姜敬男，岳維

1山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，太原 030000；2山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院麻醉科，太原 030000

胃癌是我國(guó)最常見的消化道惡性腫瘤，也是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。手術(shù)切除治療是胃癌最主要的治療手段，但多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期，術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率均較高，僅通過手術(shù)治療難以達(dá)到最佳效果，因此多依賴于化學(xué)藥物治療[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥的耐藥性逐漸增強(qiáng)[2-3]，化療耐藥性是癌癥治療中的關(guān)鍵問題[4]。因此，尋找新的藥物增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，對(duì)改善化療療效及提高患者術(shù)后生存率具有重要的臨床意義。丙泊酚是一種常用的靜脈麻醉藥，廣泛應(yīng)用于腫瘤切除術(shù)中。越來越多的證據(jù)表明，丙泊酚除具有麻醉作用外，還具有抗腫瘤作用。既往體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可抑制胃癌、肺癌、肝癌等多種癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[5-7]。但目前丙泊酚是否會(huì)對(duì)胃癌患者的化療療效產(chǎn)生影響尚未明確。本研究建立人胃癌BALB/c小鼠移植瘤模型，探討丙泊酚對(duì)奧沙利鉑抗腫瘤作用的影響，以期為胃癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI 1640培養(yǎng)液(E600028-0500)、胎牛血清(E510002-0100)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；丙泊酚(MB1613)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；奧沙利鉑(O8390)、二甲基亞砜(DMSO，D8371)購(gòu)自北京索萊寶生物有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9 ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇酶免生物科技公司。CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Forna公司；CK-40型倒置顯微鏡、BX-51型熒光顯微鏡購(gòu)自日本TKO光學(xué)儀器株式會(huì)社；RM2245石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；Novapath酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 BALB/c小鼠40只，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄各半，體重20～22 g，在(22±2) ℃、50%±10%濕度條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人胃癌MGC 803細(xì)胞株(貨號(hào)：CX0213)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 人胃癌MGC 803細(xì)胞小鼠移植瘤模型建立接種前1 d，小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺200 mg/kg、地塞米松40 mg/kg，以抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。參考文獻(xiàn)[8]的方法制備人胃癌MGC 803細(xì)胞小鼠移植瘤模型。人胃癌MGC 803細(xì)胞株于含10%胎牛血清、10 U/L青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化吹打成單細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min，用PBS稀釋，制備成單細(xì)胞懸液(1×107個(gè)/ml)。在小鼠右側(cè)腹股溝處接種0.2 ml胃癌細(xì)胞懸液，12 d后觀察成瘤情況(腹股溝處出現(xiàn)長(zhǎng)徑約6 mm的皮下結(jié)節(jié)，提示移植瘤模型建立成功)。

1.4 胃癌移植瘤小鼠分組及處理 共14只雄性、13只雌性小鼠成瘤，棄掉生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)較差(如毛發(fā)不光滑、活動(dòng)度降低等)的雄性2只、雌性1只，共24只成瘤小鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為對(duì)照組、丙泊酚組(5 mg/kg丙泊酚)、奧沙利鉑組(6 mg/kg奧沙利鉑)與丙泊酚+奧沙利鉑組(5 mg/kg丙泊酚+6 mg/kg奧沙利鉑)，每組6只，雌雄各半。每3d腹腔注射給藥1次，連續(xù)3次。給藥后小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無不良反應(yīng)，未見死亡現(xiàn)象。

1.5 抑瘤率計(jì)算 停藥2 d后麻醉小鼠，采用心臟取血法采集血樣后處死，剝離腫瘤組織，測(cè)量腫瘤大小，記錄腫瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，瘤體積=a×b2/2。各組瘤體積取平均值，計(jì)算抑瘤率。體積抑瘤率(%)=(對(duì)照組平均瘤體積－實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積)/對(duì)照組平均瘤體積×100%。稱取各組移植瘤重量，取平均值，計(jì)算抑瘤率。質(zhì)量抑瘤率(%)=(對(duì)照組平均瘤重量－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重量)/對(duì)照組平均瘤重量×100%。采集的血樣和腫瘤組織保存于-70 ℃冰箱備測(cè)。

1.6 HE染色觀察腫瘤組織病理學(xué)變化 腫瘤組織于4%甲醛溶液中固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制作石蠟切片，然后經(jīng)脫蠟、水化后，采用HE染色，中性樹脂膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.7 ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-6、EGF、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟測(cè)定各組血清中TNF-α、IL-6的表達(dá)水平。取腫瘤組織，勻漿，按照ELISA試劑盒說明書步驟測(cè)定各組移植瘤組織中EGF、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠移植瘤抑瘤率比較 與對(duì)照組相比，丙泊酚組、奧沙利鉑組及丙泊酚+奧沙利鉑組小鼠移植瘤的體積、質(zhì)量均有不同程度的降低(移植瘤體積：F=248.717，P<0.05；移植瘤質(zhì)量：F=376.205，P<0.05)。與奧沙利鉑組相比，丙泊酚+奧沙利鉑組小鼠移植瘤的體積抑瘤率、質(zhì)量抑瘤率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組小鼠移植瘤抑瘤率比較(±s，n=6)Tab.1 Comparison of tumor inhibition rate in each group (±s, n=6)

表1 各組小鼠移植瘤抑瘤率比較(±s，n=6)Tab.1 Comparison of tumor inhibition rate in each group (±s, n=6)

與對(duì)照組相比，(1)P<0.05；與奧沙利鉑組相比，(2)P<0.05。

組別移植瘤體積(mm3)體積抑瘤率(%)移植瘤質(zhì)量(mg)質(zhì)量抑瘤率(%)對(duì)照組140.38±7.530269.08±11.190丙泊酚組102.95±8.10(1)26.66±5.77(1)205.53±13.19(1)23.61±4.90(1)奧沙利鉑組74.15±8.02(1)47.18±5.71(1)144.15±10.73(1)46.43±3.99(1)丙泊酚+奧沙利鉑組24.65±6.59(1)(2)82.44±4.69(1)(2)59.35±9.79(1)(2)77.95±3.64(1)(2)

2.2 病理組織學(xué)觀察 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組移植瘤細(xì)胞增生分裂活躍，癌細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核大深染，不規(guī)則。丙泊酚組癌細(xì)胞數(shù)量減少，核分裂象減少，部分癌細(xì)胞變性、體積縮小。奧沙利鉑組癌細(xì)胞核分裂象減少，部分癌細(xì)胞由片狀變性趨近于片狀壞死。丙泊酚+奧沙利鉑組癌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，增生分裂受到抑制，癌細(xì)胞體積明顯減小，細(xì)胞核固縮為均一的藍(lán)黑色致密物，胞質(zhì)密度增大；癌細(xì)胞核碎片增多，可見大面積壞死(圖1)。

圖1 各組移植瘤細(xì)胞光鏡下形態(tài)學(xué)變化(HE ×400)Fig.1 Morphological changes of transplanted tumor cells in each group under light microscope (HE ×400)

2.3 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6以及移植瘤組織中EGF、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平比較 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，丙泊酚組、奧沙利鉑組及丙泊酚+奧沙利鉑組小鼠血清中TNF-α、IL-6以及移植瘤組織中EGF、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，且丙泊酚+奧沙利鉑組低于奧沙利鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6以及移植瘤組織中EGF、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平比較(pg/ml，±s，n=6)Tab.2 Comparison of the levels of TNF-α and IL-6 in serum and EGF, MMP-2 and MMP-9 in transplanted tumor tissues of transplanted tumor mice (pg/ml, ±s, n=6)

表2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6以及移植瘤組織中EGF、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平比較(pg/ml，±s，n=6)Tab.2 Comparison of the levels of TNF-α and IL-6 in serum and EGF, MMP-2 and MMP-9 in transplanted tumor tissues of transplanted tumor mice (pg/ml, ±s, n=6)

TNF-α. 腫瘤壞死因子-α；IL-6. 白細(xì)胞介素-6；EGF. 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；MMP-2. 基質(zhì)金屬蛋白酶-2；MMP-9. 基質(zhì)金屬蛋白酶-9；與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與奧沙利鉑組比較，(2)P<0.05。

組別TNF-αIL-6EGFMMP-2MMP-9對(duì)照組103.64±9.27226.93±17.09330.79±31.94544.24±50.39451.47±44.48丙泊酚組89.31±7.32(1)197.98±15.40(1)273.35±27.21(1)426.15±31.32(1)342.54±29.65(1)奧沙利鉑組74.37±5.07(1)155.95±15.62(1)236.48±24.88(1)334.19±29.38(1)242.97±20.90(1)丙泊酚+奧沙利鉑組57.62±4.71(1)(2)80.26±8.75(1)(2)141.69±12.41(1)(2)138.61±15.26(1)(2)116.97±13.17(1)(2)

3 討 論

胃癌已成為威脅人類健康和生存的主要疾病，也是我國(guó)癌癥死亡的重要原因之一。目前胃癌主要采用手術(shù)切除治療，但進(jìn)展期胃癌患者由于已發(fā)生轉(zhuǎn)移，需要進(jìn)行化療以殺滅原位殘留的癌細(xì)胞及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞。作為第三代鉑類抗癌藥物，奧沙利鉑常用于胃癌的治療，其作用機(jī)制主要為鉑原子與腫瘤細(xì)胞DNA快速結(jié)合形成鏈內(nèi)交聯(lián)，阻斷DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。盡管奧沙利鉑對(duì)晚期胃癌的療效明顯，但大多數(shù)患者最終仍會(huì)對(duì)其產(chǎn)生耐藥性[10]。因此，提高胃癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑化療的敏感性，增強(qiáng)奧沙利鉑的抗腫瘤作用以改善胃癌患者的預(yù)后，是目前亟須解決的問題。本研究采用丙泊酚聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人胃癌BALB/c小鼠移植瘤模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，丙泊酚組、奧沙利鉑組移植瘤的質(zhì)量和體積均明顯低于對(duì)照組，表明兩種藥物均可抑制腫瘤的生長(zhǎng)。丙泊酚與奧沙利鉑聯(lián)合組的抗腫瘤效應(yīng)明顯高于奧沙利鉑組，表明丙泊酚不僅可抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，還可增強(qiáng)奧沙利鉑的抗腫瘤效應(yīng)。

炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是癌癥發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)重要特征[11]。部分研究者認(rèn)為，與癌癥相關(guān)的炎癥反應(yīng)主要與腫瘤部位發(fā)生的局部免疫反應(yīng)有關(guān)，而這種炎癥反應(yīng)常有助于腫瘤的發(fā)展[12]。炎性細(xì)胞因子可通過多種途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，包括對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接影響、與趨化因子的相互作用、刺激上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等[13]。TNF-α是重要的炎性介質(zhì)之一，可促進(jìn)多種炎性因子的釋放，從而加劇炎癥反應(yīng)[14]。IL-6是一種多功能促炎細(xì)胞因子，與胃癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-6在癌性環(huán)境下可被誘導(dǎo)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖[16-17]。因此，減少炎性因子的分泌可能是抑制胃癌進(jìn)展的有效方法。本研究結(jié)果表明，丙泊酚可抑制炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6等的釋放，并顯著增強(qiáng)奧沙利鉑對(duì)TNF-α、IL-6的抑制作用，提示丙泊酚增強(qiáng)奧沙利鉑抗腫瘤作用的機(jī)制之一可能是其抑制了炎性因子的促腫瘤細(xì)胞增殖作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，EGF在胃癌組織中過表達(dá)，可通過自分泌和旁分泌的方式作用于癌組織，與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)結(jié)合可促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18]。此外，EGF還可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞中VEGF mRNA的表達(dá)，促進(jìn)新生血管生長(zhǎng)，加速腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵酶，主要包括MMP-2和MMP-9，二者被激活后可以形成Ⅳ型膠原酶，降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，是反映腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力的重要指標(biāo)[19]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能夠抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲和轉(zhuǎn)移，而該過程與其調(diào)控MMP的表達(dá)水平有關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，丙泊酚組、奧沙利鉑組移植瘤組織中EGF、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平均明顯降低，且丙泊酚與奧沙利鉑聯(lián)合用藥可進(jìn)一步降低EGF、MMP-2、MMP-9的表達(dá)，提示丙泊酚可通過抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移來增強(qiáng)奧沙利鉑的抗腫瘤作用。

目前，丙泊酚增強(qiáng)奧沙利鉑對(duì)胃癌細(xì)胞化療療效的具體機(jī)制尚不明確，有關(guān)丙泊酚對(duì)癌癥患者化療療效影響的研究較少。共濟(jì)失調(diào)素-2樣蛋白(ATXN2L)是Ataxin家族中的一員，Ataxin家族蛋白主要在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，但近年來其在腫瘤領(lǐng)域的研究也成為了熱點(diǎn)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，使用不同濃度的EGF處理胃癌MGC 803細(xì)胞，細(xì)胞中ATXN2L mRNA和蛋白的表達(dá)量隨著EGF濃度的增高而升高；當(dāng)沉默ATXN2L后，EGF促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力被部分逆轉(zhuǎn)，由此可見，EGF可通過上調(diào)ATXN2L的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而降低胃癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性[22]。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚可通過抑制EGF的表達(dá)來增強(qiáng)奧沙利鉑的抗腫瘤作用，由此推測(cè)，丙泊酚可能通過EGF/ATXN2L途徑來提高胃癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，丙泊酚可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并提高胃癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的化療敏感性，從而增強(qiáng)奧沙利鉑的抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與丙泊酚抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)控EGF的表達(dá)水平有關(guān)。該結(jié)果為丙泊酚用于改善胃癌患者對(duì)奧沙利鉑的化療耐藥性提供了理論依據(jù)。