大量流入肺泡，中性粒細(xì)胞通過(guò)分泌中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)殺傷細(xì)菌的同時(shí)，也對(duì)肺泡上皮細(xì)胞造成損傷[13-14]。新生期S.pp促進(jìn)哮喘發(fā)生是否與肺炎后受損肺組織未完全修復(fù)導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)及功能異常有關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新生期肺炎鏈球菌感染可導(dǎo)致成年期肺組織上皮連接蛋白E-cadherin、ZO-1等表達(dá)降低[5]，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了新生期S.pp對(duì)肺泡上皮完整性和結(jié)構(gòu)的影響。

RAC是評(píng)估肺泡化程度的重要指標(biāo)[15]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肺泡化主要發(fā)生于出生至2歲期間，但在隨后8年內(nèi)仍持續(xù)增加；小鼠肺泡化在出生后5～30 d完成[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，新生期S.pp感染小鼠發(fā)育至幼年期及成年期時(shí)RAC均較對(duì)照組明顯減少，提示新生期S.pp可致小鼠肺泡化降低。MAD及MLI可反映氣體在肺泡中自由活動(dòng)的空間大小[18]。有研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)慢性炎癥可導(dǎo)致MLI增加[19]，本研究結(jié)果顯示，新生期S.pp致幼年期MAD及MLI較對(duì)照組明顯增大，提示早期感染可致肺泡壁斷裂融合，從而使空腔增大、肺泡密度降低，導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)異常。肺泡間隔厚度影響氣體交換速率，本研究發(fā)現(xiàn)新生期感染S.pp小鼠發(fā)育至幼年期及成年期時(shí)肺泡間隔明顯增厚，提示新生期肺炎鏈球菌感染可影響氣體交換速率。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型肺泡上皮增生及間質(zhì)纖維化均可導(dǎo)致肺泡間隔增厚[20]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新生期患S.pp可致氣道周?chē)z原纖維沉積增多[5]，本研究進(jìn)一步對(duì)肺泡周?chē)z原纖維沉積進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)新生期S.pp可致成年期肺泡周?chē)z原纖維沉積明顯增多，提示新生期S.pp可致肺泡間質(zhì)膠原纖維沉積、肺泡間隔厚度增加，從而使氣道阻力增高。

Th1/Th2免疫失衡是支氣管哮喘的主要發(fā)病機(jī)制。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新生期S.pp可誘導(dǎo)Th1/Th2免疫失衡[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-25、IL-33、TLSP可增強(qiáng)Ⅱ型免疫反應(yīng)[23]，促進(jìn)炎癥反應(yīng)、黏液產(chǎn)生及肺重塑[24]；肺泡上皮受損后分泌的細(xì)胞因子IL-25、IL-33、TSLP是促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分泌膠原纖維的重要介質(zhì)[25-27]；Wang等[28]對(duì)IL-25、IL-33、TLSP與炎性細(xì)胞進(jìn)行共定位研究證實(shí)，IL-25、IL-33、TLSP在促進(jìn)氣道炎癥浸潤(rùn)中起關(guān)鍵作用。其中，IL-25可直接通過(guò)介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞活化而導(dǎo)致膠原纖維沉積增多[27]；IL-33為IL-1細(xì)胞因子家族成員，可通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積及肺纖維化發(fā)展[29]；TSLP為IL-7類(lèi)細(xì)胞因子，可通過(guò)肺泡巨噬細(xì)胞促進(jìn)膠原纖維沉積[26]，且臨床研究顯示TSLP抑制劑可減輕過(guò)敏性哮喘的氣道高反應(yīng)性，證實(shí)了TSLP在肺功能中的關(guān)鍵作用[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，新生期S.pp小鼠發(fā)育至成年期時(shí)BALF中IL-25、IL-33、TLSP均明顯升高，提示新生期S.pp可促進(jìn)上皮源性細(xì)胞因子IL-25、IL-33、TLSP的產(chǎn)生及肺泡周?chē)z原纖維的沉積，且可能通過(guò)增強(qiáng)Th2型免疫應(yīng)答促進(jìn)哮喘的發(fā)生。

綜上所述，新生期S.pp可致肺組織不完全修復(fù)，誘導(dǎo)肺組織結(jié)構(gòu)及功能異常，促進(jìn)氣道高反應(yīng)性形成，可能是哮喘發(fā)病的潛在危險(xiǎn)因素。