李 勉 ， 唐文娟 ， 蔡 雪 ，， 程新平 ， 柳志強(qiáng)

（1. 浙江華康藥業(yè)股份有限公司，浙江 杭州 310013；2. 浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

1 D-阿洛酮糖概述

D-阿洛酮糖（D-allulose）屬于己酮糖，是D-果糖的C-3 差向異構(gòu)體，因其較高的甜度和較低的能量以及獨(dú)特的生理功能和潛在的健康益處，D-阿洛酮糖被認(rèn)為是具有較大潛力的新型甜味劑，已成為全球范圍內(nèi)稀有糖生物合成領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 然而，D-阿洛酮糖在自然界中存在量極其稀少， 化學(xué)法合成困難，而生物合成法步驟簡單，近些年有較大的突破。 因此，作者綜述了D-阿洛酮糖在近年內(nèi)的生物合成研究進(jìn)展， 包括D-阿洛酮糖的理化性質(zhì)、生理功能、應(yīng)用、體內(nèi)代謝以及生物酶法生產(chǎn)涉及關(guān)鍵酶的來源、酶學(xué)性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理、異源表達(dá)、D-阿洛酮糖的分離與純化工藝。

1.1 D-阿洛酮糖的理化性質(zhì)與來源

D-阿洛酮糖是一種六碳糖，熔點(diǎn)為96 ℃，易溶于水，密度為1.35 g/cm3[1]。D-阿洛酮糖的甜味是蔗糖甜味的70%[2]。D-阿洛酮糖是一種還原糖，能夠參與熱處理過程中的褐變反應(yīng)。 經(jīng)大鼠實(shí)驗(yàn)測得D-阿洛酮糖的熱值為0.029 kJ/g， 能量為蔗糖的0.3%，這表明D-阿洛酮糖的能量近乎為零[3-4]。

D-阿洛酮糖在自然界中非常罕見，植物來源極其稀少[5]，在某些細(xì)菌中也有發(fā)現(xiàn)少量阿洛酮糖[6]，動物中不存在D-阿洛酮糖。然而，D-阿洛酮糖也出現(xiàn)在各種食品中， 如經(jīng)過長期加熱處理的果汁，并且D-阿洛酮糖在各類食品中的含量與生產(chǎn)過程中的糖濃度、溫度和加熱時間密切相關(guān)[2，7]。

1.2 D-阿洛酮糖的生理功能與體內(nèi)代謝

D-阿洛酮糖的生理功能包括： 減少膳食D-果糖和D-葡萄糖的吸收[8-9]；增強(qiáng)胰島素抵抗[7，10-11]；抗肥胖活性[12-14]；降血脂[15]。D-阿洛酮糖在大鼠體內(nèi)的代謝途徑研究表明：1）D-阿洛酮糖在腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體5 型介導(dǎo)， 其相對于D-果糖親和力較低[16-18]；2）D-阿洛酮糖不參與葡萄糖的相關(guān)代謝[19]；3）D-阿洛酮糖在動物肝臟中無法代謝，進(jìn)而無法促進(jìn)肝臟能量的產(chǎn)生[20]。大約98%的D-阿洛酮糖通過口服或靜脈注射后以尿液和糞便這兩種形式從體內(nèi)排出， 只有少量D-阿洛酮糖在盲腸微生物的作用下分解為短鏈脂肪酸[21]。

1.3 D-阿洛酮糖的應(yīng)用

D-阿洛酮糖在2011 年被美國FDA 批準(zhǔn)為“一般認(rèn)為安全的”（GRAS，Generally Regarded As Safe）產(chǎn)品，并被允許作為食品配料和膳食補(bǔ)充劑[4，7]。 研究表明，D-阿洛酮糖最大攝入量每天每千克體質(zhì)量為0.55 g，在此范圍內(nèi)不會導(dǎo)致人類腹瀉[8-9]。

D-阿洛酮糖因其低熱量、高甜度、還原性強(qiáng)等特性，在食品行業(yè)具有廣闊的市場潛力。例如，D-阿洛酮糖通過美拉德反應(yīng)可全面改善蛋清蛋白的性質(zhì)，如優(yōu)異的凝膠強(qiáng)度、乳化穩(wěn)定性、發(fā)泡性能和抗氧化活性等[22-23]。D-阿洛酮糖也可以改善發(fā)酵乳制品的品質(zhì)， 調(diào)節(jié)過度發(fā)酵導(dǎo)致酸奶帶有的強(qiáng)烈酸味，但不影響發(fā)酵菌株的益生菌活性及其賦予發(fā)酵產(chǎn)品的益生健康功效[21]。 另外，在烘焙過程中使用25%的D-阿洛酮糖，配合使用其他添加劑，可生產(chǎn)無糖蛋糕[24]。

D-阿洛酮糖在其他領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用潛力。例如， 以D-阿洛酮糖為原料的植物基材料可用作光學(xué)設(shè)備和液晶顯示器的永久性、防水、環(huán)保、透光薄膜[25]。D-阿洛酮糖還是第一種被發(fā)現(xiàn)的糖類驅(qū)蟲劑，在抑制寄生蟲生長方面有一些積極作用[26-27]。D-阿洛酮糖也是其他己糖的前體，對D-阿洛糖[28-29]、D-阿洛糖醇[30]的生產(chǎn)起著極其重要的作用。

2 D-阿洛酮糖的生產(chǎn)

2.1 生物酶法

D-阿洛酮糖的化學(xué)合成法具有分離困難、副產(chǎn)物多、化學(xué)廢物的產(chǎn)生等較難克服的共性缺點(diǎn)。 因此，綠色與環(huán)保的生物酶法生產(chǎn)逐漸受到了世界范圍內(nèi)廣泛的關(guān)注。

2.1.1 DTEase 家族酶的來源D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶家族（DTEases）是一種催化酮單糖C3 位置使其發(fā)生異構(gòu)化的酶，也是生產(chǎn)稀有糖的核心酶[32]。

DTEase 家族酶包括：D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶（D-tagatose 3-epimerase，DTEases）[33]，D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（D-allulose 3-epimerase，DAEase）[35]，酮糖 3-差向異構(gòu)酶（Ketose 3-epimerase）[36]，這些酶都具有共同特性即能夠催化D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖。

DTEase 酶的編碼基因已相繼從Clostridium cellulolyticumH10[37]、Ruminococcussp.[38]、Clostridium scindens[34]以及Desmosporasp.[35]中分離鑒定出來，但仍需要進(jìn)一步挖掘更多來源和更高效酶活的DTEase[32，37，39-40]用于D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

2.1.2 DTEase 的酶學(xué)性質(zhì) 在DTEase 家族酶中，D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶（DTEase）在催化D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的反應(yīng)中具有最高的效率。來自C. cellulolyticum和A. tumefaciens的 DAEases催化效率（Kcat/Km）分別為 186.4、205 L/（mmol·min），高于來自Clostridiumsp.的DTEase（D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶）的催化效率（141.4 L/（mmol·min））和來自Ruminococcussp.的催化效率（51 L/（mmol·min））[34，37-38]，見表1。

表1 DTEase 家族酶的酶學(xué)特性Table 1 Enzymatic properties of DTEases

金屬離子通過結(jié)合D-果糖進(jìn)行固定，在D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖過程中起著至關(guān)重要的作用。Asp183 和His209 殘基通過金屬離子與底物進(jìn)行有效結(jié)合。 DTEase 家族酶金屬離子Mn2+、Co2+和Mg2+的依賴程度明顯不同[41，44-45]。 然而，C.cellulolyticum中的 DAEase 和C. scindens中的 DTEase 酶活的發(fā)揮嚴(yán)格依賴于金屬離子 Mn2+和 Co2+[35，37]。

2.1.3 DTEase 的晶體結(jié)構(gòu) 在DTEase 家族酶中，來自A. tumefaciens和C. cellulolyticum中 DAEases展現(xiàn)出最緊密的四聚體形式。 在DAEase 的四聚體中， 氨基酸殘基在2 個亞基之間形成34 個氫鍵，DAEase 的高催化活性歸因于寬的界面溶劑可及區(qū)域， 這是由DTEase 家族酶中兩個二聚體之間的廣泛相互作用引起的[42]。 此外，重組菌株表達(dá)的DAEase 仍表現(xiàn)出優(yōu)異的酶學(xué)性能。 來自C. cellulolyticumH10 中的DAEase 異源表達(dá)具有較長的半衰期、較高的動力學(xué)參數(shù)和較高的熱穩(wěn)定性[37]。

DAEase 的四聚體排列是由 A、B、C、D 共 4 個相同亞基組成的一個不對稱單元。 活性位點(diǎn)含有4個殘基的金屬離子， 八面體配位2 個水分子。 這4個亞基是與晶體對稱相關(guān)的二聚體，其中亞基A 和D 相互作用， 兩者都與亞基 B 和 C 密切接觸。DAEase 的活性位點(diǎn)暴露在二聚體的同一前側(cè)。 這些穩(wěn)定的二聚體提供了一個很好的可接近表面，以便結(jié)合在二聚體正面上的底物[16]。

活性位點(diǎn)的疏水性溝槽和可接近的表面位于A亞基和B 亞基之間。 DAEase 的亞基側(cè)是封閉的，并在桶狀結(jié)構(gòu)的兩端暴露。在DAEase 的四聚體中，兩個二聚體是封閉在桶狀結(jié)構(gòu)側(cè)面。每個單體（A、B、C和 D 亞基）是由 8 個（β/α）結(jié)構(gòu)的重復(fù)單位組成。 每個單體由13 個α-螺旋和8 個β-折疊組成，形成單體的主要結(jié)構(gòu)[16]。

2.1.4 DTEase 的催化機(jī)理 DTEase 家族酶的催化作用取決于各亞基的分子排列，它們的活性位點(diǎn)位于底物上，以實(shí)現(xiàn)高效的酶反應(yīng)。Mn2+和2 個水分子及 4 個氨基酸（Glu、Asp、His 和 Glu）形成八面體配位，這4 個氨基酸殘基在所有酮糖3-差向異構(gòu)酶中完全保守。 來自A. tumefaciens中的 DAEase 和P.cichorii中的 DTEase 上的 6 個殘基（Glul50/Glul52、Aspl83/Aspl85、His209/His211、Glu244/Glu246、Glul56/ Glu158、His185/His188） 在位點(diǎn)定向誘變中對底物結(jié)合和熱穩(wěn)定性起著重要作用。

催化底物取代水分子后，活性位點(diǎn)發(fā)生差向異構(gòu)化。兩個殘基Glul50 和Glu244 在Mn2+的協(xié)作下，D-果糖C3 上的質(zhì)子被去除，生成D-阿洛酮糖的順式二元醇中間體，D-阿洛酮糖從DAEase 活性位點(diǎn)上的氫鍵和水分子之間的位置釋放出來。

目前， 對DTEase 家族酶進(jìn)行分子修飾以提高其催化活性和熱穩(wěn)定性。 定點(diǎn)誘變是為了提高來自Caldicellulosiruptor obsidiansis中的L-鼠李糖異構(gòu)酶在生產(chǎn)D-阿洛酮糖方面的熱穩(wěn)定性和催化行為， 在β1-α1-loop 中的疏水殘基被極性氨基酸全部取代， 與野生型酶相比，V48N/G59N/I63N 和V48N/G59N/I63N/F335S 突變體的相對活性分別提高了 105.6%、134.1%[57]。 定點(diǎn)誘變還提高了來自Doreasp. 中的D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶（DAEase）的熱穩(wěn)定性[50]。

對DTEase 家族酶的催化機(jī)理方面的研究還處于初步階段，酶結(jié)構(gòu)與催化功能之間的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。 此外，DTEase 的熱穩(wěn)定性和底物特異性仍存在一些不足。 在稀有糖的生產(chǎn)中，應(yīng)進(jìn)一步利用DTEase 家族酶的底物特異性， 以實(shí)現(xiàn)功能性稀有糖的高效綠色生產(chǎn)。

2.1.5 DTEase 的異源表達(dá) 大多數(shù)DTEase 家族酶從細(xì)菌中鑒定和分離，在天然菌株中表達(dá)的酶的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足應(yīng)用的要求。 因此，在特征研究和酶學(xué)應(yīng)用中構(gòu)建表達(dá)載體并在異源生物中表達(dá)具有重要意義。

枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和酵母通常被用來構(gòu)建DAEase 表達(dá)的重組系統(tǒng)。與大腸桿菌不同，枯草芽孢桿菌沒有外膜，其分泌的蛋白質(zhì)可以直接釋放到培養(yǎng)基中， 且枯草芽孢桿菌的安全性為食品級，分泌的蛋白質(zhì)中沒有摻雜熱源性脂多糖（內(nèi)毒素）。工程菌大腸桿菌E. coli具備遺傳背景清晰、載體受體系統(tǒng)完整、生長迅速、培養(yǎng)簡單、重組體穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。 此外，酵母表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)條件簡單、生長速度快、表達(dá)水平高、操作簡單等特點(diǎn)，翻譯后可對蛋白質(zhì)進(jìn)行加工和正確的修飾。 酵母表達(dá)系統(tǒng)的不足在于克隆基因表達(dá)低、發(fā)酵時間長、蛋白質(zhì)糖基化錯誤、抗細(xì)胞分裂等，且上清液中多糖濃度過高不利于重組蛋白質(zhì)的純化。

早期研究人員傾向于使用大腸桿菌作為宿主細(xì)菌來研究DTEase 家族酶的表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)[34，37]。最近，許多研究人員將枯草桿菌和酵母菌作為宿主細(xì)菌來表達(dá)DTEase 家族酶，用于D-阿洛酮糖的生產(chǎn)[35]。 將來源于A. tumefaciens中的 DAEase 基因于E. coli和K. marxianus中重組表達(dá)后用于阿洛酮糖生產(chǎn)，D-阿洛酮糖的產(chǎn)量分別達(dá)到230 g/L[53]和190 g/L[56]。 經(jīng)比較，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)A. tumefaciens中的DAEase 酶是目前為止表達(dá)量最高的，見表2。

表2 工程菌酶法生產(chǎn)D-阿洛酮糖Table 2 Bio-production of D-allulose by engineered strains

1）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有成本低以及表達(dá)效率高的優(yōu)點(diǎn)。DTEase 家族酶在大腸桿菌中可進(jìn)行可溶性過表達(dá)，用親和層析分離和純化重組的DTEase 酶，D-阿洛酮糖的產(chǎn)量在120~218 g/L，轉(zhuǎn)化率為24%~33%[34]。 利用全細(xì)胞反應(yīng)法在重組大腸桿菌中表達(dá)Agrobacterium tumefaciens中的DAEase 酶，其產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化效率分別為230 g/L和33%[53]。

2）芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)：攜帶DAEase 編碼基因的重組枯草芽孢桿菌能以高效率和低成本的方式過表達(dá)DAEase 酶。 固定于陰離子交換樹脂基質(zhì)上的重組DAEase 能夠促進(jìn)阿洛酮糖的穩(wěn)定高效生產(chǎn)。 在枯草芽孢桿菌B. subtilis中表達(dá)的重組DAEase 酶活為 58.6 U/mg，高于大腸桿菌（8.95 U/mg）。此外，DAEase 的表達(dá)調(diào)節(jié)元件也影響酶的數(shù)量和活性。 在枯草芽孢桿菌B. subtilis中， 載體pMA5-Pxy/A-RDPE 能持續(xù)性地表達(dá)出酶活 95 U/mL 的DAEase。 該 值 高 于 在 大 腸 桿 菌E.coli中 以pBluescript-SK-DTE為載體表達(dá)的酶活值[54]。

3）酵母表達(dá)系統(tǒng)：外源DAEase 基因可在重組S. cerevisiae[55]和Kluyveromyces marxianus[56]中 高 效表達(dá)。 攜帶來自A.tumefaciens的 DAEase 基因的pRS424-TEFpr-ss-xy/A 的表達(dá)載體可以在S. cerevisiaeAN120 中表達(dá)出相對分子質(zhì)量33 000的蛋白質(zhì)[55]。T. thermophilus中的木糖異構(gòu)酶基因和A. tumefaciens中的DAEase 基因在酵母孢子中共表達(dá)以增強(qiáng)協(xié)同催化作用。 將這兩種重組酶進(jìn)行固定化，并以D-葡萄糖為底物來生產(chǎn)D-阿洛酮糖[55]。重組木糖異構(gòu)酶催化D-葡萄糖轉(zhuǎn)化生成D-果糖，重組DAEase 將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖。 Yang 等人提供了一條有價值的途徑來再生改造過的K. marxianus細(xì)胞， 從而能夠以循環(huán)催化方式來生產(chǎn)D-阿洛酮糖[56]。重組的K. marxianus在 12 h 內(nèi)以底物質(zhì)量濃度為750 g/L 的D-果糖生產(chǎn)出190 g/L的D-阿洛酮糖， 約100 g 殘留的D-果糖被工程菌轉(zhuǎn)化為34 g 的乙醇。 此外，還通過全細(xì)胞反應(yīng)提供了以循環(huán)催化方式生產(chǎn)D-阿洛酮糖生產(chǎn)的想法[56]。

2.2 D-阿洛酮糖的分離與純化

D-阿洛酮糖的分離純化主要包括以下兩種方法：

第一種方法是離子交換樹脂。 采用陰離子交換樹脂基質(zhì)和同步移動床層析法對DAEase 酶進(jìn)行固定化，以D-果糖為底物生產(chǎn)D-阿洛酮糖。 采用離子交換樹脂透析法，R. sphaeroidesSK011 細(xì)胞能夠以初始底物質(zhì)量濃度為50 g/L 的D-果糖生產(chǎn)出6.5 g/L 的D-阿洛酮糖[39]，生產(chǎn)速率為 0.82 g-1·h-1。對于含有D-阿洛酮糖和D-果糖的混合系統(tǒng)，首先將D-果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸， 然后通過陰離子交換樹脂得到純度為91.2%的D-阿洛酮糖[57]。

第二種方法采用生物法純化D-阿洛酮糖。 在含有D-阿洛酮糖和D-果糖混合體系中，利用酵母消耗殘留的D-果糖生產(chǎn)乙醇，進(jìn)而得到D-阿洛酮糖。 此外，將滲透蒸發(fā)技術(shù)、陽離子交換色譜法和生物法相結(jié)合，對D-阿洛酮糖進(jìn)行分離純化，其純度可達(dá)86.2%[58]。

3 討 論

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3 差向異構(gòu)體，具有諸多生理功能，在食品、醫(yī)藥和保健等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。 2019 年4 月美國FDA 通過了將阿洛酮糖排除在添加糖和總糖計(jì)數(shù)外的利好措施后，各大企業(yè)開始對阿洛酮糖產(chǎn)生了極大的興趣。 目前，全球D-阿洛酮糖的主要生產(chǎn)商韓國希杰第一制糖株式會社、英國泰萊和日本松谷集團(tuán)都采用生物方法生產(chǎn)D-阿洛酮糖。 因此，構(gòu)建可催化產(chǎn)D-阿洛酮糖的基因工程菌是實(shí)現(xiàn)D-阿洛酮糖產(chǎn)業(yè)化的重要基礎(chǔ)。 盡管目前阿洛酮糖還只能在個別國家合法使用，但無疑它將成為未來甜味劑領(lǐng)域中的“巨星”。

盡管D-阿洛酮糖的生物酶法研究已經(jīng)取得了很大突破，尤其是基因挖掘和細(xì)胞構(gòu)建技術(shù)發(fā)展迅速， 但是生物法制備D-阿洛酮糖的工業(yè)化前景依然不容樂觀。 后續(xù)的研究可以從以下兩方面入手：1） 通過基因挖掘的方法篩選具有較高活性和較高穩(wěn)定性的DTEase 家族酶， 建立高效的高通量篩選法，對DTEase 家族酶進(jìn)行分子改造，使其更能滿足工業(yè)化的需求，從而實(shí)現(xiàn)D-果糖與D-阿洛酮糖的高效轉(zhuǎn)化；2） 由于工業(yè)上制備D-阿洛酮糖面臨著酶催化后的混合液中去除殘留D-果糖的問題，分離純化D-阿洛酮糖增加了其生產(chǎn)成本。 目前有關(guān)D-阿洛酮糖的分離純化、結(jié)晶等技術(shù)類的研究比較少，表明下游的產(chǎn)業(yè)化相對滯后，需要通過簡化下游的工藝步驟，如分離純化、結(jié)晶、干燥等工藝步驟進(jìn)一步降低D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)成本和提高D-阿洛酮糖的生產(chǎn)效率。

圖1 展示了較為先進(jìn)的D-阿洛酮糖綠色可回收的工藝技術(shù)[16]。整個反應(yīng)體系在生物反應(yīng)器A（用于蔗糖水解和D-阿洛酮糖酶法轉(zhuǎn)化） 和生物反應(yīng)器B（用于乙醇生產(chǎn)、D-阿洛酮糖分離和酵母增殖）之間進(jìn)行。 以未加工的甘蔗汁或甜高粱汁為原料生產(chǎn)蔗糖，使用的工程酵母菌含有天然的蔗糖酶和重組的外源DTEase 家族酶基因， 因此工程酵母能夠通過蔗糖酶水解蔗糖生產(chǎn)D-葡萄糖和D-果糖，D-果糖在55~60 ℃被DTEase 家族酶轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖，而剩余的D-葡萄糖和D-果糖在27~30 ℃被發(fā)酵生成乙醇，乙醇收集后可作為燃料使用。 該方法的優(yōu)點(diǎn)為原料成本低，盡可能利用過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)品，減少了繁瑣的分離純化步驟，同時減少了廢物形成，降低能耗，提高了糖產(chǎn)量。

圖1 D-阿洛酮糖的綠色、可回收的工藝技術(shù)路線Fig. 1 Green and recycling process for D-allulose conversion and ethanol production

4 展 望

目前在中國、日本、韓國、美國和英國，D-阿洛酮糖已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了噸級工業(yè)化生產(chǎn)。 生產(chǎn)D-阿洛酮糖的企業(yè)要在激烈的行業(yè)競爭中脫穎而出，必須提升工藝流程中各個環(huán)節(jié)的技術(shù)。 目前主要的生產(chǎn)壁壘在于異構(gòu)酶的活性不高、轉(zhuǎn)化率低和重復(fù)利用頻率低。 因此，提高酶活性、穩(wěn)定性和催化效率應(yīng)該是未來DTEase 家族酶研究和開發(fā)的關(guān)鍵目標(biāo)。 通過脫色、脫鹽、結(jié)晶、干燥等工藝的改進(jìn)，降低D-阿洛酮糖的生產(chǎn)成本。 采用高效的高通量篩選技術(shù)進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)或改變不合理的工藝是改變DTEase 家族酶結(jié)構(gòu)的直接途徑。 通過對DTEase 家族酶的改良和生產(chǎn)工藝的改進(jìn)， 可以降低D-阿洛酮糖的生產(chǎn)成本、降低其價格，從而保證D-阿洛酮糖能夠方便地供給廣大消費(fèi)者。