羅蘭，熊穎，國(guó)奧，陳春意，夏韻，李靖凡，盧清，柯劍娟

武漢大學(xué)中南醫(yī)院麻醉科，武漢 430071

過(guò)去十年，由于藥物洗脫支架技術(shù)的進(jìn)展[1]，短期內(nèi)血管內(nèi)再狹窄發(fā)生率逐年下降，但繼發(fā)的支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率上升[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，藥物洗脫支架破壞了內(nèi)皮的功能和完整性，不利于內(nèi)皮再生，從而造成內(nèi)皮持續(xù)性炎癥、內(nèi)皮化不完全、動(dòng)脈愈合延遲，形成繼發(fā)的血栓相關(guān)血管內(nèi)狹窄[3-4]。血管內(nèi)膜增生過(guò)度亦可限制管腔血流，導(dǎo)致血管再狹窄[5]。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一種天然的植物多酚，具有抗癌、抗氧化、抗炎和抗過(guò)敏等多種有益特性[6-9]。RSV可將細(xì)胞阻滯在G1～S期，以劑量依賴的方式抑制平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)增殖[10]，加速SMC凋亡[11]，最終減輕血管壁增厚引起的再狹窄。有研究報(bào)道，RSV在體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中可以時(shí)間和劑量依賴的方式抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[12]，但關(guān)于其對(duì)受損血管內(nèi)皮的修復(fù)作用研究較少。本研究采用頸總動(dòng)脈球囊損傷大鼠模型，通過(guò)損傷段局部給藥的方式觀察體內(nèi)環(huán)境下RSV對(duì)內(nèi)皮及整個(gè)血管的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RSV(純度≥99.8%)、F-127 Pluronic固體凝膠、DMSO溶液、4%多聚甲醛緩沖液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蘇木精染液、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(Ba1086)購(gòu)自武漢百仟度生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司；小鼠抗CD31一抗(ab24590)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(5220-0341)購(gòu)自美國(guó)SeraCare公司；兔抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)單克隆抗體(19003-1-AP)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(074-1506)購(gòu)自美國(guó)KPL公司。2F球囊導(dǎo)管購(gòu)自日本泰爾茂有限公司；全自動(dòng)數(shù)字玻片掃描與分析系統(tǒng)(型號(hào)Aperio VERSA8)購(gòu)自上海徠卡生物系統(tǒng)有限公司；病理切片機(jī)(型號(hào)RM2016)購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只健康雄性Sprague-Dawley大鼠購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0001]，體重200～250 g，SPF級(jí)屏障環(huán)境下飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心大鼠房?jī)?nèi)[相對(duì)濕度50%～60%、溫度(22±2) ℃]，自由飲食。適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、溶劑對(duì)照組(DSMO組)與RSV組，每組10只。大鼠所有手術(shù)均在1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用1%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)過(guò)量麻醉實(shí)施安樂死。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程經(jīng)武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心審核和批準(zhǔn)(WP2020-08121)。

1.3 頸總動(dòng)脈球囊損傷大鼠模型制備 根據(jù)文獻(xiàn)[13]、[14]的方法制備頸總動(dòng)脈球囊損傷大鼠模型。大鼠術(shù)前禁食禁水12 h后稱重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，頸部備皮消毒，正中縱向做3 cm左右切口，鈍性分離皮下組織，于左側(cè)斜方肌上方鈍性分離出頸總動(dòng)脈，將其與伴行的迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)分離，動(dòng)脈夾夾閉近心端，繼續(xù)向頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端分離，直至頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈的分叉處遠(yuǎn)心端約5 mm，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端。在頸外動(dòng)脈線結(jié)近心端橫向剪一小開口，將2F球囊導(dǎo)管從小口插入頸總動(dòng)脈2.0～2.5 cm，向球囊內(nèi)注氣約0.25 ml，并向外抽動(dòng)球囊導(dǎo)管3次。在距頸總動(dòng)脈分叉處約2 mm位置結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端，使頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈恢復(fù)充盈搏動(dòng)，即造模成功。

1.4 頸總動(dòng)脈外膜給藥 參照文獻(xiàn)[14]，使用Pluronic凝膠方法進(jìn)行頸總動(dòng)脈給藥。將500 μg RSV溶于30 μl 10% DMSO中，然后與270 μl 25% F-127 Pluronic凝膠混合冰育。為避免RSV光異構(gòu)化，將RSV、DMSO與F-127 Pluronic凝膠的混合物保存于鋁箔包裹的密封Eppendorf管中。

RSV組：在頸總動(dòng)脈進(jìn)行球囊血管成形術(shù)后，將含RSV的凝膠均勻涂在頸總動(dòng)脈損傷段的外周，使其固化。DSMO組：將30 μl 10% DMSO與270 μl 25% F-127 Pluronic凝膠混合冰育，均勻涂在頸總動(dòng)脈損傷段的外周，使其固化。給藥結(jié)束后，逐層縫合關(guān)閉術(shù)野。假手術(shù)組僅結(jié)扎頸外動(dòng)脈，模型組僅行頸總動(dòng)脈球囊損傷術(shù)，均不給藥。術(shù)后單獨(dú)飼養(yǎng)，常規(guī)飲食，自由飲水至第14天，用1%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)過(guò)量麻醉處死，取頸總動(dòng)脈損傷段動(dòng)脈組織，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.5 HE染色觀察血管內(nèi)膜增生程度和管腔狹窄程度 每組隨機(jī)挑選3只大鼠處死，取頸總動(dòng)脈損傷段動(dòng)脈組織，固定24 h、脫水、石蠟包埋。蠟塊以5 μm厚度做橫切面，置于60 ℃恒溫箱內(nèi)烘干，常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色1 min，沖洗返藍(lán)，伊紅染色1 min，清洗后脫水、透明、封片，使用全自動(dòng)數(shù)字玻片掃描與分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照。在橫截面切片上測(cè)量外膜以內(nèi)區(qū)(EEL)面積及周長(zhǎng)、內(nèi)膜及內(nèi)區(qū)(IEL)面積、管腔面積，內(nèi)膜面積=(IEL面積－管腔面積)，中膜面積=(EEL面積－IEL面積)，使用ImageScope軟件進(jìn)行分析。每個(gè)樣本取3個(gè)橫截面，取平均值。內(nèi)膜增生程度由內(nèi)膜面積與中膜面積的比值判定，比值越大表明內(nèi)膜增生程度越重；管腔狹窄程度由管腔面積與IEL面積的比值判定，比值越小表明管腔狹窄程度越重。

1.6 CD31免疫組織化學(xué)染色評(píng)估血管再內(nèi)皮化程度 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，修復(fù)抗原，洗滌，滴加BSA孵育30 min；加入小鼠抗CD31一抗(1:200)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS溶液(pH 7.4)洗滌；滴加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1:100)，室溫避光孵育50 min，PBS溶液(pH 7.4)洗滌；滴加DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)。顯色完全后，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，脫水，封片，使用全自動(dòng)數(shù)字玻片掃描與分析系統(tǒng)拍照，使用Barnes法進(jìn)行評(píng)分，具體評(píng)分細(xì)則如下。A(細(xì)胞顯色有無(wú)及深淺評(píng)分)：0分(不著色)、1分(淺黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)；B(顯色細(xì)胞比例評(píng)分)：1分(1%～10%)、2分(11%～50%)、3分(51%～80%)、4分(>80%)。Barnes評(píng)分(分)=A×B。評(píng)分越高表明CD31表達(dá)水平越高。

1.7 Western blotting檢測(cè)頸總動(dòng)脈組織中VEGF的表達(dá)水平 取大鼠頸總動(dòng)脈損傷段組織，PBS漂洗后剪成小塊置于勻漿器中，加入RIPA總蛋白裂解液，冰浴徹底勻漿，4 ℃下13 000 r/min離心5 min，取上清。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，上樣40 μg，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入兔抗人VEGF單克隆抗體(1:1000)4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:50 000)，室溫孵育30 min；加入ECL混合溶液，曝光、顯影、定影。使用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行拍照，用ImageJ軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RSV對(duì)頸總動(dòng)脈球囊損傷模型大鼠血管內(nèi)膜增生和管腔再狹窄的影響 H E 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組、DMSO組和RSV組EEL周長(zhǎng)依次為(2776±104) μm、(2808±96) μm、(2794±61) μm、(2737±108) μm，EEL面積依次為(401 723±110 235) μm2、(427 645±51 249) μm2、(428 551±24 924) μm2、(409 668±155 414) μm2，I E L 面積依次為(2 9 7 9 8 9±1 0 4 6 0 5) μ m2、(299 906±38 691) μm2、(305 250±31 223) μm2、(2 8 0 2 5 9±1 5 3 2 6 2) μ m2，管腔面積依次為(290 240±104 463) μm2、(230 440±44 012) μm2、(288 568±35 384) μm2、(137 545±64 629) μm2，內(nèi)膜增生程度依次為0.075±0.003、0.559±0.119、0.135±0.031、1.092±0.360，管腔狹窄程度依次為0.964±0.011、0.764±0.049、0.944±0.020、0.532±0.189。各組EEL周長(zhǎng)、EEL面積及IEL面積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組和DMSO組相比，RSV組管腔面積減小(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組和RSV組血管內(nèi)膜增生程度加重(P<0.05)；與模型組相比，DMSO組血管內(nèi)膜增生程度明顯減輕(P<0.05)；與DMSO組相比，RSV組血管內(nèi)膜增生程度加重(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組和RSV組管腔狹窄程度加重(P<0.05)；與模型組相比，DMSO組管腔狹窄程度減輕(P<0.05)；與DMSO組相比，RSV組管腔狹窄程度加重(P<0.05)(圖1)。

圖1 RSV對(duì)頸總動(dòng)脈球囊損傷模型大鼠血管內(nèi)膜增生和管腔再狹窄的影響(n=3)Fig.1 Effect of RSV on intimal hyperplasia and restenosis of common carotid artery in balloon injured rats (n=3)

2.2 RSV對(duì)頸總動(dòng)脈球囊損傷模型大鼠血管再內(nèi)皮化的影響 CD31免疫組化陽(yáng)性產(chǎn)物位于內(nèi)皮細(xì)胞表面，呈棕褐色，代表血管內(nèi)皮化的程度。如圖2A所示，假手術(shù)組內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性最好且均染為棕褐色；模型組內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性較差且70%的內(nèi)皮細(xì)胞染色為棕黃色；DMSO組內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性較差，約80%的內(nèi)皮細(xì)胞染色為棕黃色；RSV組內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性較好且90%的內(nèi)皮細(xì)胞染色為棕褐色。Barnes評(píng)分結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組、DMSO組和RSV組動(dòng)脈組織Barnes評(píng)分依次為(12.00±0.00)分、(7.33±1.16)分、(8.67±3.06)分、(11.00±1.70)分。與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)脈組織Barnes評(píng)分降低(P<0.05)；與模型組相比，RSV組動(dòng)脈組織Barnes評(píng)分明顯增高(P<0.05，圖2B)。

圖2 RSV對(duì)頸總動(dòng)脈球囊損傷模型大鼠血管再內(nèi)皮化的影響(n=3)Fig.2 Effect of RSV on vascular reendothelialization in rats with common carotid artery balloon injury (n=3)

2.3 RSV對(duì)頸總動(dòng)脈球囊損傷模型大鼠動(dòng)脈組織中VEGF表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組、DMSO組和RSV組動(dòng)脈組織中VEGF的表達(dá)水平依次為0.72±0.13、0.31±0.12、0.38±0.18、0.67±0.18。與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)脈組織中VEGF表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組和DMSO組相比，RSV組動(dòng)脈組織中VEGF表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組頸總動(dòng)脈組織中VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(Western blotting，n=6)Fig.3 Comparison of the relative expression level of VEGF protein in common carotid artery tissues (Western blotting, n=6)

3 討 論

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療引起血管損傷的過(guò)程較復(fù)雜，包括內(nèi)皮剝脫、各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的釋放、血小板活化，以及平滑肌細(xì)胞增殖和遷移到內(nèi)皮下間隙形成新內(nèi)膜增生等[15-16]，最終導(dǎo)致靶血管再狹窄。相較裸金屬支架，藥物洗脫支架顯著降低了再狹窄發(fā)生率，但晚期(置入后>1年)血栓形成再狹窄的發(fā)生率卻有所增高[17]。涂覆在支架上抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的藥物也可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，延遲內(nèi)皮的修復(fù)。藥物洗脫支架可在局部遞送高濃度的藥物，累積的藥物在血管支架內(nèi)停留，延長(zhǎng)了藥物抗增殖作用的時(shí)間，從而影響內(nèi)皮的恢復(fù)和功能[18]。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞為減少血栓形成、脂質(zhì)吸收及減輕炎癥提供了有效的屏障[19]。內(nèi)皮細(xì)胞功能喪失導(dǎo)致血小板的反應(yīng)性增加，同時(shí)激活有絲分裂原，增加黏附分子和組織因子的表達(dá)，并減少血栓調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)生，從而促進(jìn)血栓形成，導(dǎo)致經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后的內(nèi)皮功能障礙和炎癥[20-22]。內(nèi)皮再生是一種修復(fù)機(jī)制，用于維持正常血管功能的內(nèi)皮單層完整性。在支架置入后，再生的內(nèi)皮細(xì)胞可能在屏障完整性、細(xì)胞-細(xì)胞連接、血管通透性，以及抗氧化和抗血栓分子的表達(dá)等方面減弱[23-25]，而不成熟和無(wú)效的內(nèi)皮細(xì)胞更容易發(fā)生血栓，從而導(dǎo)致管腔狹窄[26]。

本研究結(jié)果顯示，處理14 d，RSV使損傷的血管內(nèi)膜增生，管腔狹窄明顯，再內(nèi)皮化程度較其他處理組增強(qiáng)，未發(fā)生收縮性重構(gòu)。相較假手術(shù)組，其余各組均有不同程度的內(nèi)膜增生和管壁變厚，假手術(shù)組因未行球囊損傷術(shù)損傷內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮最為完整，CD31免疫組織化學(xué)染色呈棕褐色且連續(xù)性最強(qiáng)。相較其他處理組，RSV處理過(guò)的血管損傷段CD31表達(dá)增加，表明RSV可增強(qiáng)受損血管的再內(nèi)皮化程度。VEGF具有促進(jìn)血管再生的能力，VEGF家族及其受體系統(tǒng)已被證實(shí)是血管新生細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的基本調(diào)節(jié)劑[27]，VEGF表達(dá)增加表明RSV能增強(qiáng)內(nèi)膜的再生能力和血管的新生能力。由此可見，短期內(nèi)血管內(nèi)膜增生、管腔狹窄并非病理性血管重構(gòu)引起的狹窄，而是由RSV對(duì)血管內(nèi)膜再生和再內(nèi)皮化的修復(fù)作用造成的。值得注意的是，相較傳統(tǒng)的RSV給藥方式如腹腔注射和灌胃等，本研究采用經(jīng)頸總動(dòng)脈外膜給藥，可使藥物精準(zhǔn)高效地作用于頸總動(dòng)脈損傷段，因此在兩周內(nèi)即可觀察到明顯的效應(yīng)，表明RSV在短期內(nèi)確實(shí)能夠促進(jìn)血管新生、內(nèi)膜再生以及增強(qiáng)內(nèi)皮化程度。再內(nèi)皮化是修復(fù)受損血管的第一步，能加速受損區(qū)域內(nèi)膜的恢復(fù)和預(yù)防血栓形成等并發(fā)癥，是預(yù)防遠(yuǎn)期再狹窄的前提。

內(nèi)膜損傷后，鄰近內(nèi)皮剝脫區(qū)域駐留內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和源自骨髓的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)的募集可使內(nèi)皮剝脫區(qū)域再內(nèi)皮化[16]。駐留的內(nèi)皮細(xì)胞增殖并從鄰近的完整節(jié)段遷移到受損節(jié)段，從而修復(fù)內(nèi)皮屏障。循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(circulating endothelial cell，CEC)是一種成熟的細(xì)胞，在血管損傷后從血管壁脫落進(jìn)入循環(huán)，到達(dá)內(nèi)皮受損節(jié)段修復(fù)內(nèi)皮[28-29]。正常情況下，CEC的數(shù)量非常低，但介入術(shù)后明顯增多，表明血管內(nèi)支架誘導(dǎo)了內(nèi)皮化[30]。EPC是骨髓中造血細(xì)胞的一種，為多能干細(xì)胞，在血流中循環(huán)，可分化成內(nèi)皮譜系細(xì)胞[31]，在受傷的內(nèi)膜處可發(fā)揮內(nèi)皮再生的作用[32]。當(dāng)EPC被動(dòng)員到血管損傷部位時(shí)可形成一個(gè)循環(huán)細(xì)胞池，這些細(xì)胞可以填補(bǔ)內(nèi)皮不連續(xù)的部位，修復(fù)受損的內(nèi)皮[33]，加速再內(nèi)皮化進(jìn)程。由此推測(cè)，RSV修復(fù)血管的始動(dòng)機(jī)制可能為促進(jìn)鄰近駐留內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，或者增強(qiáng)對(duì)骨髓內(nèi)皮細(xì)胞或循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的募集。

本研究存在以下不足：(1)未對(duì)動(dòng)脈組織的炎癥反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，HE染色、CD31免疫組織化學(xué)染色的樣本量偏小。(2)側(cè)重于RSV對(duì)血管形態(tài)學(xué)、再內(nèi)皮化指標(biāo)和血管再生指標(biāo)的研究，忽略了血管炎癥相關(guān)指標(biāo)；后續(xù)研究需關(guān)注炎癥指標(biāo)，擴(kuò)大樣本量，減小誤差。(3)僅進(jìn)行了短期實(shí)驗(yàn)，未能闡述RSV對(duì)內(nèi)膜損傷血管修復(fù)的具體機(jī)制及RSV對(duì)血管的長(zhǎng)期作用，后續(xù)需進(jìn)行長(zhǎng)期的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)以分析可能的機(jī)制，為預(yù)防介入術(shù)后再狹窄提供新思路。

綜上所述，RSV可使大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后血管CD31和VEGF的表達(dá)增強(qiáng)，短期內(nèi)血管壁增厚，再內(nèi)皮化程度增強(qiáng)，具有修復(fù)血管內(nèi)皮的作用，其機(jī)制可能是促進(jìn)鄰近駐留內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及骨髓內(nèi)皮細(xì)胞或循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的募集。