羅蘭，熊穎，國奧，陳春意，夏韻，李靖凡，盧清，柯劍娟

武漢大學中南醫(yī)院麻醉科，武漢 430071

過去十年，由于藥物洗脫支架技術的進展[1]，短期內血管內再狹窄發(fā)生率逐年下降，但繼發(fā)的支架內再狹窄發(fā)生率上升[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，藥物洗脫支架破壞了內皮的功能和完整性，不利于內皮再生，從而造成內皮持續(xù)性炎癥、內皮化不完全、動脈愈合延遲，形成繼發(fā)的血栓相關血管內狹窄[3-4]。血管內膜增生過度亦可限制管腔血流，導致血管再狹窄[5]。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一種天然的植物多酚，具有抗癌、抗氧化、抗炎和抗過敏等多種有益特性[6-9]。RSV可將細胞阻滯在G1～S期，以劑量依賴的方式抑制平滑肌細胞(smooth muscle cell，SMC)增殖[10]，加速SMC凋亡[11]，最終減輕血管壁增厚引起的再狹窄。有研究報道，RSV在體外培養(yǎng)的人主動脈和肺動脈內皮細胞中可以時間和劑量依賴的方式抑制內皮細胞的增殖[12]，但關于其對受損血管內皮的修復作用研究較少。本研究采用頸總動脈球囊損傷大鼠模型，通過損傷段局部給藥的方式觀察體內環(huán)境下RSV對內皮及整個血管的修復作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RSV(純度≥99.8%)、F-127 Pluronic固體凝膠、DMSO溶液、4%多聚甲醛緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司；蘇木精染液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒(Ba1086)購自武漢百仟度生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒購自江蘇世泰實驗器材有限公司；小鼠抗CD31一抗(ab24590)購自英國Abcam公司；HRP標記的山羊抗小鼠二抗(5220-0341)購自美國SeraCare公司；兔抗人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)單克隆抗體(19003-1-AP)購自美國Proteintech公司；HRP標記的山羊抗兔IgG(074-1506)購自美國KPL公司。2F球囊導管購自日本泰爾茂有限公司；全自動數(shù)字玻片掃描與分析系統(tǒng)(型號Aperio VERSA8)購自上海徠卡生物系統(tǒng)有限公司；病理切片機(型號RM2016)購自上海徠卡儀器有限公司。

1.2 實驗動物及分組 40只健康雄性Sprague-Dawley大鼠購自北京斯貝福生物技術有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(京)2016-0001]，體重200～250 g，SPF級屏障環(huán)境下飼養(yǎng)于通風良好的武漢大學中南醫(yī)院動物實驗中心大鼠房內[相對濕度50%～60%、溫度(22±2) ℃]，自由飲食。適應性飼養(yǎng)2 d后，隨機分為假手術組、模型組、溶劑對照組(DSMO組)與RSV組，每組10只。大鼠所有手術均在1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉下進行，實驗結束后，用1%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)過量麻醉實施安樂死。動物實驗流程經(jīng)武漢大學中南醫(yī)院動物實驗中心審核和批準(WP2020-08121)。

1.3 頸總動脈球囊損傷大鼠模型制備 根據(jù)文獻[13]、[14]的方法制備頸總動脈球囊損傷大鼠模型。大鼠術前禁食禁水12 h后稱重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，頸部備皮消毒，正中縱向做3 cm左右切口，鈍性分離皮下組織，于左側斜方肌上方鈍性分離出頸總動脈，將其與伴行的迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)分離，動脈夾夾閉近心端，繼續(xù)向頸總動脈遠心端分離，直至頸內動脈及頸外動脈的分叉處遠心端約5 mm，結扎頸外動脈遠心端。在頸外動脈線結近心端橫向剪一小開口，將2F球囊導管從小口插入頸總動脈2.0～2.5 cm，向球囊內注氣約0.25 ml，并向外抽動球囊導管3次。在距頸總動脈分叉處約2 mm位置結扎頸外動脈近心端，使頸總動脈及頸內動脈恢復充盈搏動，即造模成功。

1.4 頸總動脈外膜給藥 參照文獻[14]，使用Pluronic凝膠方法進行頸總動脈給藥。將500 μg RSV溶于30 μl 10% DMSO中，然后與270 μl 25% F-127 Pluronic凝膠混合冰育。為避免RSV光異構化，將RSV、DMSO與F-127 Pluronic凝膠的混合物保存于鋁箔包裹的密封Eppendorf管中。

RSV組：在頸總動脈進行球囊血管成形術后，將含RSV的凝膠均勻涂在頸總動脈損傷段的外周，使其固化。DSMO組：將30 μl 10% DMSO與270 μl 25% F-127 Pluronic凝膠混合冰育，均勻涂在頸總動脈損傷段的外周，使其固化。給藥結束后，逐層縫合關閉術野。假手術組僅結扎頸外動脈，模型組僅行頸總動脈球囊損傷術，均不給藥。術后單獨飼養(yǎng)，常規(guī)飲食，自由飲水至第14天，用1%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)過量麻醉處死，取頸總動脈損傷段動脈組織，進行后續(xù)檢測。

1.5 HE染色觀察血管內膜增生程度和管腔狹窄程度 每組隨機挑選3只大鼠處死，取頸總動脈損傷段動脈組織，固定24 h、脫水、石蠟包埋。蠟塊以5 μm厚度做橫切面，置于60 ℃恒溫箱內烘干，常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色1 min，沖洗返藍，伊紅染色1 min，清洗后脫水、透明、封片，使用全自動數(shù)字玻片掃描與分析系統(tǒng)進行拍照。在橫截面切片上測量外膜以內區(qū)(EEL)面積及周長、內膜及內區(qū)(IEL)面積、管腔面積，內膜面積=(IEL面積－管腔面積)，中膜面積=(EEL面積－IEL面積)，使用ImageScope軟件進行分析。每個樣本取3個橫截面，取平均值。內膜增生程度由內膜面積與中膜面積的比值判定，比值越大表明內膜增生程度越重；管腔狹窄程度由管腔面積與IEL面積的比值判定，比值越小表明管腔狹窄程度越重。

1.6 CD31免疫組織化學染色評估血管再內皮化程度 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，修復抗原，洗滌，滴加BSA孵育30 min；加入小鼠抗CD31一抗(1:200)，4 ℃孵育過夜，PBS溶液(pH 7.4)洗滌；滴加HRP標記的山羊抗小鼠二抗(1:100)，室溫避光孵育50 min，PBS溶液(pH 7.4)洗滌；滴加DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色反應。顯色完全后，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍，脫水，封片，使用全自動數(shù)字玻片掃描與分析系統(tǒng)拍照，使用Barnes法進行評分，具體評分細則如下。A(細胞顯色有無及深淺評分)：0分(不著色)、1分(淺黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)；B(顯色細胞比例評分)：1分(1%～10%)、2分(11%～50%)、3分(51%～80%)、4分(>80%)。Barnes評分(分)=A×B。評分越高表明CD31表達水平越高。

1.7 Western blotting檢測頸總動脈組織中VEGF的表達水平 取大鼠頸總動脈損傷段組織，PBS漂洗后剪成小塊置于勻漿器中，加入RIPA總蛋白裂解液，冰浴徹底勻漿，4 ℃下13 000 r/min離心5 min，取上清。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度，上樣40 μg，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入兔抗人VEGF單克隆抗體(1:1000)4 ℃孵育過夜，洗滌后加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1:50 000)，室溫孵育30 min；加入ECL混合溶液，曝光、顯影、定影。使用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片進行拍照，用ImageJ軟件處理系統(tǒng)分析目標條帶的光密度值。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 RSV對頸總動脈球囊損傷模型大鼠血管內膜增生和管腔再狹窄的影響 H E 染色結果顯示，假手術組、模型組、DMSO組和RSV組EEL周長依次為(2776±104) μm、(2808±96) μm、(2794±61) μm、(2737±108) μm，EEL面積依次為(401 723±110 235) μm2、(427 645±51 249) μm2、(428 551±24 924) μm2、(409 668±155 414) μm2，I E L 面積依次為(2 9 7 9 8 9±1 0 4 6 0 5) μ m2、(299 906±38 691) μm2、(305 250±31 223) μm2、(2 8 0 2 5 9±1 5 3 2 6 2) μ m2，管腔面積依次為(290 240±104 463) μm2、(230 440±44 012) μm2、(288 568±35 384) μm2、(137 545±64 629) μm2，內膜增生程度依次為0.075±0.003、0.559±0.119、0.135±0.031、1.092±0.360，管腔狹窄程度依次為0.964±0.011、0.764±0.049、0.944±0.020、0.532±0.189。各組EEL周長、EEL面積及IEL面積比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組和DMSO組相比，RSV組管腔面積減小(P<0.05)。與假手術組相比，模型組和RSV組血管內膜增生程度加重(P<0.05)；與模型組相比，DMSO組血管內膜增生程度明顯減輕(P<0.05)；與DMSO組相比，RSV組血管內膜增生程度加重(P<0.05)。與假手術組相比，模型組和RSV組管腔狹窄程度加重(P<0.05)；與模型組相比，DMSO組管腔狹窄程度減輕(P<0.05)；與DMSO組相比，RSV組管腔狹窄程度加重(P<0.05)(圖1)。

圖1 RSV對頸總動脈球囊損傷模型大鼠血管內膜增生和管腔再狹窄的影響(n=3)Fig.1 Effect of RSV on intimal hyperplasia and restenosis of common carotid artery in balloon injured rats (n=3)

2.2 RSV對頸總動脈球囊損傷模型大鼠血管再內皮化的影響 CD31免疫組化陽性產(chǎn)物位于內皮細胞表面，呈棕褐色，代表血管內皮化的程度。如圖2A所示，假手術組內皮細胞連續(xù)性最好且均染為棕褐色；模型組內皮細胞連續(xù)性較差且70%的內皮細胞染色為棕黃色；DMSO組內皮細胞連續(xù)性較差，約80%的內皮細胞染色為棕黃色；RSV組內皮細胞連續(xù)性較好且90%的內皮細胞染色為棕褐色。Barnes評分結果顯示，假手術組、模型組、DMSO組和RSV組動脈組織Barnes評分依次為(12.00±0.00)分、(7.33±1.16)分、(8.67±3.06)分、(11.00±1.70)分。與假手術組相比，模型組動脈組織Barnes評分降低(P<0.05)；與模型組相比，RSV組動脈組織Barnes評分明顯增高(P<0.05，圖2B)。

圖2 RSV對頸總動脈球囊損傷模型大鼠血管再內皮化的影響(n=3)Fig.2 Effect of RSV on vascular reendothelialization in rats with common carotid artery balloon injury (n=3)

2.3 RSV對頸總動脈球囊損傷模型大鼠動脈組織中VEGF表達的影響 Western blotting檢測結果顯示，假手術組、模型組、DMSO組和RSV組動脈組織中VEGF的表達水平依次為0.72±0.13、0.31±0.12、0.38±0.18、0.67±0.18。與假手術組相比，模型組動脈組織中VEGF表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組和DMSO組相比，RSV組動脈組織中VEGF表達水平明顯增高(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組頸總動脈組織中VEGF蛋白相對表達量比較(Western blotting，n=6)Fig.3 Comparison of the relative expression level of VEGF protein in common carotid artery tissues (Western blotting, n=6)

3 討 論

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療引起血管損傷的過程較復雜，包括內皮剝脫、各種生長因子和細胞因子的釋放、血小板活化，以及平滑肌細胞增殖和遷移到內皮下間隙形成新內膜增生等[15-16]，最終導致靶血管再狹窄。相較裸金屬支架，藥物洗脫支架顯著降低了再狹窄發(fā)生率，但晚期(置入后>1年)血栓形成再狹窄的發(fā)生率卻有所增高[17]。涂覆在支架上抑制血管平滑肌細胞增殖的藥物也可抑制內皮細胞的增殖，延遲內皮的修復。藥物洗脫支架可在局部遞送高濃度的藥物，累積的藥物在血管支架內停留，延長了藥物抗增殖作用的時間，從而影響內皮的恢復和功能[18]。研究發(fā)現(xiàn)，血管內皮細胞為減少血栓形成、脂質吸收及減輕炎癥提供了有效的屏障[19]。內皮細胞功能喪失導致血小板的反應性增加，同時激活有絲分裂原，增加黏附分子和組織因子的表達，并減少血栓調節(jié)蛋白的產(chǎn)生，從而促進血栓形成，導致經(jīng)皮冠狀動脈介入治療后的內皮功能障礙和炎癥[20-22]。內皮再生是一種修復機制，用于維持正常血管功能的內皮單層完整性。在支架置入后，再生的內皮細胞可能在屏障完整性、細胞-細胞連接、血管通透性，以及抗氧化和抗血栓分子的表達等方面減弱[23-25]，而不成熟和無效的內皮細胞更容易發(fā)生血栓，從而導致管腔狹窄[26]。

本研究結果顯示，處理14 d，RSV使損傷的血管內膜增生，管腔狹窄明顯，再內皮化程度較其他處理組增強，未發(fā)生收縮性重構。相較假手術組，其余各組均有不同程度的內膜增生和管壁變厚，假手術組因未行球囊損傷術損傷內皮細胞，內皮最為完整，CD31免疫組織化學染色呈棕褐色且連續(xù)性最強。相較其他處理組，RSV處理過的血管損傷段CD31表達增加，表明RSV可增強受損血管的再內皮化程度。VEGF具有促進血管再生的能力，VEGF家族及其受體系統(tǒng)已被證實是血管新生細胞信號轉導中的基本調節(jié)劑[27]，VEGF表達增加表明RSV能增強內膜的再生能力和血管的新生能力。由此可見，短期內血管內膜增生、管腔狹窄并非病理性血管重構引起的狹窄，而是由RSV對血管內膜再生和再內皮化的修復作用造成的。值得注意的是，相較傳統(tǒng)的RSV給藥方式如腹腔注射和灌胃等，本研究采用經(jīng)頸總動脈外膜給藥，可使藥物精準高效地作用于頸總動脈損傷段，因此在兩周內即可觀察到明顯的效應，表明RSV在短期內確實能夠促進血管新生、內膜再生以及增強內皮化程度。再內皮化是修復受損血管的第一步，能加速受損區(qū)域內膜的恢復和預防血栓形成等并發(fā)癥，是預防遠期再狹窄的前提。

內膜損傷后，鄰近內皮剝脫區(qū)域駐留內皮細胞的增殖、遷移和源自骨髓的內皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)的募集可使內皮剝脫區(qū)域再內皮化[16]。駐留的內皮細胞增殖并從鄰近的完整節(jié)段遷移到受損節(jié)段，從而修復內皮屏障。循環(huán)內皮細胞(circulating endothelial cell，CEC)是一種成熟的細胞，在血管損傷后從血管壁脫落進入循環(huán)，到達內皮受損節(jié)段修復內皮[28-29]。正常情況下，CEC的數(shù)量非常低，但介入術后明顯增多，表明血管內支架誘導了內皮化[30]。EPC是骨髓中造血細胞的一種，為多能干細胞，在血流中循環(huán)，可分化成內皮譜系細胞[31]，在受傷的內膜處可發(fā)揮內皮再生的作用[32]。當EPC被動員到血管損傷部位時可形成一個循環(huán)細胞池，這些細胞可以填補內皮不連續(xù)的部位，修復受損的內皮[33]，加速再內皮化進程。由此推測，RSV修復血管的始動機制可能為促進鄰近駐留內皮細胞的遷移，或者增強對骨髓內皮細胞或循環(huán)內皮細胞的募集。

本研究存在以下不足：(1)未對動脈組織的炎癥反應進行評估，HE染色、CD31免疫組織化學染色的樣本量偏小。(2)側重于RSV對血管形態(tài)學、再內皮化指標和血管再生指標的研究，忽略了血管炎癥相關指標；后續(xù)研究需關注炎癥指標，擴大樣本量，減小誤差。(3)僅進行了短期實驗，未能闡述RSV對內膜損傷血管修復的具體機制及RSV對血管的長期作用，后續(xù)需進行長期的體內和體外實驗以分析可能的機制，為預防介入術后再狹窄提供新思路。

綜上所述，RSV可使大鼠頸總動脈球囊損傷術后血管CD31和VEGF的表達增強，短期內血管壁增厚，再內皮化程度增強，具有修復血管內皮的作用，其機制可能是促進鄰近駐留內皮細胞的增殖、遷移以及骨髓內皮細胞或循環(huán)內皮細胞的募集。