湯月良，鄧冠群

廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院普通外科，廣州 511300

全球最新的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年我國結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)新發(fā)病例達(dá)56萬，位居第2位，死亡29萬例，位居第5位[1]。奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)是CRC常用的化療藥物[2]，主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性CRC和輔助治療原發(fā)腫瘤完全切除的Ⅲ期(Duke's C期)結(jié)腸癌患者[3-4]。雖然L-OHP在CRC的臨床治療中起著重要作用，但其化療效果不佳。腫瘤細(xì)胞對L-OHP的敏感性下降致使大部分CRC患者化療后很快出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，是造成化療失敗的重要原因之一，因此，增強(qiáng)CRC細(xì)胞對L-OHP的敏感性是提高CRC化療成功率的關(guān)鍵。伊維菌素(ivermectin，Ive)屬于阿維菌素類，是日本Kitasato研究所發(fā)現(xiàn)的一組16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物。Ive為新型抗寄生蟲藥，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、獸醫(yī)和水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)，具有高效、廣譜、低毒等藥理學(xué)特點(diǎn)[5-6]。近年來有研究報(bào)道，Ive具有抗腫瘤的作用，如可降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧率和最大耗氧率，從而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖[7]；可通過氧化應(yīng)激和DNA損傷而抑制腎癌細(xì)胞的生長[8]；可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞和慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞對阿霉素和長春新堿的耐藥性[9]。此外，還可抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[10]。由此可見，Ive在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及耐藥等方面起著重要作用，但目前其是否可增強(qiáng)L-OHP抗結(jié)腸癌的作用尚不清楚。本研究建立了結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞模型，在體內(nèi)外探討Ive增強(qiáng)L-OHP抗結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的作用及其機(jī)制，以期為改善L-OHP耐藥結(jié)腸癌患者的預(yù)后提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶、青-鏈霉素雙抗、胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT試劑盒、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；Ive、L-OHP、結(jié)晶紫、脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；PXR慢病毒購自上海漢恒生物科技有限公司；抗核因子κB p65(nuclear factor kappa-B p65，NF-κB p65)、抗孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)、抗P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)及GAPDH兔抗體購自英國Abcam公司；兔抗IgG重鏈和輕鏈抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。微光分光光度計(jì)購自美國Merinton公司；Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)和ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；ACCURI C6流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；Tecan Infinite Pro全波長多功能酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動物 結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。20只雄性BALB/c裸鼠(體重18～20 g)購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0005]，SP F 級環(huán)境下飼養(yǎng)，溫度2 0 ～2 5 ℃，相對濕度40%～70%，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究通過廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審核(DW2019-004)，實(shí)驗(yàn)過程符合國家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物的管理和使用規(guī)定。

1.3 HCT116/L-OHP細(xì)胞的建立及培養(yǎng) 結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合度為60%時用胰酶消化傳代。

取對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞，向培養(yǎng)液中加入4 μmol/L L-OHP溶液，48 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)正常生長后傳代，重復(fù)用4 μmol/L L-OHP處理48 h，L-OHP濃度每20 d增加1 μmol/L，反復(fù)誘導(dǎo)直至L-OHP的濃度遞增至15 μmol/L，最終獲得結(jié)腸癌HCT116 L-OHP耐藥細(xì)胞株(HCT116/L-OHP)，并培養(yǎng)于含4 μmol/L L-OHP、10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中[11-12]。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞活力 將HCT116/L-OHP細(xì)胞接種于96孔板中(5.0×103個/孔)，聯(lián)合給予終濃度為25 μmol/L的L-OHP以及1、2、4、8 μmol/L的Ive，并設(shè)置L-OHP 25 μmol/L組和空白對照組(等體積的培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；終止培養(yǎng)前4 h加入10 μl MTT(5 mg/ml)工作液，繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，采用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD/空白對照組OD×100%。根據(jù)MTT檢測結(jié)果和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力 將HCT116/L-OHP細(xì)胞接種于6孔板中(1.0×103個/孔)，聯(lián)合給予終濃度為25 μmol/L的L-OHP以及2、4 μmol/L的Ive，并設(shè)置L-OHP 25 μmol/L組和空白對照組(加入等體積的培養(yǎng)液)，14 d后終止培養(yǎng)，棄上清，PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min，0.1%結(jié)晶紫染色液染色20 min，計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和周期變化

1.6.1 細(xì)胞凋亡 將HCT116/L-OHP細(xì)胞接種于6孔板中(2×105個/孔)，聯(lián)合給予終濃度為25 μmol/L的L-OHP和2、4 μmol/L的Ive，并設(shè)置L-OHP 25 μmol/L組和空白對照組(加入等體積的培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，分別加入FITC-Annexin V和PI，室溫避光孵育5 min，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6.2 細(xì)胞周期 將HCT116/L-OHP細(xì)胞接種于6孔板中(2×105個/孔)，聯(lián)合給予終濃度為25 μmol/L的L-OHP和2、4 μmol/L的Ive，并設(shè)置L-OHP 25 μmol/L組和空白對照組(加入等體積的培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，用250 μl預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，加入750 μl預(yù)冷的無水乙醇中，-20 ℃下固定過夜；PBS洗滌，加入RNase A及PI染色，4 ℃下避光孵育30 min，上機(jī)檢測細(xì)胞周期分布情況。

1.7 Western blotting檢測P-gp、NF-κB p65和PXR蛋白的表達(dá)水平

1.7.1 HCT116/L-OHP細(xì)胞收集 將HCT116/L-OHP細(xì)胞接種于6孔板中(2×105個/孔)，聯(lián)合給予終濃度為25 μmol/L的L-OHP和2、4 μmol/L的Ive，并設(shè)置L-OHP組和空白對照組(加入等體積的培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。

1.7.2 LPS誘導(dǎo)建立NF-κB高表達(dá)的HCT116/L-OHP細(xì)胞 取對數(shù)生長期HCT116/L-OHP細(xì)胞，接種于6孔板中(1.0×105個/孔)，待細(xì)胞貼壁后，用10 μg/ml LPS刺激6 h，聯(lián)合給予終濃度為25 μmol/L的L-OHP和2、4 μmol/L的Ive，并設(shè)置LPS組和空白對照組(加入等體積的培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。

1.7.3 慢病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)染建立PXR高表達(dá)的HCT116/L-OHP細(xì)胞 取對數(shù)生長期HCT116/L-OHP細(xì)胞，接種于6孔板中(1.0×105個/孔)，待細(xì)胞貼壁后，加入腺病毒(腺病毒與細(xì)胞數(shù)量比值為300)感染細(xì)胞24 h，聯(lián)合給予終濃度為25 μmol/L的L-OHP和2、4 μmol/L的Ive，并設(shè)置Ad-PXR組和空白對照組(加入等體積的培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。

將上述收集的細(xì)胞裂解后提取總蛋白，用BCA法檢測總蛋白濃度，經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，TBST漂洗，分別加入P-gp(1:1000)、NF-κB p65(1:1000)和PXR(1:1000)兔一抗，4 ℃下?lián)u床孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌后加入ECL發(fā)光液，利用凝膠成像儀顯影，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算P-gp、NF-κB和PXR蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 Ive聯(lián)合L-OHP對結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞裸鼠移植瘤模型的影響 取5～6周齡裸鼠20只，HCT116/L-OHP細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基制備1.0×107個/ml細(xì)胞懸液，于裸鼠背部皮下接種100 μl細(xì)胞懸液，待腫瘤生長至約100 mm3時，將裸鼠隨機(jī)分為空白對照組(注射等體積的生理鹽水)、Ive組(2 mg/kg，1次/d)、L-OHP組(5 mg/kg，2次/周)與Ive(2 mg/kg，1次/d)+L-OHP(5 mg/kg，2次/周)組[9,13]，每組5只。L-OHP經(jīng)尾靜脈注射給藥，Ive灌胃給藥，連續(xù)給藥21 d。每3 d測量1次腫瘤的最長徑和最短徑，計(jì)算腫瘤體積，21 d后處死裸鼠并剝離實(shí)體瘤，稱量腫瘤重量。

1.9 免疫組化檢測腫瘤組織中P-gp、NF-κB和PXR蛋白的表達(dá)情況 腫瘤組織于4%甲醛溶液中固定5 d，石蠟包埋、切片(厚度4 μm)，置于65 ℃恒溫箱中12 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，用3% H2O2在37 ℃下孵育10 min阻斷、滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌，0.01 μmol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)修復(fù)抗原，PBS洗滌；加入P-gp(1:200)、NF-κB p65(1:200)和PXR(1:200)兔一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS洗滌3次，5 min/次；加入Alexa Flour(1:200)兔二抗，37 ℃孵育15 min，PBS洗滌3次，5 min/次；DAB反應(yīng)染色，顯微鏡下觀察反應(yīng)進(jìn)度，雙蒸水充分沖洗；蘇木精復(fù)染，脫水透明后封片，拍照。利用ImagePro Plus軟件計(jì)算P-gp、NF-κB p65和PXR的相對表達(dá)密度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ive增效L-OHP對結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞增殖能力的影響 MTT法檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，L-OHP 25 μmol/L組以及L-OHP聯(lián)合Ive 1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L組結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞存活率明顯降低，且呈劑量依賴性(P<0.05，圖1)?？寺?shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，空白對照組、L-OHP 25 μmol/L組、L-OHP+Ive 2 μmol/L組和L-OHP+Ive 4 μmol/L組的細(xì)胞克隆數(shù)依次為(257.67±29.14)個、(146.00±18.08)個、(95.33±7.02)個和(50.67±12.66)個。L-OHP 25 μmol/L組、L-OHP+Ive 2 μmol/L組、L-OHP+Ive 4 μ m o l/L 組的細(xì)胞克隆數(shù)少于空白對照組，L-OHP+Ive 2 μmol/L組和L-OHP+Ive 4 μmol/L組少于L-OHP 25 μmol/L組，L-OHP+Ive 4 μmol/L組少于L-OHP+Ive 2 μmol/L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖1 MTT法檢測結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞的存活率(n=5)Fig.1 Viability of colon cancer HCT116/L-OHP cells (MTT method, n=5)

圖2 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞的克隆形成能力(n=3)Fig.2 The cloning ability of colon cancer HCT116/L-OHP cells (Cell cloning experiment, n=3)

2.2 Ive增效L-OHP對結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，空白對照組、L-OHP 25 μmol/L組、L-OHP+Ive 2 μmol/L組和L-OHP+Ive 4 μmol/L組結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡率依次為4.83%±0.45%、9.72%±0.63%、20.74%±1.07%、38.16%±1.53%。L-OHP 25 μmol/L組、L-OHP+Ive 2 μmol/L組和L-OHP+Ive 4 μmol/L組結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡率高于空白對照組，L-OHP+Ive 2 μmol/L組和L-OHP+Ive 4 μmol/L組高于L-OHP 25 μmol/L組，L-OHP+Ive 4 μmol/L組高于L-OHP+Ive 2 μmol/L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞的凋亡率(n=3)Fig.3 The apoptosis rate of colon cancer HCT116/L-OHP cells (Flow cytometry, n=3)

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞周期結(jié)果顯示，空白對照組、L-OHP 25 μmol/L組、L-OHP+Ive 2 μmol/L組和L-OHP+Ive 4 μmol/L組S期細(xì)胞百分比依次為8.65%±1.70%、13.85%±1.95%、19.53%±2.66%、32.10%±3.14%。L-OHP+Ive 2 μmol/L組和L-OHP+Ive 4 μmol/L組的S期細(xì)胞百分率高于空白對照組，L-OHP+Ive 4 μmol/L組高于L-OHP 25 μmol/L組和L-OHP+Ive 2 μmol/L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況(n=3)Fig.4 Periodic distribution of colon cancer HCT116/L-OHP cells (Flow cytometry, n=3)

2.3 Ive增效L-OHP對結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞NF-κB p65、PXR及P-gp蛋白表達(dá)的影響 Western bl o tt i ng 檢測結(jié)果顯示，空白對照組、L-O H P 25 μmol/L組、L-OHP+Ive 2 μmol/L組和L-OHP+Ive 4 μmol/L組結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞中NF-κB p65的表達(dá)水平依次為0.68±0.08、0.61±0.07、0.48±0.06、0.37±0.064，PXR的表達(dá)水平依次為0.89±0.09、0.72±0.04、0.57±0.06、0.42±0.06，P-gp的表達(dá)水平依次為1.02±0.19、0.77±0.12、0.59±0.04、0.45±0.06。L-OHP組P-gp的表達(dá)水平低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；L-OHP+Ive 2 μmol/L組和L-OHP+Ive 4 μmol/L組NF-κB p65、PXR和P-gp的表達(dá)水平均低于空白對照組，L-OHP+Ive 4 μmol/L組低于L-OHP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞中NF-κB p65、PXR及P-gp的表達(dá)水平(Western blotting)Fig.5 Expression levels of NF-κB p65, PXR and P-gp in colon cancer HCT116/L-OHP cells (Western blotting)

為進(jìn)一步明確NF-κB p65、PXR和P-gp之間的調(diào)控作用及其是否為Ive發(fā)揮增效作用，本研究利用LPS誘導(dǎo)建立NF-κB p65高表達(dá)的HCT116/L-OHP細(xì)胞模型和慢病毒感染建立PXR高表達(dá)的HCT116/L-OHP細(xì)胞模型。Western blotting檢測結(jié)果顯示，在NF-κB p65高表達(dá)的HCT116/L-OHP細(xì)胞模型中，空白對照組、LPS組、LPS+L-OHP組、LPS+LOHP+Ive 2 μmol/L組和LPS+L-OHP+Ive 4 μmol/L組NF-κB p 6 5 的表達(dá)水平依次為0.5 1±0.0 9、1.03±0.15、0.85±0.04、0.74±0.03、0.73±0.03，PXR的表達(dá)水平依次為0.39±0.02、0.56±0.06、0.48±0.01、0.42±0.03、0.34±0.03，P-gp的表達(dá)水平依次為0.53±0.05、0.65±0.05、0.36±0.03、0.42±0.03、0.35±0.02。LPS組NF-κB p65、PXR的表達(dá)水平高于空白對照組，LPS+L-OHP組NF-κB p65、P-gp的表達(dá)水平低于空白對照組和LPS組，LPS+L-OHP+Ive 2 μmol/L組和LPS+L-OHP+Ive 4 μmol/L組NF-κB p65、PXR和P-gp的表達(dá)水平均低于LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

圖6 NF-κB p65高表達(dá)的結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞中NF-κB p65、PXR及P-gp的表達(dá)水平(Western blotting)Fig.6 Expression levels of NF-κB p65, PXR and P-gp in colon cancer HCT116/L-OHP cells with high NF-κB p65 expression(Western blotting)

在PXR高表達(dá)的HCT116/L-OHP細(xì)胞模型中，空白對照組、Ad-PXR組、Ad-PXR+L-OHP組、Ad-PXR+L-OHP+Ive 2 μmol/L組和Ad-PXR+LOHP+Ive 4 μmol/L組NF-κB p65的表達(dá)水平依次為0.81±0.03、0.87±0.03、0.62±0.00、0.46±0.00、0.22±0.00，PXR的表達(dá)水平依次為0.88±0.01、1.01±0.00、0.74±0.01、0.54±0.00、0.32±0.05，P-gp的表達(dá)水平依次為0.67±0.03、0.94±0.04、0.78±0.04、0.54±0.00、0.37±0.03。Ad-PXR組NF-κB p65、PXR和P-gp的表達(dá)水平高于空白對照組，而Ad-PXR+L-OHP組、Ad-PXR+L-OHP+Ive 2 μmol/L組和Ad-PXR+L-OHP+Ive 4 μmol/L組低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-PXR+LOHP+Ive 2 μmol/L組和Ad-PXR+L-OHP+Ive 4 μmol/L組NF-κB p65、PXR和P-gp的表達(dá)水平低于Ad-PXR組和Ad-PXR+L-OHP組，且Ad-PXR+L-OHP+Ive 4 μmol/L組低于Ad-PXR+L-OHP+Ive 2 μmol/L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖7)。

圖7 PXR高表達(dá)的結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞中NF-κB p65、PXR及P-gp的表達(dá)水平(Western blotting)Fig.7 Expression levels of NF-κB p65, PXR and P-gp in colon cancer HCT116/L-OHP cells with high PXR expression (Western blotting)

2.4 Ive增效L-OHP對裸鼠移植瘤生長的影響 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對照組、Ive組、L-OHP組、Ive+L-OHP組腫瘤重量依次為(1.06±0.13) g、(0.69±0.09) g、(0.53±0.09) g、(0.19±0.02) g。Ive組、L-OHP組和Ive+L-OHP組腫瘤重量低于空白對照組，L-OHP組和Ive+L-OHP組低于Ive組，Ive+L-OHP組低于L-OHP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖8)。第15、18、21天，Ive組、L-OHP組和Ive+L-OHP組腫瘤體積小于空白對照組，Ive+L-OHP組小于Ive組和L-OHP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 結(jié)腸癌HCT116/L-OHP耐藥細(xì)胞裸鼠移植瘤各時間點(diǎn)的腫瘤體積(mm3，±s，n=5)Tab.1 Tumor volume of nude mice with colon cancer HCT116/L-OHP resistant cells at each time point (mm3, ±s, n=5)

表1 結(jié)腸癌HCT116/L-OHP耐藥細(xì)胞裸鼠移植瘤各時間點(diǎn)的腫瘤體積(mm3，±s，n=5)Tab.1 Tumor volume of nude mice with colon cancer HCT116/L-OHP resistant cells at each time point (mm3, ±s, n=5)

與空白對照組比較，(1)P<0.05；與Ive組比較，(2)P<0.05；與L-OHP組比較，(3)P<0.05。

時間空白對照組Ive組L-OHP組Ive+L-OHP組第1天72.48±8.0070.51±10.5372.23±9.9272.22±5.45第3天102.31±13.6991.17±10.8391.58±11.2081.98±5.11第6天164.76±20.16132.66±11.63130.08±11.95100.18±7.96第9天248.44±47.66171.33±17.46166.54±11.46116.91±13.57(1)第12天438.79±86.69339.05±65.42309.71±55.09(1)160.91±50.27(1)(2)(3)第15天755.99±96.96526.01±112.66(1)493.79±79.42(1)221.16±60.74(1)(2)(3)第18天1054.86±129.61710.23±143.76(1)641.06±95.07(1)261.70±73.66(1)(2)(3)第21天1432.86±170.591010.71±71.77(1)804.22±118.58(1)(2)305.99±91.47(1)(2)(3)

圖8 Ive增效L-OHP抑制結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞在體內(nèi)的增殖情況(n=5)Fig.8 Ivermectin synergizing L-OHP to inhibit the proliferation in vivo of colon cancer HCT116/L-OHP cells (n=5)

2.5 Ive在體內(nèi)增效L-OHP對腫瘤組織中NF-κB p65、PXR及P-gp蛋白表達(dá)的影響 免疫組化檢測結(jié)果顯示，空白對照組、Ive組、L-OHP組、Ive+LOHP組腫瘤組織中NF-κB p65蛋白的相對表達(dá)密度依次為0.32±0.07、0.27±0.03、0.18±0.01、0.1 2±0.0 1，P X R 蛋白的相對表達(dá)密度依次為0.31±0.05、0.25±0.02、0.20±0.03、0.16±0.04，P-g p蛋白的相對表達(dá)密度依次為0.28±0.06、0.23±0.02、0.18±0.03、0.14±0.02。Ive組、L-OHP組和Ive+L-OHP組腫瘤組織中NF-κB p65、PXR及P-gp蛋白的相對表達(dá)密度低于空白對照組，且L-OHP組、Ive+L-OHP組低于Ive組，Ive+L-OHP組低于L-OHP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖9)。

圖9 免疫組化檢測腫瘤組織中NF-κB p65、PXR及P-gp的表達(dá)情況Fig.9 The expressions of NF-κB p65, PXR and P-gp in tumor tissues (Immunohistochemical detection)

3 討 論

目前，NCCN治療指南推薦采用手術(shù)切除和放化療治療CRC[3]，但晚期CRC化療成功率低。L-OHP是第三代鉑類化療藥物，與第一、二代鉑類化療藥無明顯交叉耐藥，已被廣泛應(yīng)用于治療進(jìn)展期CRC[14]。L-OHP發(fā)揮抗癌作用的主要機(jī)制是與腫瘤細(xì)胞DNA鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián)，導(dǎo)致DNA損傷，同時抑制DNA和RNA合成及觸發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，促使細(xì)胞凋亡[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，采用L-OHP標(biāo)準(zhǔn)治療方案的進(jìn)展期CRC患者中位無病生存期和總生存期均較短，分別為10.3個月和23.7個月[16]，分析主要原因?yàn)镃RC細(xì)胞對L-OHP耐藥，化療后期近50%的初始化療敏感者產(chǎn)生獲得性耐藥[17]。因此，提高CRC患者對L-OHP的化療敏感性是延長其生存期的關(guān)鍵。近年來多項(xiàng)研究顯示，聯(lián)合給藥可增效L-OHP抗結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的作用，如二甲雙胍可誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116耐藥細(xì)胞發(fā)生線粒體凋亡，從而逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞對L-OHP的耐藥性[18]；葫蘆巴堿可抑制Nrf-2途徑以克服結(jié)腸癌細(xì)胞對L-OHP的耐藥性[19]；人參皂苷Rh2可抑制P-gp的表達(dá)，從而增強(qiáng)結(jié)腸癌LoVo耐藥細(xì)胞對L-OHP的敏感性[20]。Jiang等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，Ive在體內(nèi)外均可增強(qiáng)長春新堿和阿霉素對結(jié)腸癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞白血病耐藥細(xì)胞的抗腫瘤作用。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ive可增效L-OHP抑制結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞的增殖和克隆形成，促進(jìn)HCT116/L-OHP細(xì)胞的凋亡和S期細(xì)胞阻滯；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ive可增效L-OHP抑制HCT116/L-OHP細(xì)胞移植瘤的生長，表明Ive可增強(qiáng)L-OHP抗結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的作用，具有成為耐藥結(jié)腸癌化療增敏藥物的潛力。

細(xì)胞耐藥最經(jīng)典的作用機(jī)制是由ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP binding cassette transporters，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)介導(dǎo)的。P-gp是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的重要成員，為血漿膜結(jié)合藥物外排性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在正常組織中分布廣泛，主要存在于腸道上皮、腎小管、肝小管、血腦屏障和胎盤屏障等，在細(xì)胞中主要表達(dá)于上皮細(xì)胞內(nèi)腔側(cè)表面、頂端和黏膜側(cè)，其功能是與底物相結(jié)合后將底物從細(xì)胞質(zhì)中排出細(xì)胞[21]。多種內(nèi)源性和外源性化合物可經(jīng)P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)，但P-gp介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)會產(chǎn)生不利影響，如影響藥物的輸送，繼而產(chǎn)生多藥耐藥并介導(dǎo)臨床上多種藥物的相互作用。研究顯示，P-gp在肺癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，且P-gp高表達(dá)與這些腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥密切相關(guān)[22-24]。由于L-OHP是P-gp的常見底物[25]，在結(jié)腸癌細(xì)胞中P-gp與L-OHP結(jié)合后可將L-OHP往胞外排出，降低了其胞內(nèi)濃度和藥物利用率，致使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，從而影響化療效果。因此，抑制P-gp的表達(dá)是增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對L-OHP化療敏感性的重要途徑。

NF-κB的經(jīng)典激活途徑是外源性刺激使蛋白激酶(IKK)磷酸化激活，激活狀態(tài)下的IKK可磷酸化IκB蛋白，使NF-κB p65轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65核轉(zhuǎn)位后可與PXR/RXR異源二聚體上的RXR反應(yīng)元件結(jié)合，然后PXR/RXR與P-gp基因序列的上游調(diào)節(jié)元件結(jié)合，從而參與P-gp基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[27-28]。因此，抑制NF-κB/PXR通路的表達(dá)可減弱P-gp的外排作用。有研究者在大腸癌耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR中發(fā)現(xiàn)，抑制NF-κB的活性后，大腸癌細(xì)胞中P-gp表達(dá)減少，對長春新堿的敏感性明顯增強(qiáng)[29]。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞中，Ive可協(xié)同L-OHP抑制NF-κB p65、PXR及P-gp蛋白的表達(dá)；在NF-κB p65和PXR高表達(dá)的結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞中，當(dāng)僅高表達(dá)NF-κB p65時，PXR的表達(dá)水平升高，而僅高表達(dá)PXR時，NF-κB p65和P-gp的表達(dá)水平均升高，提示結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞中NF-κB p65與PXR相互調(diào)控，可增加下游P-gp耐藥蛋白的表達(dá)；使用Ive處理NF-κB p65和PXR高表達(dá)的結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞后，NF-κB p65、PXR及P-gp蛋白的表達(dá)被逆轉(zhuǎn)，表明NF-κB p65可通過正向調(diào)控PXR而促進(jìn)P-gp蛋白的表達(dá)，Ive發(fā)揮增效抗耐藥作用的潛在機(jī)制是通過抑制NF-κB p65/PXR的表達(dá)而抑制P-gp蛋白的耐藥作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，Ive可與表皮生長因子受體結(jié)合，抑制表皮生長因子受體的激活及其下游的ERK/Akt/NF-κB信號通路，NF-κB被抑制后P-gp的轉(zhuǎn)錄減少，從而逆轉(zhuǎn)了腫瘤細(xì)胞的耐藥性[9]。

本研究存在一定的局限性，如未能建立同時高表達(dá)和低表達(dá)NF-κB p65、PXR的結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞模型，從正反方向驗(yàn)證Ive抗結(jié)腸癌耐藥的作用機(jī)制，以及通過細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等表型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Ive對高表達(dá)和低表達(dá)NF-κB p65、PXR的HCT116/L-OHP細(xì)胞的作用；未在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中利用液相二級質(zhì)譜技術(shù)檢測L-OHP的濃度以及利用Caco-2細(xì)胞模型觀察Ive對P-gp外排的影響。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，Ive可增效L-OHP抑制結(jié)腸癌HCT116/L-OHP細(xì)胞的增殖和克隆形成，促進(jìn)HCT116/L-OHP細(xì)胞的凋亡和S期阻滯，其可能的機(jī)制是通過抑制NF-κB p65/PXR信號通路的表達(dá)而減弱P-gp蛋白的耐藥作用。