彭何濤，李木子，宋翠平，趙肖璟，趙思俊

（1.寧夏大學，寧夏銀川 750021；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

免疫佐劑（簡稱佐劑）能非特異性增強或改變機體對抗原的特異性免疫應答，目前常見的有礦物質佐劑、油佐劑、微生物佐劑、中草藥佐劑、細胞因子佐劑等[1]。人醫(yī)臨床常見MF59和AS系列油佐劑，獸醫(yī)臨床常見鋁膠佐劑、細胞因子佐劑和中草藥佐劑等[2]。上述傳統(tǒng)佐劑已被廣泛應用于臨床，并取得了較好的效果，但仍存在不良反應強等問題。因此，開展新型免疫佐劑研究對于提高機體免疫反應，獲得較高的抗體水平，同時降低毒副作用具有重要意義。近年來，新型的納米氫氧化鋁、納米磷酸鈣、納米金、殼聚糖、脂質體等佐劑被廣泛關注[3-5]。納米佐劑具有常規(guī)佐劑不可比擬的優(yōu)勢[6-7]：納米粒子表面經修飾后，可成功引入具有靶向性的配體或靶向到特定細胞的其他成份，使攜帶的免疫原有效運輸?shù)较鄳拿庖呒毎?；納米佐劑可提高免疫原穩(wěn)定性，減少免疫原用量，延長作用時間，且自身不具備免疫原性。因此納米佐劑是目前較為理想的免疫佐劑之一。

納米材料與傳統(tǒng)宏觀材料相比，具有較為特殊的物理化學表征，因而在生物醫(yī)藥、航空航天、資源環(huán)境等領域具有巨大的應用價值[8-9]。碳納米管作為一類重要的新型納米材料，具有最簡單的化學組成和原子結合形態(tài)，其尺度、結構、拓撲學因素以及和碳原子相結合的特性賦予了碳納米管極為獨特的性能，因而在力學、電學、磁學、光學、儲氫、熱學等方面具有優(yōu)異的性能，成為近些年備受關注的納米材料之一[6]。碳納米管可以通過物理吸附或化學耦聯(lián)等途徑與多種物質連接，因而成為多種藥物、基因、生物探針分子的新型載體[10]，可發(fā)揮良好的生物學效應。其中，碳納米管可與具有免疫原性的物質相連接，直接進入吞噬細胞或網狀內皮細胞[7]，誘發(fā)機體細胞免疫或體液免疫應答，產生特異性抗體，且碳納米管本身不具有免疫原性[11]，因此可起到免疫佐劑作用。該效應的發(fā)現(xiàn)，引起科研工作者的興趣并開展了深入研究。本文從碳納米管的基本性質、結構修飾、免疫機理及實際應用等幾方面綜述了其發(fā)揮免疫佐劑特性的研究進展。

1 碳納米管基本性質

碳納米管是日本電鏡專家Sumio Iijima于1991年通過高分辨率分析電鏡，從電弧法生產的碳纖維中發(fā)現(xiàn)的一種新型碳晶體[12]。它由含有六邊形網格狀的石墨片層卷曲而成，形成無縫納米管狀晶體（圖1）。根據(jù)其管壁層數(shù)可將其分為單壁碳納米管（single-walled carbon nanotube，SWCNT）和多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT）。SWCNT由單層圓柱形石墨層構成，直徑一般為0.4～2.5 nm，具有柔性和高度均一性特點；MWCNT根據(jù)制備條件不同而異，管壁層數(shù)從2～50層不等，直徑最大可達100 nm。碳納米管長度可在納米至數(shù)百微米之間變化[13]。碳納米管具有比表面積高[14]、化學穩(wěn)定性好、非特異性吸附能力強[15]、可穿過生物膜但不破壞細胞結構等多種特性[16-17]。科研工作者利用這些優(yōu)異的性能，在生物傳感器、藥物載體、腫瘤治療等生物學領域開展了積極的探索和研究。研究發(fā)現(xiàn)，碳納米管攜帶免疫原進入機體可激活補體系統(tǒng)[15]，促進吞噬細胞吞噬，增強機體免疫應答及提高特異性抗體水平[18-19]，這為免疫佐劑研發(fā)提供了新思路，從而引起了關注。

圖1 碳納米管結構示意圖[13]

2 作為免疫佐劑的優(yōu)勢

碳納米管結構中空多孔，又具有極高的比表面積，可以非特異性吸附多種藥物、基因、蛋白質等物質[15，20]，特別是多壁碳納米管在形成時，因管壁上通常布滿小洞樣的缺陷，層與層之間很容易形成陷阱中心而容納更多的生物活性分子[14]。體外研究[21]發(fā)現(xiàn)，碳納米管可與血漿中的多種蛋白發(fā)生非特異性吸附，且吸附過程不可逆。通過非共價鍵吸附蛋白等生物大分子于碳納米管表面或管腔內[22-23]，也可提高碳納米管的溶解性和生物相容性。這些方法可產生較為穩(wěn)定的碳納米管-免疫原復合物，為進入機體后發(fā)揮免疫佐劑作用提供了可靠保證。

然而，碳納米管自身具有很強的疏水作用，難以溶于水和有機溶劑，在溶液中常以團聚形式存在，因而降低了其比表面積利用率，影響其吸附各類生物分子的能力[24]。研究者在其表面進行化學修飾，連接了數(shù)量不等的各類化學基團[25-27]，這樣可以很好地改善碳納米管表面特性，增強其水溶性和組織相容性，更重要的是通過化學修飾可定向引入免疫原分子，形成穩(wěn)定的免疫原-碳納米管復合物，并突出免疫原的特征位點，更有利于獲得特異性抗體。Parra等[28]利用羧基化、酸堿中和及氧化還原反應，將牛血清白蛋白-嘧菌酯半抗原（BSA-azoxystrobin）連接至多壁和單壁碳納米管上，成功制備了針對嘧菌酯半抗原的免疫復合物，獲得了良好的免疫效果。除化學修飾外，依靠物理修飾，如在溶液中添加聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），十二烷基硫酸鈉（SDS）、TritonX-100等化學試劑[29]，也可增強碳納米管的分散性、溶解性和滲透性。

研究[10]發(fā)現(xiàn)，碳納米管可以進入細胞，且不破壞細胞膜結構，從而為抗原運輸和遞送提供了有利條件。而碳納米管進入免疫相關細胞是其作為免疫佐劑研究關注的重點。吞噬細胞表面表達模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）與病原生物表面的病原相關分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）相 互 識別、作用，這一過程是啟動先天性免疫應答的關鍵。Pondman等[11]報道了多種模式識別受體都具備識別納米顆粒的潛力，納米物質一旦結合至受體上，將會被吞噬細胞吞噬和清除。Meng等[30]采取經小鼠背部皮下注射多壁納米管方式，也觀察到了巨噬細胞吞噬碳納米管的現(xiàn)象。除吞噬作用（phagocytosis）外，碳納米管還可通過內吞作用（endocytosis）和跨細胞膜途徑直接進入吞噬細胞內，且細胞膜均能保持完好。Kam等[31]通過體外試驗發(fā)現(xiàn)，短的單壁碳納米管（長度為50～200 nm）可通過網格蛋白依賴的內吞作用進入細胞。Pantarotto等[32]研究表明，稍長的單壁碳納米管（長度為300～1 000 nm）在進入人和小鼠的成纖維細胞時表現(xiàn)出直接作用細胞膜的跨細胞行為。對碳納米管進行功能化修飾，可影響碳納米管與吞噬細胞的作用，如親水性或酸性聚合物包覆的多壁碳納米管比疏水性聚合物包覆的可更有效被巨噬細胞內吞[11]；經過聚乙二醇修飾的單壁碳納米管可穿透細胞膜進入宿主細胞，且不影響細胞生長。碳納米管進入細胞后，可以在細胞質、內質體中觀察到。也有在細胞核內觀察到的報道[11]。

3 應用及作用機制

Pantarotto等[18]于2003年首次證實氨基化單壁碳納米管可顯著提高抗口蹄疫病毒VP1肽段中和抗體的表達水平，且未檢測到機體產生針對碳納米管的特異性抗體，表明碳納米管具備免疫佐劑的特性。隨后多位科研工作者先后開展了有關碳納米管作用機體免疫應答的研究，并取得了一定進展。Pimentel等[33]發(fā)現(xiàn)，抗牛厭氧芽孢桿菌合成肽（Am1）與多壁碳納米管形成的納米復合物免疫后可顯著提高宿主抗Am1的IgG水平。Jia等[34]報道了單壁碳納米管可顯著提升大嘴鱸魚潰瘍綜合征病毒主要衣殼蛋白（MCP）制成的亞單位疫苗的免疫保護效率。邢杰等[35-36]通過體內及體外試驗發(fā)現(xiàn)，香菇多糖修飾的碳納米管可調節(jié)并提高機體免疫功能，增強免疫效果。有研究者證實，多壁碳納米管提高機體免疫應答的能力與弗氏佐劑相當[37]。與常規(guī)的腫瘤免疫治療相比，多壁碳納米管偶聯(lián)腫瘤相關蛋白進入機體可更有效促進抗腫瘤免疫的發(fā)生[7]，這為腫瘤免疫治療提供了思路。除大分子物質外，Parra等[28]還報道了羧基碳納米管能夠大大提升半抗原的抗體效價，同時還顯著降低免疫原劑量，有效節(jié)約成本。此外，單壁碳納米管還能延長DNA疫苗在體內的保留時間，并提高其表達水平，誘導更強的免疫應答[38]。有研究者將碳納米管當作人工抗原遞呈細胞（artificial antigen-presenting cells），功能化的單壁碳納米管可綁定并遞呈高濃度T細胞共刺激分子，如抗CD3分子和MHCⅠ類分子，隨后T細胞免疫應答被激活[7]。

目前，碳納米管增強機體免疫應答的確切作用機制尚未揭示。有研究者發(fā)現(xiàn)，皮下注射碳納米管可激活補體系統(tǒng)，改變碳納米管表面特性可增加或降低補體系統(tǒng)活化程度[39-41]，而不同的表面修飾可以將補體激活從一種途徑切換到另一種途徑[11]。碳納米管可影響抗原引起的免疫應答，調控Th細胞分化，主要誘導以體液免疫為主的Th2型免疫反應。但也有少量關于引起Th1型免疫反應的報道[42]。另外，Kagan等[43]通過體外和體內試驗發(fā)現(xiàn)，碳納米管通過與免疫細胞相互作用，激活核轉錄因子NF-κB和AP-1，從而增強氧化應激和細胞因子釋放，激活T細胞。經皮下注射的碳納米管蓄積于皮下組織，引起大量巨噬細胞對其吞噬，而吞噬了碳納米管的巨噬細胞隨循環(huán)系統(tǒng)遷移到淋巴結內，但未在心、肝、脾、腎等臟器中觀察到碳納米管蓄積，也未發(fā)現(xiàn)長期炎癥反應及明顯組織病變[30]，因而認為皮下注射是現(xiàn)階段碳納米管用于疫苗佐劑的最佳免疫途徑。

4 存在問題

碳納米管具有多種優(yōu)良特性，其在基因、藥物和疫苗等生物分子的運載方面具有極大的應用潛力，被科研工作者稱為“納米注射器”[7]。隨著對碳納米管生物學效應研究的深入，其毒理學特征也成為人們關注的焦點[7]。多位研究者發(fā)現(xiàn)，通過不同途徑（呼吸道灌注、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射）進入機體的碳納米管可出現(xiàn)在不同組織臟器中，并引起炎癥反應，其中經呼吸道途徑進入體內，可引起肺部組織腫瘤的發(fā)生[44-45]。Manna等[46]發(fā)現(xiàn)，碳納米管進入氣管后會造成肺部強烈的炎癥反應。多壁碳納米管經氣管進入大鼠體內，會逐漸跨過氣血屏障，在肝臟、腎臟和脾臟中蓄積[47]。靜脈注射碳納米管，導致碳納米管持續(xù)在脾臟、肺臟、肝臟中蓄積，而蓄積的碳納米管可引起細胞的氧化應激和凋亡[48]。也有大量數(shù)據(jù)顯示，碳納米管對機體的毒性與其結構、使用劑量、功能化修飾和給藥途徑有關。如：單壁碳納米管毒性顯著低于多壁碳納米管[49]；羥基化修飾的多壁碳納米管，對人肝癌細胞和人結腸癌細胞的毒性顯著低于不經修飾的多壁碳納米管[50]；功能化修飾后具有水溶性的碳納米管，可隨血液循環(huán)經過尿液排出，不產生蓄積和毒性作用[50]。由此可見，對碳納米管進行功能化修飾是解決碳納米管相關毒性效應的關鍵。

5 展望

碳納米管作為免疫佐劑方面的研究表明，其能發(fā)揮良好的佐劑效果，減少免疫原劑量，通過皮下免疫途徑可降低炎癥等不良反應，是優(yōu)良的候選佐劑之一。下一步，需對碳納米管最佳的功能化修飾方式、最適的免疫劑量及免疫毒性三方面進行深入研究，相信其結果的揭示，將為納米材料免疫佐劑的開發(fā)和應用帶來巨大的科研價值和廣闊的發(fā)展空間。