孔瀟，彭欣，李媛媛,，吳毅，王藝穎，簡鼎，張光莉，羅征秀*

1重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒科研究所/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014；2重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院呼吸科，重慶 400014

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，Sp)是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染最常見的細菌病原體，感染后可急劇增加肺部細菌數(shù)量，促使大量白細胞流入肺部，引起彌漫性肺泡上皮細胞損傷[1]。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，新生兒攜帶和(或)感染肺炎鏈球菌后，5歲內(nèi)發(fā)生哮喘的風險明顯增高[2-3]。但LaCanna等[4]研究發(fā)現(xiàn)，成年期小鼠患肺炎鏈球菌肺炎(Streptococcus pneumoniaepneumonia，S.pp)，肺組織在感染后2周恢復(fù)正常，對實驗性哮喘的發(fā)生無明顯影響。S.pp后肺組織是否完全恢復(fù)不僅依賴于病原微生物是否被徹底清除，也依賴于受損肺組織是否完全再生修復(fù)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新生期S.pp可導致成年期氣道上皮完整性缺失，主要表現(xiàn)為上皮E鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白(ZO-1)表達降低[5]，因此推測肺泡上皮可能已經(jīng)發(fā)生了損傷。新生期肺炎鏈球菌感染促進哮喘發(fā)生是否與感染后肺組織結(jié)構(gòu)及功能異常有關(guān)目前尚未見報道。因此，本研究探討了新生期S.pp對肺組織結(jié)構(gòu)、上皮源性細胞因子表達水平及氣道反應(yīng)性的影響，以及新生期S.pp與哮喘發(fā)生的關(guān)系，以期為改善兒童S.pp的遠期預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8 只清潔級B A L B/c 孕鼠(約2 8 ～3 2 g)購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心[SYXK(渝)2018-0003]，飼養(yǎng)于獨立通氣的消毒飼養(yǎng)盒中。飼養(yǎng)條件：恒溫25 ℃，濕度50%～65%，光照12 h/d，飼料及飲水充足且均經(jīng)過消毒處理。自購買后開始觀察并準確記錄孕鼠的生產(chǎn)時間。所有實驗操作均于超凈工作臺內(nèi)進行。實驗過程符合單位和國家有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定。

1.2 菌株 肺炎鏈球菌標準株(D39)由重慶醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗、臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室惠贈。取1 ml標準株接種至THY培養(yǎng)基中，在5%CO2、37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)，待生長至對數(shù)期(6～8 h)，與50%甘油按7:3混勻后，以1 ml/支分裝儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.3 新生期非致死性S.pp模型的建立 方法參考本課題組前期研究并適當改進[6]。將出生后第7天的50只BALB/c小鼠隨機分為S.pp組與對照組，每組25只，分別給予鼻腔滴注5 μl共計2×107cfu肺炎鏈球菌或等量PBS。建立模型后監(jiān)測各組小鼠生命體征，以及是否出現(xiàn)安靜少動、體重不增、脫毛等感染表現(xiàn)，感染第2天從S.pp組小鼠中通過簡單隨機抽樣法抽取3只小鼠，取全肺進行細菌載量檢測，有且僅有肺炎鏈球菌生長提示建模成功[6]，所有實驗操作均在超凈工作臺內(nèi)進行。

1.4 標本收集 兩組于建模后3周(幼年期)、5周(成年期)各取8只小鼠麻醉處死，摘取眼球放盡血液，仰臥位固定頭部及四肢，暴露胸腔，眼科鉗夾閉左肺門，進行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，氣管插管后用PBS洗5次，取BALF 1.2 ml，2500 r/min離心5 min，取上清液保存于-80 ℃用于后續(xù)實驗。打開胸腔，暴露心臟和肺部，剪開左心室，將25號針頭插入右心室以PBS沖洗直至肺部顏色變?yōu)榉奂t色或白色。取出右肺，儲存于-80 冰箱，將完整的左肺浸入4%多聚甲醛中，4 ℃下固定48 h，乙醇脫水后包埋在石蠟中，用于后續(xù)肺組織病理檢測。

1.5 細胞因子檢測 采用ELISA法檢測成年期小鼠BALF上清液IL-25、IL-33及胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)水平，實驗步驟按說明書進行。IL-25、IL-33及TLSP試劑盒購自上海生工生物技術(shù)公司。

1.6 HE染色觀察肺組織炎癥情況及肺泡結(jié)構(gòu) 選取S.pp組及對照組小鼠各8個左肺組織進行石蠟包埋，肺組織連續(xù)切為4 μm的石蠟切片，將石蠟切片脫蠟至水，每只小鼠隨機選取3張組織切片進行HE染色。光學顯微鏡下，每張切片隨機選取上、中、下、左、右5個視野(×200)，觀察肺泡周圍炎性細胞浸潤情況及肺泡結(jié)構(gòu)。炎癥嚴重程度按以下評分標準進行半定量分析[7]：0分，正常；1分，少數(shù)炎性細胞；2分，炎性細胞成環(huán)，厚度為1個細胞層；3分，炎性細胞成環(huán)，厚度為2～4個細胞層；4分，炎性細胞環(huán)＞4個細胞層。采用軟件Image-Pro? 6.0測量輻射狀肺泡計數(shù)(radial alveolar count，RAC：指從細支氣管到其最近胸膜所連接直線穿過的肺泡數(shù))、平均肺泡直徑(mean alveolar diameter，MAD：在每個視野下隨機取6個肺泡，測量每個肺泡直徑，最后取平均值)、平均肺泡截距(mean linear intercept，MLI：參考Dunnil[8]的方法，以視野正中為中心劃“+”交叉線，計數(shù)經(jīng)此交叉線的肺泡隔數(shù)NS，測出“+”字線總長度L，以公式MLI=L/NS計算平均肺泡截距，用于估計單個肺泡大小的平均直徑)以及平均肺泡間隔厚度(在每個視野下隨機選取6個肺泡，測量每個肺泡四周4個點的肺泡間隔厚度，取平均值)。

1.7 Masson染色檢測肺泡周圍膠原纖維沉積水平

分別從兩組中各選取3個肺組織進行Masson染色，檢測肺泡周圍膠原纖維沉積水平。在200倍鏡下隨機選取5個視野，采用圖像分析軟件Image-Pro?6.0測定藍染色區(qū)域(為膠原纖維沉積)，取5個視野平均值[9]。

1.8 小鼠肺功能檢測 采用EMKA動物肺功能檢測系統(tǒng)檢測成年期(6周)小鼠肺阻力，在小鼠意識清醒、自主呼吸正常的狀態(tài)下，使用梯度乙酰甲膽堿(0、3.125、6.25、12.5、25及50 mg/ml)霧化給藥，其中0 mg/ml為生理鹽水霧化吸入以測量氣道反應(yīng)性基線，通過生物記錄儀檢測小鼠呼吸氣流及壓力變化。每霧化3 min后休息2 min，連續(xù)記錄5 min，取平均值，得到小鼠通氣肺阻力值(lung resistance，LR)。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prim 7.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布，以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；肺阻力指標分析采用雙因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 新生期S.pp對小鼠肺泡結(jié)構(gòu)的影響 HE染色結(jié)果顯示，S.pp組小鼠發(fā)育至幼年期(3周)，RAC較對照組明顯減少[(8.00±1.10)個vs. (3.53±0.35)個，P=0.018]，MLI、MAD及肺泡間隔厚度較對照組明顯增加[分別為88.99±5.55vs. 127.10±9.54，P=0.042；(167±8.85) μmvs. (193.40±5.14) μm，P=0.042；(2.38±0.18) μmvs. (3.28±0.13) μm，P=0.002]。S.pp組小鼠發(fā)育至成年期(5周)，RAC較對照組明顯減少[(13.73±2.49)個vs. (4.02±0.21)個，P=0.018]，MLI和肺泡間隔厚度較對照組明顯增加[分別為74.45±4.84vs. 131.30±17.86，P=0.020；(3.41±0.60) μmvs. (5.78±0.75) μm，P=0.0 2 3]，兩組間M A D 差異無統(tǒng)計學意義[(155.50±6.39) μmvs. (173.70±14.62) μm，P=0.317](圖1)。

圖1 新生期肺炎鏈球菌肺炎后3周及5周小鼠肺泡結(jié)構(gòu)(HE ×200，n=6)Fig.1 Alveolar structure of mice 3 and 5 weeks post neonatal Streptococcus pneumoniae pneumonia (HE ×200, n=6)

2.2 新生期S.pp對小鼠肺泡周圍膠原纖維沉積的影響 Masson染色結(jié)果顯示，新生期S.pp組小鼠發(fā)育至幼年期肺泡周圍膠原纖維沉積(即藍染區(qū)域面積)與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義[(0.04±0.01) mm2vs. (0.07±0.01) mm2，P=0.077]，但是發(fā)育至成年期肺泡周圍膠原纖維沉積較對照組小鼠明顯增多[(0.01±0.01) mm2vs. (0.44±0.01) mm2，P<0.0001]，差異有統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖2 新生期肺炎鏈球菌肺炎后3周及5周小鼠肺泡周圍膠原纖維沉積情況比較(Masson ×200，n=3)Fig.2 The collagen fiber deposition around alveoli of mice 3, 5 weeks post neonatal Streptococcus pneumoniae pneumonia(Masson ×200, n=3)

2.3 新生期S.pp對小鼠肺泡周圍炎性細胞浸潤的影響 HE染色結(jié)果顯示，新生期S.pp組小鼠幼年期及成年期肺泡周圍炎性細胞評分較對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義[分別為(0.72±0.12)分vs. (1.68±0.24)分，P=0.002；(0.67±0.23)分vs.(1.88±0.30)分，P=0.006，圖3]。

圖3 新生期肺炎鏈球菌肺炎后3周及5周小鼠肺泡周圍炎性細胞浸潤情況比較(HE ×200，n=5)Fig.3 Infiltration of inflammatory cells around alveoli of mice 3, 5 weeks post neonatal Streptococcus pneumoniae pneumonia(HE ×200, n=5)

2.4 新生期S.pp對成年期小鼠BALF中IL-25、IL-33、TSLP表達水平的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，S.pp組小鼠發(fā)育至成年期，BALF中IL-25、IL-33、TSLP水平較對照組明顯升高[分別為(36.16±2.80) pg/mlvs.(45.16±1.74) pg/ml，P=0.024；(52.06±1.70) pg/mlvs.(61.42±1.50) pg/ml，P=0.004；(13.32±0.74) pg/mlvs.(16.71±0.54) pg/ml，P=0.007]，差異有統(tǒng)計學意義。

2.5 新生期S.pp對成年期小鼠氣道阻力的影響采用無創(chuàng)肺功能儀分析新生期S.pp對成年期小鼠氣道阻力的影響，結(jié)果顯示，乙酰甲膽堿濃度≤6.25 mg/ml時兩組肺阻力差異無統(tǒng)計學意義，當乙酰甲膽堿濃度達12.5 mg/ml時，新生期S.pp組小鼠氣道阻力較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖4)。

圖4 新生期肺炎鏈球菌肺炎對成年期小鼠氣道阻力的影響(n=5)Fig.4 Effect of neonatal Streptococcus pneumoniae pneumonia on the airway resistance of adulthood mice (n=5)

3 討 論

流行病學研究發(fā)現(xiàn)，新生期肺炎鏈球菌感染后發(fā)生持續(xù)性喘息或哮喘的風險增加[10]，而臨床研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者更易發(fā)生S.pp，可能與上皮損傷導致肺炎鏈球菌清除率降低有關(guān)[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新生期肺炎鏈球菌感染可促進實驗性哮喘的發(fā)生[12]。肺泡是肺部氣體交換的主要部位，具有結(jié)構(gòu)支撐、氣體交換、分泌等多種功能。肺部細菌數(shù)量急劇增加導致中性粒細胞大量流入肺泡，中性粒細胞通過分泌中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和髓過氧化物酶(MPO)殺傷細菌的同時，也對肺泡上皮細胞造成損傷[13-14]。新生期S.pp促進哮喘發(fā)生是否與肺炎后受損肺組織未完全修復(fù)導致肺組織結(jié)構(gòu)及功能異常有關(guān)尚未見報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新生期肺炎鏈球菌感染可導致成年期肺組織上皮連接蛋白E-cadherin、ZO-1等表達降低[5]，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進一步探討了新生期S.pp對肺泡上皮完整性和結(jié)構(gòu)的影響。

RAC是評估肺泡化程度的重要指標[15]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肺泡化主要發(fā)生于出生至2歲期間，但在隨后8年內(nèi)仍持續(xù)增加；小鼠肺泡化在出生后5～30 d完成[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，新生期S.pp感染小鼠發(fā)育至幼年期及成年期時RAC均較對照組明顯減少，提示新生期S.pp可致小鼠肺泡化降低。MAD及MLI可反映氣體在肺泡中自由活動的空間大小[18]。有研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)慢性炎癥可導致MLI增加[19]，本研究結(jié)果顯示，新生期S.pp致幼年期MAD及MLI較對照組明顯增大，提示早期感染可致肺泡壁斷裂融合，從而使空腔增大、肺泡密度降低，導致肺泡結(jié)構(gòu)異常。肺泡間隔厚度影響氣體交換速率，本研究發(fā)現(xiàn)新生期感染S.pp小鼠發(fā)育至幼年期及成年期時肺泡間隔明顯增厚，提示新生期肺炎鏈球菌感染可影響氣體交換速率。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型肺泡上皮增生及間質(zhì)纖維化均可導致肺泡間隔增厚[20]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新生期患S.pp可致氣道周圍膠原纖維沉積增多[5]，本研究進一步對肺泡周圍膠原纖維沉積進行定量分析，發(fā)現(xiàn)新生期S.pp可致成年期肺泡周圍膠原纖維沉積明顯增多，提示新生期S.pp可致肺泡間質(zhì)膠原纖維沉積、肺泡間隔厚度增加，從而使氣道阻力增高。

Th1/Th2免疫失衡是支氣管哮喘的主要發(fā)病機制。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新生期S.pp可誘導Th1/Th2免疫失衡[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-25、IL-33、TLSP可增強Ⅱ型免疫反應(yīng)[23]，促進炎癥反應(yīng)、黏液產(chǎn)生及肺重塑[24]；肺泡上皮受損后分泌的細胞因子IL-25、IL-33、TSLP是促進成纖維細胞增殖分泌膠原纖維的重要介質(zhì)[25-27]；Wang等[28]對IL-25、IL-33、TLSP與炎性細胞進行共定位研究證實，IL-25、IL-33、TLSP在促進氣道炎癥浸潤中起關(guān)鍵作用。其中，IL-25可直接通過介導肺泡上皮細胞及成纖維細胞活化而導致膠原纖維沉積增多[27]；IL-33為IL-1細胞因子家族成員，可通過基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)促進細胞外基質(zhì)蛋白沉積及肺纖維化發(fā)展[29]；TSLP為IL-7類細胞因子，可通過肺泡巨噬細胞促進膠原纖維沉積[26]，且臨床研究顯示TSLP抑制劑可減輕過敏性哮喘的氣道高反應(yīng)性，證實了TSLP在肺功能中的關(guān)鍵作用[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，新生期S.pp小鼠發(fā)育至成年期時BALF中IL-25、IL-33、TLSP均明顯升高，提示新生期S.pp可促進上皮源性細胞因子IL-25、IL-33、TLSP的產(chǎn)生及肺泡周圍膠原纖維的沉積，且可能通過增強Th2型免疫應(yīng)答促進哮喘的發(fā)生。

綜上所述，新生期S.pp可致肺組織不完全修復(fù)，誘導肺組織結(jié)構(gòu)及功能異常，促進氣道高反應(yīng)性形成，可能是哮喘發(fā)病的潛在危險因素。