陳金定

王 媛1,2

毛立科1,2

劉錦芳1,2

高彥祥1,2

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 中國(guó)輕工業(yè)健康飲品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

在飲料無菌灌裝技術(shù)中，對(duì)飲料包裝材料殺菌處理是飲料加工過程中不可缺少的一部分。傳統(tǒng)的包材殺菌方式分為濕法殺菌和干法殺菌，濕法殺菌是指采用過氧乙酸對(duì)包裝容器進(jìn)行噴淋，或?qū)ζ可w進(jìn)行浸泡殺菌，殺菌后需要用無菌水將瓶子及瓶蓋沖洗至過氧乙酸含量0.5 mg/kg 以下[1-2]，該方法殺菌效率高，但容易造成溶劑殘留，且需要用大量無菌水沖洗，能耗較高。干法殺菌是指采用氣態(tài)過氧化氫通過破壞微生物外部結(jié)構(gòu)，使微生物細(xì)胞滲透壓改變而死亡，同時(shí)破壞微生物細(xì)胞內(nèi)部DNA使其死亡而實(shí)現(xiàn)殺菌作用[3-4]，無需水洗，節(jié)約水資源，但有消毒劑殘留的風(fēng)險(xiǎn)，且熱能消耗較大[5]。

脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)作為一種新型非熱物理殺菌技術(shù)[6]，最早用于醫(yī)療器械表面殺菌和透明藥劑溶液殺菌等[7]，是利用惰性氣體閃光燈在紫外光、可見光和紅外光的頻率范圍內(nèi)(200～1 100 nm)產(chǎn)生瞬時(shí)、高功率的強(qiáng)廣譜脈沖光輻射[8]，通過破壞微生物細(xì)胞中的 DNA、細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)，從而使細(xì)胞失去生物活性，實(shí)現(xiàn)食品表面、設(shè)備表面以及食品包材上微生物的快速滅活[9-10]，是一種無毒、低熱、無副產(chǎn)物的新型殺菌技術(shù)，與紫外殺菌等其他物理殺菌方式相比，具有較高的殺菌效率[11]。

脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，如肉制品[8,12-13]、蔬菜[14-15]、乳制品[16]、谷物[17-18]、堅(jiān)果[19]、果汁[20-22]、食品包裝材料[23-24]等殺菌，但在飲料包裝材料的殺菌應(yīng)用研究以及殺菌效果驗(yàn)證相對(duì)較少，現(xiàn)有研究中，僅檢索到嚴(yán)杰能等[9]通過對(duì)脈沖光殺菌技術(shù)關(guān)鍵影響因素進(jìn)行優(yōu)化，得到利用脈沖光對(duì)包裝飲用水瓶蓋殺菌的最佳條件；江蘇新美星包裝機(jī)械股份有限公司[25]發(fā)明了一款PET空瓶的脈沖強(qiáng)光殺菌裝置，通過在傳送星輪上方設(shè)置脈沖強(qiáng)光系統(tǒng)和反射系統(tǒng)，采用脈沖強(qiáng)光對(duì)PET空瓶進(jìn)行滅菌，將脈沖強(qiáng)光滅菌方式應(yīng)用于PET瓶殺菌，但并未對(duì)其殺菌效果進(jìn)行驗(yàn)證。萎縮芽孢桿菌又稱枯草芽孢菌黑色變種，是芽孢桿菌屬的一個(gè)重要種，中國(guó)食品和包裝機(jī)械工業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CFPMA 0020—2021《PET瓶無菌灌裝生產(chǎn)線無菌性驗(yàn)證規(guī)范》提出，一般采用具有棕色典型菌落特征，性能穩(wěn)定的萎縮芽孢桿菌作為無菌性驗(yàn)證中的指示菌。研究擬采用脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)，對(duì)HDPE材質(zhì)飲料瓶蓋進(jìn)行殺菌，考察其殺菌效果，以期為脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)在無菌灌裝技術(shù)中的應(yīng)用及推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瓶蓋1：高密度聚乙烯(HDPE)材料，直徑38 mm，重量3.1 g，北京匯源飲料食品集團(tuán)；

瓶蓋2：HDPE材料，直徑28 mm，重量2.4 g，北京匯源飲料食品集團(tuán)；

芽孢懸液：ATCC9372萎縮芽孢桿菌，濃度1×109CFU/mL，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；

TSA培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

氯化鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

吐溫80：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

MCE過濾膜：0.45 μm，愛西默科技(上海)有限公司；

洗脫液：8.5 g NaCl加0.1 g吐溫80，溶于1 L水中，121 ℃滅菌20 min；

脈沖強(qiáng)光輻照裝置：FD2000型，輸出電壓1 320 V，閃頻能量1 850 J/閃頻，荷蘭Pulsed Light Power BV公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

三聯(lián)薄膜過濾裝置：FB-43型，泰安佰博儀器有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-III型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

超凈工作臺(tái)：BBS-DDC型，濟(jì)南鑫貝西生物科技有限公司；

生化培養(yǎng)箱：LRH250型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液稀釋 將芽孢桿菌的芽孢懸液(芽孢濃度為1×109CFU/mL)用無菌水梯度稀釋至所需濃度，待用。

1.2.2 材料準(zhǔn)備及接種

(1) 準(zhǔn)備：瓶蓋及對(duì)應(yīng)的瓶胚放置在超凈工作臺(tái)中紫外線滅菌60 min，接種前用75%乙醇水溶液浸泡30 min后置于超凈工作臺(tái)中晾干，待用[26]。其他所需材料，如離心管、移液槍槍頭、濾杯、玻璃滴管等放入滅菌鍋滅菌后備用。

(2) 接種：用噴霧接種器吸取100 μL 所需濃度的芽孢懸液接種至瓶蓋上，輕輕晃動(dòng)，使懸液均勻分布于瓶蓋內(nèi)部，置于超凈工作臺(tái)中晾干，用無菌袋密封，待用[20]。

1.2.3 接菌數(shù)量 每個(gè)瓶蓋接種設(shè)定數(shù)量的芽孢菌液，理論接菌數(shù)量即瓶蓋上芽孢桿菌的初始菌落數(shù)梯度為1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×10 CFU，實(shí)際接菌數(shù)量按照空白對(duì)照樣品接種后，培養(yǎng)計(jì)數(shù)、計(jì)算所得數(shù)量。每個(gè)樣品做3組平行[27]。

1.2.4 脈沖強(qiáng)光輻照試驗(yàn)

(1) 照射距離對(duì)瓶蓋殺菌效率的影響：脈沖電壓為1 320 V，脈沖閃爍次數(shù)為5次時(shí)，分別測(cè)定照射距離為7，14，21，28 cm時(shí)對(duì)瓶蓋上芽孢桿菌的殺菌效率。

(2) 脈沖強(qiáng)光閃爍次數(shù)對(duì)瓶蓋殺菌效率的影響：脈沖電壓為1 320 V，照射距離為7 cm時(shí)，分別測(cè)定脈沖閃爍次數(shù)為1，5，10，15次時(shí)對(duì)瓶蓋上芽孢桿菌的殺菌效率。

空白對(duì)照樣品接種后不進(jìn)行脈沖強(qiáng)光輻照。

1.2.5 殺菌效果驗(yàn)證 根據(jù)文獻(xiàn)[28]并作部分修改，方法如下：

(1) 洗脫：將50 mL洗脫液分3次加入已進(jìn)行無菌處理的瓶胚中，蓋上瓶蓋后劇烈搖晃2 min，洗脫瓶蓋上的芽孢桿菌，合并3次洗脫液，根據(jù)接菌數(shù)量估算稀釋倍數(shù)，將所需體積的洗脫液采用膜過濾裝置進(jìn)行過濾，如產(chǎn)生泡沫，加入100 mL無菌水至濾杯助濾，取下濾膜，放入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基平板(90 mm平板，預(yù)置無菌培養(yǎng)基)。

(2) 培養(yǎng)與計(jì)數(shù)：過濾之后的濾膜放置培養(yǎng)皿中，放入(37±2) ℃培養(yǎng)箱，24 h后計(jì)數(shù)。

空白對(duì)照按照同樣洗脫方法進(jìn)行洗脫，稀釋過濾后培養(yǎng)，平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，即為實(shí)際初始菌落數(shù)。

(3) 殺菌效率計(jì)算[29]：

(1)

式中：

SE——?dú)⒕?指示菌經(jīng)過殺菌后菌落數(shù)對(duì)數(shù)遞減值)，log；

N0——?dú)⒕拔⑸锞淇倲?shù)(空白對(duì)照樣品接種后，培養(yǎng)計(jì)數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算)，CFU；

N——?dú)⒕笪⑸锞鋽?shù)量，CFU。

(4) 理論最大殺菌效率：理論最大殺菌效率為將瓶蓋上所有芽孢桿菌完全殺滅時(shí)的殺菌效率，如初始菌落數(shù)為1×107CFU，理論最大殺菌效率為7 log，初始菌落數(shù)為1×105CFU，理論最大殺菌效率為5 log。

(5) 數(shù)據(jù)處理及分析：每個(gè)樣品均設(shè)3次重復(fù)，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，處理間平均數(shù)的比較用最小顯著差數(shù)法。圖形繪制采用Origin 9.1繪圖軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 照射距離對(duì)瓶蓋的殺菌效率

由圖1可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，不同接菌數(shù)量條件下，脈沖強(qiáng)光的照射距離與芽孢桿菌的殺菌效率呈負(fù)相關(guān)，且照射距離為7 cm時(shí)殺菌效率顯著高于(P<0.05)照射距離為14 cm 及21 cm時(shí)的，說明在相同的條件下，縮短脈沖強(qiáng)光的照射距離能夠有效提升對(duì)芽孢桿菌的殺菌效率，這是由于照射距離越近，脈沖強(qiáng)光的光熱和光化學(xué)效應(yīng)越強(qiáng)，對(duì)微生物的殺滅效果越好[30]，而距離越遠(yuǎn)脈沖強(qiáng)光在腔內(nèi)經(jīng)過光的折射、反射等一系列過程，損失部分能量，導(dǎo)致殺菌效率降低[17,27]。趙天慧等[30]優(yōu)化了脈沖強(qiáng)光對(duì)枯草芽孢桿菌致死工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)照射距離為6 cm 時(shí)，致死率較高，照射距離超過6 cm，對(duì)枯草芽孢桿菌的致死效果顯著下降，與試驗(yàn)結(jié)果一致。

對(duì)于不同接菌數(shù)量的瓶蓋，相同殺菌條件下，瓶蓋上初始菌落數(shù)量越多，殺菌效率越高，殺菌效果越好，可能是由于初始菌落較多的情況下，細(xì)菌更易凝聚成團(tuán)，凝聚成團(tuán)的細(xì)胞受到的磁場(chǎng)作用增強(qiáng)，細(xì)胞膜更易于破裂[31-32]，且單位面積的菌落數(shù)越多，脈沖強(qiáng)光的有效輻射量越大，故瓶蓋上初始菌落數(shù)量越多時(shí)，顯示出較高的殺菌效率，菌落數(shù)較少時(shí)，菌落分散，有效輻射量相對(duì)減少，故殺菌效率相對(duì)較低[33]。但隨著瓶蓋上初始菌落數(shù)量的增加，在最短照射距離條件下，實(shí)際殺菌效率與理論最大殺菌效率差距越大，越難將瓶蓋上所有芽孢桿菌全部殺滅。當(dāng)初始菌落數(shù)為1×107CFU，照射距離為7 cm，38 mm瓶蓋的殺菌效率最高可達(dá)4.87 log，28 mm瓶蓋的殺菌效率最高可達(dá)4.71 log。當(dāng)初始菌落數(shù)為1×10 CFU時(shí)，試驗(yàn)范圍內(nèi)的所有脈沖強(qiáng)光條件均能將瓶蓋上的芽孢桿菌全部殺滅；初始菌落數(shù)為1×102CFU時(shí)，對(duì)于38 mm瓶蓋，照射距離為7 cm及14 cm均能將芽孢桿菌完全殺滅，21 cm照射距離則無法完全將其殺滅，對(duì)于28 mm瓶蓋，照射距離為7 cm能夠?qū)⒀挎邨U菌完全殺滅，14 cm及21 cm照射距離則無法完全將其殺滅；隨著初始菌落數(shù)的增加，所選試驗(yàn)條件下的脈沖強(qiáng)光均無法將初始芽孢桿菌完全殺滅。

在相同脈沖強(qiáng)光輻照條件下，38 mm瓶蓋殺菌效率隨原始菌落數(shù)量級(jí)的變化趨勢(shì)與28 mm瓶蓋殺菌效率變化趨勢(shì)一致，且相同條件下，對(duì)38 mm瓶蓋殺菌效率高于28 mm瓶蓋，可能是由于38 mm瓶蓋表面積大，芽孢桿菌單位面積菌落數(shù)低于28 mm瓶蓋，更易于被殺滅。

2.2 脈沖強(qiáng)光閃爍次數(shù)對(duì)瓶蓋的殺菌效率

由圖2可以看出，相同條件下，脈沖強(qiáng)光閃爍次數(shù)增加，對(duì)瓶蓋上芽孢桿菌的殺菌效率隨之增加，且閃爍次數(shù)為10次時(shí)，殺菌效率顯著高于(P<0.05)閃爍5次及閃爍1次時(shí)的殺菌效率，表明脈沖強(qiáng)光能夠有效殺滅瓶蓋上的芽孢桿菌，且隨著脈沖閃爍次數(shù)的增加，釋放的光化學(xué)及光熱效應(yīng)逐漸累積，使其對(duì)芽孢桿菌的殺菌效率增加[30,34]。Cheigh等[35]研究脈沖強(qiáng)光對(duì)固體培養(yǎng)基上L.monocytogenes的殺菌影響，殺菌效率與脈沖閃爍次數(shù)呈正相關(guān)，隨脈沖閃爍次數(shù)的增加，殺菌效率增加。

對(duì)于不同初始菌落數(shù)的瓶蓋，相同閃爍次數(shù)下，殺菌效率隨初始菌落數(shù)的變化趨勢(shì)與相同照射距離條件下的變化趨勢(shì)一致，均為隨著初始菌落數(shù)的增加，殺菌效率逐漸增加。當(dāng)初始菌落數(shù)為1×10 CFU時(shí)，試驗(yàn)范圍內(nèi)的所有脈沖強(qiáng)光條件均能將瓶蓋上的芽孢桿菌全部殺滅；初始菌落數(shù)為1×102CFU時(shí)，閃爍次數(shù)為5次及10次均能達(dá)到理論最大殺菌效率，即將芽孢桿菌完全殺滅，閃爍1次時(shí)則無法完全將其殺滅；當(dāng)初始菌落數(shù)為1×103CFU，脈沖閃爍10次能夠?qū)?8 mm瓶蓋上的芽孢桿菌完全殺滅，達(dá)到理論最大殺菌效率，其他條件下則無法將其完全殺滅。

圖1 照射距離對(duì)不同初始菌落數(shù)瓶蓋的殺菌效率

圖2 閃爍次數(shù)對(duì)不同初始菌落數(shù)瓶蓋的殺菌效率

在相同脈沖閃爍次數(shù)時(shí)，38 mm瓶蓋殺菌效率隨原始菌落數(shù)的變化趨勢(shì)與28 mm瓶蓋殺菌效率變化趨勢(shì)一致，且對(duì)38 mm瓶蓋殺菌效率高于28 mm瓶蓋，這與不同照射距離時(shí)的變化趨勢(shì)一致。

3 結(jié)論

研究表明，脈沖強(qiáng)光對(duì)HDPE材料的飲料瓶蓋上芽孢桿菌殺菌效率受初始菌落數(shù)、脈沖照射距離、脈沖閃爍次數(shù)等因素的影響，隨著初始菌落數(shù)越高、照射距離越短、閃爍次數(shù)越多，殺菌效率越高。在照射距離7 cm，閃爍次數(shù)10次，最高可將1×103CFU的芽孢桿菌完全殺滅，較高的初始菌落數(shù)條件下，則無法將瓶蓋上的芽孢桿菌完全殺滅。考慮飲料瓶蓋在生產(chǎn)過程中，微生物數(shù)量一般較低，控制在1×10 CFU，故脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)可以應(yīng)用于飲料無菌灌裝過程中HDPE瓶蓋的殺菌，但在實(shí)際生產(chǎn)過程中的應(yīng)用效果，以及工藝、裝備等相關(guān)技術(shù)仍需進(jìn)一步開發(fā)及驗(yàn)證。此外，包材殺菌是PET無菌灌裝過程中的重要步驟，包括PET瓶坯/瓶子及瓶蓋的殺菌，由于瓶坯/瓶子較深，而脈沖強(qiáng)光的穿透性相對(duì)較弱，因此，如何將脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)有效地應(yīng)用于PET無菌灌裝技術(shù)中包材的殺菌還需進(jìn)一步探究。