任廣泉

許志凌云2

劉金秋2

徐春雨杭2

夏 寧2

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)際足球教育學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130000；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130000)

玉木耳(Auriculariacornea)為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心團(tuán)隊(duì)馴化的新型木耳品種，現(xiàn)已在東北地區(qū)大面積推廣，同時(shí)山東、浙江、廣西等地也有栽培[1]。玉木耳因其潔白的子實(shí)體也備受人們關(guān)注，由于其富含蛋白、多糖、膳食纖維等活性成分，備受消費(fèi)者喜愛[1-3]。大量研究[4-8]證明，植物來(lái)源多糖具有提高免疫力、抗氧化、抗癌等生理活性。已有研究[9]證實(shí)玉木耳多糖具有一定的抗氧化活性，但未見關(guān)于玉木耳多糖抗疲勞活性相關(guān)的報(bào)道。

疲勞是指由于機(jī)體運(yùn)動(dòng)而引起的運(yùn)動(dòng)能力和機(jī)體功能暫時(shí)下降的現(xiàn)象，其發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，與糖脂代謝異常、細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)等相關(guān)[10]。已有研究證實(shí)，人參多肽[11]、黃秋葵多糖[12]、黑參多糖[13]、南瓜多糖[14]、蝦青素[15]、枸杞多糖[16]、巴戟天多糖[17]等膳食活性成分具有顯著的抗疲勞作用。研究擬以昆明小鼠為研究對(duì)象，在正常飲食中加入玉木耳多糖(AuriculariacorneaPolysaccharides，AP)，觀察其添加量對(duì)小鼠抗疲勞能力的影響，旨在為進(jìn)一步開發(fā)適合運(yùn)動(dòng)員的抗疲勞功能飲料提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性KM小鼠：體重16～18 g，許可證編號(hào)SCXK(遼)2020-0001，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。

1.2 材料與試劑

玉木耳多糖(AP)樣品：總多糖含量為85.32%，水分含量為10.54%的，蛋白質(zhì)含量為4.14%，于2020年3月由實(shí)驗(yàn)室采用水提醇沉法制備；

全血乳酸(BLA)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：A019-1-1)、血清尿素氮(BUN)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：C013-2-1)、糖原檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：A043-1-1)、超氧化物酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：A001-3-2)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：A005-1-2)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：A003-1-1)：南京建成生物工程研究所；

人參北芪膠囊(GB)：江西銀濤藥業(yè)有限公司；

其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)酶標(biāo)儀：FLUOstar Omega型，德國(guó)BGM Labtech公司；

高速冷凍離心機(jī)：Allegra X-30R型，美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.4 試驗(yàn)方法

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組(Control，n=30)、AP低、中、高劑量組(AP50、AP100、AP200，n=20)、藥物對(duì)照組(GB，n=20)，所有組別均飼喂普通飼料，空白對(duì)照組每日灌胃蒸餾水，AP低、中、高劑量組每日分別灌胃50，100，200 mg/kg AP(溶劑為蒸餾水)，藥物對(duì)照組每日灌胃GB(200 mg/kg)，連續(xù)灌胃4周，每周測(cè)量體重。4周后，每組提供10只用于力竭游泳試驗(yàn)。Control組抽10只小鼠作為無(wú)游泳對(duì)照組(NS)，末次喂食30min后處死；每組另外10只游泳30min處死，收集血清、肝臟和肌肉組織，進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)[18]。

1.4.1 體重測(cè)定與計(jì)算 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，記錄各小鼠體重，為小鼠的初始體重。灌胃處理后，每周在同一時(shí)間段分別對(duì)小鼠進(jìn)行稱重、記錄，用于分析小鼠體重增長(zhǎng)情況，并按式(1)計(jì)算體重增加量。

m=m2-m1，

(1)

式中：

m——體重增加量，g；

m2——末次體重，g；

m1——初始體重，g。

1.4.2 力竭游泳試驗(yàn) 根據(jù)陳輝等[15]的方法并修改。每組隨機(jī)抽取10只小鼠，最后一次灌胃30 min后，于尾部負(fù)5%體重的鉛塊，置于游泳箱(水深不少于30 cm，水溫控制在25 ℃)中進(jìn)行試驗(yàn)，至小鼠完全沉入水底且10 s內(nèi)不再浮起作為試驗(yàn)終點(diǎn)，記錄力竭游泳時(shí)間。

1.4.3 血乳酸、血清尿素氮的測(cè)定 每組10只小鼠在最后一次灌胃30 min后，不負(fù)重置于游泳箱中游泳30 min(水溫25 ℃，水深不少于30 cm)，眼眶取血，分離血清用于血清尿素氮及抗氧化指標(biāo)的測(cè)定；15 min后采尾部靜脈血測(cè)定血乳酸，采用BLA、BUN試劑盒進(jìn)行檢測(cè)[19]。

1.4.4 糖原含量測(cè)定 取血后將小鼠處死，立即取出肝臟和后腿肌肉組織，根據(jù)試劑盒方法分別檢測(cè)肝糖原和肌糖原的含量。

1.4.5 抗氧化指標(biāo)檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)小鼠血清和肝臟組織的MDA、SOD、GSH-Px水平。

1.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graphpad Prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行one-way ANOVA 統(tǒng)計(jì)分析并作圖。與NS組相比，##為差異極顯著(P<0.01)；與Control組相比，*為差異顯著(P<0.05)、**為差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小鼠體重的影響

由圖1可知，連續(xù)灌胃4周后，各組小鼠體重?zé)o顯著差異。因此，50～200 mg/kg的AP對(duì)雄性KM小鼠體重?zé)o影響。此外，在給予受試物期間，小鼠并無(wú)不良反應(yīng)，毛色正常，并未出現(xiàn)異常死亡現(xiàn)象，說(shuō)明AP在50～200 mg/kg 劑量?jī)?nèi)對(duì)小鼠并未發(fā)現(xiàn)毒副作用。因此，該劑量范圍可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

由圖2可知，隨著AP劑量的增加，小鼠力竭游泳時(shí)間增加，尤其是AP100和AP200處理組能夠顯著延長(zhǎng)力竭游泳時(shí)間(P<0.05)。AP200處理組的力竭游泳時(shí)間略低于GB組，可達(dá)到91.5 min，較Control組(70.1 min)提高了30.5%，具有極顯著差異(P<0.01)。疲勞是人在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的一種系統(tǒng)性的生理過(guò)程，是機(jī)體的一種自我保護(hù)反應(yīng)[10]。小鼠力竭游泳時(shí)間可以較好地反映小鼠的抗疲勞能力，劉雅娜等[20]研究也發(fā)現(xiàn)沙棘多糖低、中、高劑量組負(fù)重游泳時(shí)間比空白組分別延長(zhǎng)了33.51%，58.89%，55.35%。綜上，AP可延長(zhǎng)小鼠的力竭游泳時(shí)間，表現(xiàn)出了一定的抗疲勞能力。

圖1 AP對(duì)小鼠體重的影響

圖2 AP對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

2.3 對(duì)小鼠BUN和BLA的影響

機(jī)體在長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)后會(huì)造成乳酸累積，BLA水平升高，肌肉產(chǎn)生酸痛感從而加重疲勞感；BUN水平增高說(shuō)明機(jī)體已經(jīng)產(chǎn)生疲勞感，因此二者水平的升高會(huì)降低小鼠運(yùn)動(dòng)耐性[12-13]。由圖3可知，與NS組相比，游泳組(Control組)小鼠血清中BUN和BLA水平均顯著升高(P<0.05)，表明通過(guò)強(qiáng)制游泳會(huì)使小鼠產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象，成功建立疲勞模型。在小鼠不負(fù)重游泳30 min后，AP50處理組和Control組的BUN、BLA含量無(wú)顯著差異，但是AP100和AP200處理組小鼠血清中的BUN、BLA含量顯著低于Control組(AP100，P<0.05；AP200，P<0.01)。綜上，AP能夠減少運(yùn)動(dòng)疲勞導(dǎo)致的BUN、BLA積累，從而提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐性，起到抗疲勞作用。

2.4 對(duì)小鼠血肝糖原和肌糖原的影響

由圖4可知，游泳30 min后，AP50、AP100、AP200處理組小鼠的肝糖原含量均顯著高于Control組(P<0.01)，尤其是AP200處理組，其肝糖原含量為(13.13±1.32) mg/g，是Control組的1.5倍。AP100和AP200處理組小鼠的肌糖原含量顯著高于Control組(P<0.01)。綜上，AP處理組可顯著增強(qiáng)肝臟和肌肉組織中的糖原儲(chǔ)備，且在一定劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴性，具有一定的抗疲勞能力。何立佳[21]研究發(fā)現(xiàn)，松茸多糖在5～15 g/kg劑量范圍內(nèi)，以劑量依賴性顯著增加肝糖原水平，說(shuō)明松茸多糖能夠顯著降低機(jī)體運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的疲勞。食源性真菌多糖如香菇、木耳等多糖均能夠顯著提高大鼠或小鼠運(yùn)動(dòng)前后體內(nèi)糖原儲(chǔ)備[22]。研究[23]發(fā)現(xiàn)，黑木耳多糖對(duì)力竭游泳時(shí)間、血乳酸、糖原水平有顯著而積極的影響，能夠有效延緩疲勞產(chǎn)生并消除疲勞。

2.5 對(duì)小鼠抗氧化能力的影響

劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)引起機(jī)體的自由基水平升高，此時(shí)迫切需要抗氧化因子SOD、GSH-Px等對(duì)其進(jìn)行清除；而丙二醛(MDA)是自由基攻擊不飽和脂肪酸的代謝產(chǎn)物，代表了體內(nèi)自由基的水平[24-27]。

圖3 AP對(duì)小鼠BUN和BLA水平的影響

圖4 AP對(duì)機(jī)體糖原水平的影響

由圖5可知，50～200 mg/kg的AP可顯著降低血清和肝臟組織中的MDA含量(P<0.01)，緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。100～200 mg/kg的AP可以顯著提升血清中SOD和GSH-Px活性(P<0.01)。與血清指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果相似，AP處理可以顯著提高肝臟組織中的SOD和GSH-Px活性，且呈一定的劑量依賴性。綜上，AP能夠通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力、清除機(jī)體內(nèi)的自由基來(lái)幫助減少自由基的傷害，從而提升機(jī)體的抗疲勞能力。

圖5 AP對(duì)小鼠MDA 、SOD和GSH-Px的影響

3 結(jié)論

運(yùn)動(dòng)會(huì)引起機(jī)體疲勞，加速全血乳酸的堆積，積聚量越大，機(jī)體越疲勞；血清尿素氮水平可用于判斷機(jī)體承受負(fù)荷的能力。隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的增加，機(jī)體內(nèi)糖原水平不斷下降，自由基含量不斷增加，因此增加糖原的儲(chǔ)備，清除自由基能夠有效延緩疲勞狀態(tài)[10,27]。試驗(yàn)表明，玉木耳多糖在一定劑量范圍內(nèi)可顯著提升小鼠力竭游泳時(shí)間，通過(guò)增加肝糖原和肌糖原的儲(chǔ)備、抑制血清中乳酸和尿素氮的堆積以及降低機(jī)體自由基水平來(lái)提高小鼠運(yùn)動(dòng)耐性、緩解機(jī)體氧化應(yīng)激水平，從而提升小鼠的抗疲勞能力。后續(xù)可進(jìn)一步研究玉木耳多糖發(fā)揮功能活性的明確組分及分子機(jī)制。