程 藝 ， 馬 超 ， 陳曉雨 ， 邵鈺晨 ， 王 瀟 ，楊雪麗 ， 蘇 蓉 ， 李婷婷 *

（1. 江蘇海洋大學 江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室， 江蘇 連云港 222005； 2. 江蘇省海洋生物產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005）

限制性核酸內切酶（簡稱“限制酶”）是現代基因工程中最基礎的一大類工具酶[1]。 天然來源的限制酶往往具有星號活性（即在非理想條件下限制酶的專一性發(fā)生改變）較強、反應緩沖體系不一致等缺陷，所以研究者對限制酶的研究和改造一直沒有停止[2]。 不同限制酶之間的序列同源性很低，基本無法通過同源序列分析來確定核心催化位點，因此解析限制酶蛋白質的三維結構和闡明限制酶的分子機制對后續(xù)定向改造具有重要的指導意義[3-4]。 然而，盡管目前已經發(fā)現了數千種限制酶，被商業(yè)化應用的限制酶也達到300 種左右，但迄今為止僅有50 余種限制酶的三維結構得到解析[5-8]。

大多數限制酶蛋白質相對分子質量小于70 000，適合采用X 射線晶體衍射法解析三維結構[9-10]。 由于限制酶具有切割DNA 的特性， 在對其進行重組表達時往往會使宿主DNA 被切割， 造成宿主菌的死亡，因此需要利用該限制酶對應的甲基化酶對宿主DNA 進行保護， 從而獲得重組限制酶的大量表達[11]。 另一方面，由于限制酶彼此之間序列同源性低，無法參考已有的限制酶晶體結構，使用分子置換法來推算晶體衍射的相位，只能采用同晶置換法或反常散射法[12]。 同晶置換法需要制備大量蛋白質晶體來摸索制備重原子衍生物的浸泡條件。 反常散射法在重組表達時制備蛋白硒代衍生物，通過在多個波長下收集硒原子邊緣的反常散射及其附近的衍射數據，從而推算晶體衍射相位[13-14]。 雖然硒元素對蛋白質的誘導及穩(wěn)定性均會產生不同程度的影響，硒代的效率也受諸多因素干擾[15]，但由于其操作方便，研究時會首先選擇反常散射法。 目前在大腸桿菌中表達硒代蛋白可以選擇甲硫氨酸缺陷型表達菌株，或者阻斷甲硫氨酸合成通路，利用外源硒代甲硫氨酸獲得硒代蛋白。

NcoI 是一種來源于珊瑚諾卡氏菌Nocardia corallina的Type II 類限制酶， 是常用的限制酶之一，迄今為止尚未有三維結構和分子機制相關的報道。 作者利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，重組表達了野生型NcoI 蛋白質和硒代NcoI 蛋白質， 并嘗試以坐滴法篩選晶體生長條件，為下一步解析NcoI 的三維結構、闡明其分子機制和定向改造提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BL21 （DE3）pLysS、B834 （DE3）pLysS 和 pET-28b 質粒載體： 購自武漢淼靈生物科技有限公司；λDNA、無縫克隆試劑盒等分子生物學試劑：購自莫納 （武漢） 生物科技有限公司；Ni 親和層析基質（Toyopearl AF）：購自東曹（上海）生物科技有限公司；UniGel-80Q：購自江蘇納微生物科技有限公司；HiLoad 16/60 Superdex 75pg 凝膠過濾預裝柱：購自美國GE 公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖：購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；蛋白質結晶條件篩選試劑盒：購自美國Hampton Research 公司；其余化學試劑均為國藥分析純。JN-02 細胞高壓破碎儀：購自廣州聚能生物科技有限公司；Beckman Avanti J-26s XP 離心機：購自 Beckman 公司；Invitrogen Qubit 4 熒光計：購自 Thermo Fisher Scientific 公司；恒溫晶體生長拍照儀：購自美國Formulatrix 公司。

1.2 方法

1.2.1NcoI 重組蛋白的載體構建 編碼II 型限制性內切酶NcoI 的基因序列（UniProt ID：O85489）和甲 基 化 酶NcoIM 的 基 因 序 列 （UniProt ID：A0A077QMR0）經人工合成，同時克隆至一個目標載體pET-28b。 將重組質粒pET28b-NcoI 通過熱激轉化法分別導入 BL21 （DE3） pLysS 和 B834（DE3）pLysS 感受態(tài)細胞。 因為pET-28b 載體上帶有卡那霉素的抗性基因， 而兩種表達菌株 BL21（DE3）pLysS 和 B834（DE3）pLysS 均自帶氯霉素抗性基因，所以經卡那霉素和氯霉素雙抗性LB 平板篩選，獲得NcoI 重組表達菌株 BL21 （DE3） pLysS-NcoI 和B834（DE3）pLysS-NcoI。

1.2.2NcoI 重組蛋白及其硒代蛋白的發(fā)酵NcoI重組蛋白的發(fā)酵：菌株 BL21（DE3） pLysS-NcoI 接種在LB 培養(yǎng)基中，經活化和擴大培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8，分別于 16、37 ℃加入 IPTG 誘導表達，IPTG濃度分別為0.1、0.5、1.0 mmol/L 進行最佳表達條件優(yōu)化。硒代NcoI 重組蛋白的發(fā)酵：菌株BL21（DE3）pLysS-NcoI 或者 B834 （DE3）pLysS-NcoI 在過渡培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基與M9 培養(yǎng)基比例為2∶8）中擴大培養(yǎng)至OD600為 0.6～0.8，后轉移菌體至M9 培養(yǎng)基中，補加硒代甲硫氨酸至質量濃度為0.05 g/L，在37 ℃適應性培養(yǎng) 15 min， 于 16 ℃加入 IPTG（0.5 mmol/L） 誘導表達 16 h。 菌株 BL21（DE3）pLysS-NcoI 在過渡培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8， 后轉移菌體至 M9 培養(yǎng)基中， 補加苯丙氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸至各質量濃度為0.1 g/L， 硒代甲硫氨酸0.05 g/L，在37 ℃適應性培養(yǎng) 15 min， 于 16 ℃加入 IPTG（0.5 mmol/L）誘導表達 16 h。

1.2.3NcoI 重組蛋白及其硒代蛋白的分離純化收集發(fā)酵菌體，用裂解緩沖液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，300 mmol/L NaCl） 重懸菌體并進行高壓破碎，然后在 4 ℃下于14 000 r/min 離心30 min，收集上清液。 上清液經鎳親和層析法初步純化后，進行SDS-PAGE 驗證是否有目的蛋白質表達條帶，然后用陰離子交換層析柱UniGel-80Q 進一步純化。 最后蛋白質經HiLoad 16/60 Superdex 75pg 凝膠過濾預裝柱分離，收集相應組分濃縮，進行SDS-PAGE驗證。 蛋白質質量濃度由Invitrogen Qubit 4 熒光計精準測定。 整個純化過程需要低溫環(huán)境。

1.2.4NcoI 蛋白及其硒代蛋白的質譜檢測 采用Agilent 6530 精確質量四極桿飛行時間（Q-TOF）液質聯(lián)用系統(tǒng) （美國 Agilent Technologies 公司）對NcoI 重組蛋白（1.5 mg/mL）和其硒代蛋白（1.5 mg/mL）進行分析鑒定。 HPLC 分離條件： 使用 Agilent Zorbax C18 色譜柱， 流動相是V乙腈∶V水∶V甲酸為2.0∶98.0∶0.1，柱溫 40 ℃，流量 1 mL/min，進樣量20 μL。 質譜檢測條件：電噴霧正離子掃描（ESI+），離子源溫度325 ℃，毛細管電壓3.5 kV，每隔0.33 s采集一次圖譜，質量掃描范圍m/z為680~1 140。 質譜檢測由中國科學院武漢物理與數學研究所完成。

1.2.5NcoI 蛋白及其硒代蛋白的酶活檢測 取NcoI 蛋白（10 μg/μL）和硒代蛋白（10 μg/μL）各1 μL，均以 0.3 μg λDNA 為底物，使用 CutOne 緩沖液（莫納（武漢）生物科技有限公司）配制成20 μL反應體系，37 ℃溫育15 min， 隨即高溫失活，1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測底物的酶切結果。

1.2.6NcoI 蛋白及其硒代蛋白結晶條件初篩 利用坐滴法對10 種蛋白質結晶條件篩選試劑盒（Crystal Screen HR2-112、Crystal Screen Lite HR2-128、Crystal Screen HR2-110、Crystal Screen 2 HR2-112、Index-HR2-144、StatRx-HR2-107、SaltRx 2-HR2 -109、Natrix -HR2 -116、PEGRx1 -HR2 -082、PEGRx2-HR2-084）進行初篩。NcoI 重組蛋白（純度＞95%）濃縮至10 mg/mL，將蛋白質溶液與結晶試劑按1∶1 比例混合，置于20 ℃恒溫晶體生長拍照儀中，每隔12 h 拍照記錄晶體生長情況。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體構建

限制性內切酶NcoI 特異性識別和切割CCATGG 位點，因此在大腸桿菌中重組表達會嚴重損害宿主DNA。 為避免重組表達的NcoI 蛋白質對宿主的傷害， 同時表達了NcoI 的甲基化酶（NcoIM）， 可以識別并甲基化NcoI 的切割位點，被甲基化的DNA 特異性識別位點受到保護， 從而避免限制性內切酶的切割。在載體pET-28b 上同時構建了NcoI 編碼基因和NcoIM 編碼基因，NcoI 編碼基因N 端帶有6×His 標簽序列，見圖1。將構建成功的 pET-28b（+）-NcoI 重組質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）pLysS 以及甲硫氨酸缺陷型菌株B834（DE3）pLysS 感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，提取質粒，經測序確定序列正確后，進行誘導表達。

圖 1 pET-28b（+）-NcoI 質粒圖譜Fig. 1 Schematic map of pET-28b（+）-NcoI plasmid

2.2 NcoI 重組蛋白的表達和純化

將構建成功的重組表達質粒通過熱激轉化法導入 BL21（DE3）pLysS 感受態(tài)菌株中，然后涂布于卡那霉素和氯霉素雙抗性的LB 平板上，37 ℃下倒置培養(yǎng)12 h 后，隨機挑選若干單克隆進行目的蛋白質的小量表達試驗。 通過構建的重組蛋白質的氨基酸序列預測蛋白質的相對分子質量，限制性內切酶NcoI 重組蛋白質的相對分子質量為34 500，SDSPAGE 檢測不同條件下蛋白質的表達情況及表達量。 結果顯示，NcoI 重組蛋白在 16 ℃、0.5 mmol/L IPTG 誘導表達時能獲得最多的可溶性蛋白質，且蛋白質大小與預期一致，后續(xù)以此條件進行蛋白質的大量表達，見表1。

表1 不同誘導條件下每升發(fā)酵產物NcoI 重組蛋白的表達量Table 1 Expression of recombinant protein NcoI per liter of fermentation product under different induction conditions

破碎后菌液上清液通過鎳親和層析后，經SDS-PAGE 分析，目的蛋白質存在于200 mmol/L 咪唑洗脫組分中，純度約80%，見圖2（a）。將含有目的蛋白質的組分進行透析除去咪唑，樣品通過陰離子交換層析柱UniGel-80Q 得到了純度約90%的目的蛋白質，見圖2（b）。 濃縮樣品后通過分子篩凝膠層析和SDS-PAGE 進行分析，所收集目的蛋白質的純度超過95%，滿足蛋白質結晶生長條件，見圖2（c）、（d），純化后重組NcoI 酶質量濃度約為7.5 mg/L。

圖2 重組NcoI 的表達與純化Fig. 2 Expression and purification of NcoI

2.3 NcoI 硒代蛋白的表達和純化

最常用硒代蛋白培養(yǎng)方法是利用甲氨酸缺陷型菌株，在培養(yǎng)基中引入硒代甲硫氨酸來置換重組蛋白質中的甲硫氨酸，其中大腸桿菌常用甲硫氨酸缺陷型菌株是B834[16]。 因此，作者先嘗試將構建成功的重組表達質粒轉化導入B834（DE3）pLysS 感受態(tài)菌株中，并進行目的蛋白質的小量表達試驗。 經SDS-PAGE 檢測， 未發(fā)現NcoI 重組硒代蛋白 （Se-NcoI）的表達條帶，見圖 3（a）。 該實驗表明，甲硫氨酸缺陷型菌株B834 不適合同時表達NcoI 重組蛋白和NcoIM 重組蛋白。 另外嘗試利用表達NcoI 重組蛋白的相同菌株 BL21（DE3） pLysS-NcoI，僅在發(fā)酵過程中添加了硒代甲硫氨酸、異亮氨酸等多種氨基酸，期望在抑制大腸桿菌甲硫氨酸本底合成的同時可以更好地利用外源硒代甲硫氨酸，從而獲得硒代NcoI（Se-NcoI）蛋白質。 對發(fā)酵產物的細胞裂解液進行SDS-PAGE 凝膠電泳檢測， 發(fā)現NcoI 重組硒代蛋白可以高效表達，Se-NcoI 蛋白質經過3 個純化步驟：Ni 親和層析、 陰離子交換層析和分子篩凝膠層析，純度超過95%，Se-NcoI 蛋白酶質量濃度約為 6 mg/L，見圖 3（b）、（c）。

圖3 重組Se-NcoI 的表達與純化Fig. 3 Expression and purification of Se-NcoI

重組蛋白的表達過程對外源添加的硒代甲硫氨酸的利用存在一定的概率，而且硒代甲硫氨酸對于大腸桿菌具有一定的毒性[17]，然而結果表明NcoI重組蛋白和Se-NcoI 蛋白酶濃度差別不大， 因此需要測定Se-NcoI 蛋白質中硒代甲硫氨酸的取代率。

2.4 重組NcoI 蛋白質及其硒代蛋白的質譜檢測

利用飛行質譜實驗， 對重組NcoI 蛋白和Se-NcoI 蛋白進行相對分子質量測定， 從而檢測Se-NcoI 蛋白質中甲硫氨酸是否被硒代甲硫氨酸取代。對重組NcoI 蛋白和Se-NcoI 蛋白進行質譜檢測，見圖4。 將所得數據按照如下公式計算出蛋白質相對分子質量。

式中：X1與X2為相鄰的質荷比，且X2＞X1。

經計算，重組NcoI 蛋白相對分子質量為34 510，與NcoI 理論相對分子質量 34 500 相符。 重組Se-NcoI 蛋白相對分子質量為34 744，與NcoI 蛋白質的相對分子質量差為234。 已知硒元素相對原子質量為78.96，硫元素相對原子質量為32.065，因此平均每分子Se-NcoI 蛋白質中被硒原子取代的硫原子數量為 234/（78.96-32.065）=4.99。 由于重組NcoI蛋白質的氨基酸序列中含有5 個甲硫氨酸，每個甲硫氨酸殘基包含1 個硫原子，可以推測本批Se-NcoI蛋白質中的甲硫氨酸已經全部被硒代甲硫氨酸取代，適合進行后續(xù)的反常散射實驗。

2.5 NcoI 蛋白質及其硒代蛋白的酶活檢測

在獲得重組NcoI 以及Se-NcoI 蛋白質之后，分別對其進行酶活力檢測，以驗證硒代蛋白是否與野生型蛋白質具有相同的生物學功能。 分別用10 μgNcoI 和 10 μg Se-NcoI 蛋白對 0.3 μg λDNA 進行15 min 快速酶切。 瓊脂糖凝膠電泳均能顯示出明顯的特征酶切條帶，見圖 5（a）。 這與 Thermo Fisher 公司網址中公布的NcoI 特征酶切條帶相似， 見圖5（b），表明被完全硒代的Se-NcoI 蛋白質與野生型蛋白質具有相似的生物學活性，即硒代并不影響NcoI蛋白質的結構。

圖 4 NcoI 和 Se-NcoI 質譜圖Fig.4 Serum mass spectrometry of NcoI and Se-NcoI

圖5 NcoI 與Se-NcoI 的酶切活力驗證Fig. 5 Digestion activity of NcoI and Se-NcoI

2.6 NcoI 蛋白質結晶篩選

將重組NcoI 蛋白和 Se-NcoI 蛋白濃縮至10 mg/mL，在20 ℃下通過坐滴法，采用10 種蛋白質結晶試劑盒篩選了528 種結晶生長條件。 樣品點樣后觀察，NcoI 在4 種條件下形成了初步的晶體。其中條件 a 為 0.1 mol/L 三水合醋酸鈉 （pH 4.6）、2.0 mol/L 甲酸鈉； 條件 b 為 0.1 mol/L 檸檬酸（pH 3.5）、25 g/dL PEG 3350； 條件 c 為 0.2 mol/L 硫酸銨、0.1 mol/L BIS-TRIS（pH 6.5）、 25 g/dL PEG3350；條件 d 為 0.8 mol/L 琥珀酸（pH 7.0）。 其中條件 a、b和c 下生長出的NcoI 蛋白質晶體呈針狀， 見圖6（a）、（b）、（c），條件 d 下生長出的蛋白質晶體呈顆粒狀，見圖 6（d），而 Se-NcoI 蛋白質在此條件下未形成結晶。

圖6 NcoI 的結晶條件的篩選Fig.6 Initial screening of crystallization conditions of NcoI

條件b 和c 得到的單晶脆弱，因此無法撈取完整晶體。 條件d 得到的單晶分辨率差，低于0.8 nm。條件a 得到的單晶獲得衍射圖樣見圖7， 晶體存在明顯各向異性，一個方向大約在0.36 nm，另一個方向大約在0.8~1 nm，需進一步優(yōu)化。

圖7 重組NcoI X-射線衍射圖Fig. 7 X-ray diffraction image of NcoI

3 討 論

目前， 限制酶NcoI 在PDB 蛋白質結構數據庫里沒有找到同源結構， 若通過X-射線晶體衍射的方法解析NcoI 結構，除了需要獲得NcoI 的晶體，還需利用NcoI 同源結構、同晶置換或者多波長散射的方法進行NcoI 的結構解析。通過在大腸桿菌中表達硒代甲硫氨酸取代甲硫氨酸的重組蛋白質[18]，結合多波長反常散射（MAD）的方法經過X 射線衍射可以收集到異常散射原子的邊緣及其附近的數據，能夠快速準確測定產生的相位角[19]，從而進行NcoI 的結構解析。

限制性內切酶NcoI 對大腸桿菌體內普遍存在的 DNA 甲基化酶基因dam和dcm均不敏感，若BL21（DE3）pLysS 菌株中只表達NcoI 重組蛋白，那么宿主DNA 會被NcoI 蛋白質嚴重破壞。而NcoI 對應的甲基化酶NcoIM 基因與限制性內切酶基因共表達，能夠使宿主DNA 獲得甲基化保護，從而實現了重組NcoI 的大量表達。

作者發(fā)現甲硫氨酸缺陷型菌株B834 不適合同時表達NcoI 重組蛋白和NcoIM 重組蛋白。 這可能是B834 菌株中的基因型影響了NcoI 重組蛋白或者NcoIM 重組蛋白的表達。 有研究表明，高濃度的異亮氨酸、賴氨酸和蘇氨酸能抑制天冬氨酸激酶活性，從而遏制大腸桿菌自身合成甲硫氨酸，且苯丙氨酸在此過程中起到協(xié)同作用[20]。因此，嘗試利用同樣表達NcoI 重組蛋白的菌株BL21 （DE3） pLysSNcoI，僅在發(fā)酵過程中添加了硒代甲硫氨酸、異亮氨酸等多種氨基酸，期望在抑制大腸桿菌甲硫氨酸本底合成的同時， 可以更好地利用外源硒代甲硫氨酸，從而獲得硒代NcoI（Se-NcoI）蛋白質。 經質譜分析發(fā)現，硒代蛋白的相對分子質量與未硒代蛋白相差234， 符合硒原子取代5 個硫原子所增加的相對分子質量。 因此判斷Se-NcoI 蛋白質中的5 個甲硫氨酸全部被硒代甲硫氨酸取代。 盡管硒代法適用于大多數原核表達的蛋白質，但是硒代甲硫氨酸容易氧化，并且會取代能夠增強蛋白質穩(wěn)定性的甲硫氨酸，導致硒代蛋白活性降低[21]。 作者對NcoI 及其硒代蛋白進行酶活驗證，發(fā)現NcoI 及其硒代蛋白都能消化底物λDNA， 且二者活性類似， 從而推測Se-NcoI 與NcoI 蛋白質在結構上類似。 作者采用在普通菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硒代甲硫氨酸及相關氨基酸的實驗方案， 能夠獲得完全硒代的NcoI 蛋白質，無需特殊的甲硫氨酸缺陷型表達菌株，這也為獲得其他限制性內切酶硒代蛋白表達提供了參考。

X-ray 衍射法需要高質量的蛋白質晶體， 而且晶體的生長與否依賴于蛋白質純度的高低。 獲得蛋白質結晶的關鍵步驟是經過蛋白質高效表達以及分離純化出純度大于95%的蛋白質，但是蛋白質結晶條件的初步篩選沒有規(guī)律，一般需要蛋白質結晶條件篩選試劑盒進行高通量篩選[22]。 作者使用了10種蛋白質結晶試劑盒，共計528 個條件，對NcoI 的蛋白質結晶條件進行了初篩，所得NcoI 晶體衍射的分辨率為0.8 nm 左右。分辨率低可能是因為蛋白質穩(wěn)定性較差， 或者均一性差。 后續(xù)將進一步優(yōu)化NcoI 的蛋白質構建和結晶條件， 篩選NcoI 的DNA配體， 并在此基礎上繼續(xù)進行硒代Se-NcoI 的晶體生長，進一步精細優(yōu)化條件，以獲得能產生良好衍射效果的蛋白質以及蛋白質-DNA 復合物晶體，解析NcoI 的三維結構， 以闡明NcoI 特異性識別并切割DNA 的機制。

4 結 語

作者利用限制性內切酶NcoI 和甲基化酶NcoIM 的大腸桿菌共表達體系， 獲得了大量表達的限制性內切酶NcoI， 其純度＞95%， 酶質量濃度為7.5 mg/mL。 同時，通過在基礎培養(yǎng)基M9 中添加高濃度的異亮氨酸、賴氨酸和蘇氨酸等，抑制大腸桿菌自身合成甲硫氨酸， 提高硒代甲硫氨酸的利用率，獲得了重組NcoI 硒代蛋白。 另外，NcoI 的完全硒代對活性無影響。通過結晶條件初篩得出NcoI 的蛋白質結晶條件，初步獲得衍射分辨率為0.8 nm 的NcoI 晶體，為后續(xù)分析結構活性位點、闡明分子機制、進行定向改造、獲得高效和無星號活性的突變蛋白質奠定基礎。