戴建成,陳輝,張津京,郝海波,韓燦燦,趙明文,馮志勇*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點實驗室/國家食用菌工程技術(shù)研究中心,上海 201403)

斑玉蕈Hypsizygusmarmoreus(Peck)H. E. Bigelow又名玉蕈,俗稱真姬菇、蟹味菇等,屬于傘菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomataceae)玉蕈屬(Hypsizipussinger)。斑玉蕈是北溫帶一種優(yōu)良的食用菌。斑玉蕈味比平菇鮮,肉比滑菇厚,質(zhì)比香菇韌,口感極佳,還具有獨特的蟹香味,在日本有“香在松口蘑、味在玉蕈”之說。斑玉蕈有防止便秘、抗癌、防癌、提高免疫力、預(yù)防衰老、延長壽命的獨特功效。作為大眾消費的食品,其貨架期長,是一種低熱量、低脂肪的保健食品[1]。

斑玉蕈生產(chǎn)周期通常為100～120 d,約為金針菇和杏鮑菇生產(chǎn)周期的2倍,生產(chǎn)效率相對較低,這個問題是影響其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加適量的MgSO4、KCl和NaCl對斑玉蕈菌絲生長具有一定的促進作用[2];在培養(yǎng)基中添加適量的葉酸、煙酸、維生素B1和維生素B2,對斑玉蕈菌絲生長具有一定的促進作用,其中葉酸的促進作用最強,煙酸次之[3]。肥皂草素具有抑制斑玉蕈的營養(yǎng)生長、促進斑玉蕈原基發(fā)生與發(fā)育以及縮短斑玉蕈培養(yǎng)周期的作用[4-5];外源添加曲酸可以提高漆酶和纖維素酶活性,增強菌絲對木質(zhì)纖維素的利用,為斑玉蕈子實體生長發(fā)育提供更多的能源,從而增加子實體產(chǎn)量[6]。郝海波[7]發(fā)現(xiàn)添加富氫水不僅能夠有效提高斑玉蕈子實體的產(chǎn)量,而且縮短菌絲的后熟期并促進原基的形成。然而,皂苷和曲酸都是化學(xué)試劑,存在安全隱患。富氫水價格相對昂貴,成本過高。因此,這些都不是增加斑玉蕈產(chǎn)量的理想添加劑。

L-抗壞血酸是一種必需的營養(yǎng)素,在多種羥基化反應(yīng)和維持包括線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在內(nèi)的細胞器中的氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]?？箟难崾谴呋疍NA去甲基化的11個易位雙加氧酶的輔助因子[9]?？箟难?維生素C的還原形式)能清除生理上相關(guān)的活性氧和氮物質(zhì)[10]。L-抗壞血酸可以減少非自由基物質(zhì),并再生循環(huán)抗氧化分子,如維生素E[11]。L-抗壞血酸能促進多巴胺、去甲腎上腺素、血管加壓素和血管升壓素的合成,還可作為膠原蛋白合成輔助因子促進傷口愈合[12]。適量的L-抗壞血酸能夠使心情愉悅[13]。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)當斑玉蕈菌絲生長時間為80 d時,外源添加L-抗壞血酸可以增強菌絲的抗氧化能力,促進損傷的菌絲恢復(fù)并提高其產(chǎn)量。

本文主要探究通過外源添加L-抗壞血酸,觀察斑玉蕈40和120 d的菌絲中抗氧化物質(zhì)含量及相關(guān)酶活性的變化,從不同培養(yǎng)時期驗證L-抗壞血酸是否有增強菌絲的抗氧化能力,促進損傷的菌絲恢復(fù)并提高其產(chǎn)量的類似作用。該研究為今后研究斑玉蕈子實體發(fā)育并提高其生產(chǎn)效率奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及試劑

斑玉蕈(SIEF3133)由中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心上海食用菌分中心提供,為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所選育的工廠化栽培菌株。按照上海光明森源生物科技有限公司斑玉蕈工廠化標準進行栽培生產(chǎn),具體試驗栽培流程參照劉明廣等[15]的方法。L-抗壞血酸(AsA)購于上海生工生物技術(shù)有限公司,AsA、MDA測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所,其他試劑盒均購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗設(shè)計及處理

工廠化斑玉蕈栽培中使用的栽培瓶大小為1 100 mL,瓶中的栽培料量為(870±50)g。處理組是在搔菌后向栽培料內(nèi)添加15 mL 400 mg·L-1AsA;對照組向搔菌后栽培料內(nèi)添加15 mL蒸餾水。以上每種處理重復(fù)試驗16瓶,放入工廠菇房里,嚴格按照工廠化生產(chǎn)要求管理。分別于菌絲恢復(fù)期(H-M)、菌絲轉(zhuǎn)色期(H-V)、原基期(H-P)和子實體期(H-F)取樣,用藥匙取5 g左右的栽培料放入取樣袋里,并用訂書機封好袋口,每個時期取4瓶,每瓶取6個樣。樣品立即放入液氮罐冷凍20 min,然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。在斑玉蕈出菇期間采收子實體,統(tǒng)計產(chǎn)量。

1.3 斑玉蕈菌絲細胞內(nèi)AsA含量的測定

取保存在-80 ℃冰箱中培養(yǎng)40和120 d的斑玉蕈菌絲樣品,在研缽中用液氮充分研磨后,分別精確稱取0.1 g,加入1 mL提取液,充分混勻,放置15 min后于4 ℃、3 500 r·min-1離心10 min。收集上清液置于冰上,用TECAN Infinite 200 PRO型多功能酶標儀測定AsA含量。

1.4 斑玉蕈菌絲細胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)含量的測定

取保存在-80 ℃冰箱中培養(yǎng)40和120 d的斑玉蕈菌絲樣品,在研缽中用液氮充分研磨后,分別精確稱取0.1 g,加入1 mL提取液進行冰浴勻漿。4 ℃、8 000 r· min-1離心10 min,取上清液置冰上待測。用多功能酶標儀測定還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量。

取保存在-80 ℃冰箱中培養(yǎng)40和120 d的斑玉蕈菌絲樣品,在研缽中用液氮充分研磨后,分別稱取 1 g 放入10 mL的離心管中,另加9 mL 0.9%的生理鹽水。4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min,取上清液用于測定。用多功能酶標儀測定丙二醛(MDA)含量。

1.5 斑玉蕈活性氧(ROS)含量的測定

取保存在-80 ℃冰箱中培養(yǎng)40和120 d的斑玉蕈菌絲樣品,在研缽中用液氮充分研磨后,稱取約 0.1 g 組織,加入1 mL提取液進行冰浴勻漿;轉(zhuǎn)移至EP管中,定容至1 mL,4 ℃、8 000 r·min-1離心10 min,取上清液置冰上待測。用多功能酶標儀測定H2O2含量。

1.6 斑玉蕈抗氧化酶活性的測定

取保存在-80 ℃冰箱中培養(yǎng)40和120 d的斑玉蕈菌絲樣品,在研缽中用液氮充分研磨后,稱取約 0.1 g 組織,加入1 mL提取液進行冰浴勻漿。4 ℃、8 000 r·min-1離心10 min,取上清液置冰上待測。上清液稀釋2倍。用多功能酶標儀測定谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)的活性。

1.7 數(shù)據(jù)處理與方法

所有試驗數(shù)據(jù)均為平均值±標準差,每個試驗3次生物學(xué)重復(fù),并使用GraphPad Prism 6.0處理數(shù)據(jù)和圖表。通過單向方差分析(ANOVA)結(jié)合Duncan’s的多范圍檢驗來分析處理之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-抗壞血酸(ASA)對斑玉蕈子實體產(chǎn)量的影響

在菌絲培養(yǎng)時間分別為40和120 d時,添加400 mg·L-1AsA顯著增加斑玉蕈子實體產(chǎn)量(圖1)。菌絲培養(yǎng)120 d時斑玉蕈子實體產(chǎn)量為265.23 g,是菌絲培養(yǎng)40 d時產(chǎn)量的2.80倍。外源添加AsA后,菌絲培養(yǎng)40 d時AsA處理組的斑玉蕈產(chǎn)量為104.01 g,比對照組增加10%(P<0.05);當菌絲培養(yǎng)時間為120 d時,處理組產(chǎn)量為278.49 g,比對照組增加5%(P<0.05)。這說明外源添加AsA后,可以顯著提高斑玉蕈子實體產(chǎn)量,且不同培養(yǎng)時間菌絲的增產(chǎn)效率差異顯著。

圖1 外源添加L-抗壞血酸(AsA)對不同培養(yǎng)時間斑玉蕈菌絲子實體產(chǎn)量的影響Fig.1 The effects of addition of L-ascorbic acid(AsA)on the fruiting body production ofHypsizygus marmoreus during different mycelial growth period CK. 對照組;AsA. 添加L-抗壞血酸的試驗組。不同小寫字母表示不同處理在0.05水平差異顯著。下同。CK. Control;AsA. Experimental group using ascorbic acid as additive. The different lowercase letters mean significant difference during treatment at 0.05 level. The same as follows.

2.2 外源添加AsA對斑玉蕈內(nèi)源L-抗壞血酸含量的影響

由圖2可知:當斑玉蕈菌絲培養(yǎng)時間為40 d時,處理組和對照組內(nèi)源AsA含量在斑玉蕈不同發(fā)育時期呈先上升后下降的趨勢。處理組中,AsA含量在H-V時最大,顯著高于對照組,在H-M時AsA含量最低。對照組中,AsA含量在H-P時最大,H-F時AsA含量最低。在菌絲培養(yǎng)時間為120 d時,處理組中 AsA含量在H-M時最大,在H-F時其含量最低;對照組AsA含量在H-V最大,在H-F時AsA含量最低。

圖2 外源AsA對不同發(fā)育時期斑玉蕈內(nèi)源AsA含量的影響Fig.2 Effects of exogenous AsA on endogenous AsA content in different developmental stages of Hypsizygus marmoreus H-M. 菌絲恢復(fù)期Mycelial regeneration stage;H-V. 菌絲轉(zhuǎn)色期Mycelial pigmentation stage;H-P. 原基期Primordium stage;H-F. 子實體期Fruiting stage. 下同。The same as follows.

2.3 外源添加AsA對不同發(fā)育時期斑玉蕈還原型谷胱甘肽(GSH)含量的影響

由圖3可知:在菌絲培養(yǎng)40 d時,處理組GSH在H-P時含量最大,其在H-F時含量最低。對照組GSH含量在H-P時最大,在H-V時含量最低。外源添加AsA顯著增加H-V時GSH含量。在此時期,處理組GSH含量顯著低于對照組,而在H-P和H-F時處理組和對照組無顯著差異。當菌絲培養(yǎng)時間為 120 d 時,處理組和對照組的GSH合成規(guī)律都呈先增加后降低的趨勢,在H-V時含量最大,在H-F時含量最低。這說明在菌絲培養(yǎng)時間為40 d時,AsA主要作用于菌絲轉(zhuǎn)色期。外源添加AsA可顯著增加H-M時120 d菌絲胞內(nèi)的GSH含量,這說明在菌絲培養(yǎng)時間為120 d時,外源添加AsA可通過調(diào)控菌絲恢復(fù)過程影響子實體的發(fā)育。

圖3 不同發(fā)育時期斑玉蕈菌絲細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)含量Fig.3 Content of reduced glutathione(GSH)in mycelium cells during different developmental stages

2.4 外源添加 AsA對不同發(fā)育時期斑玉蕈氧化型谷胱甘肽含量(GSSG)的影響

由圖4可知:在菌絲培養(yǎng)40 和120 d時,細胞內(nèi)GSSG含量都呈先升高后降低趨勢,在H-V時GSSG含量最大,在H-F時GSSG含量最低,但是培養(yǎng)120 d的菌絲GSSG含量總體比培養(yǎng)40 d的菌絲多。另外,在菌絲培養(yǎng)40 d時,外源添加AsA顯著增加H-P和H-F時GSSG含量;在H-M和H-V時,處理組菌絲的GSSG含量比對照組少(P<0.05)。這說明在菌絲培養(yǎng)時間為40 d時,AsA主要作用于原基的發(fā)生和子實體生長期。培養(yǎng)120 d時,外源添加AsA可顯著增加H-V時菌絲胞內(nèi)GSSG含量,顯著減少H-M時GSSG含量,這說明在菌絲培養(yǎng)時間為120 d時,外源添加AsA可通過調(diào)控菌絲恢復(fù)和轉(zhuǎn)色過程,進而影響子實體的發(fā)育。

圖4 不同發(fā)育時期斑玉蕈菌絲細胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量Fig.4 Content of oxidized glutathione(GSSG)in mycelium cells during different developmental stages

2.5 外源添加 AsA對不同發(fā)育時期斑玉蕈丙二醛(MDA)含量的影響

由圖5可知:在菌絲培養(yǎng)40 和120 d時,菌絲的MDA含量都呈先升高后降低的趨勢,在H-V時MDA量最大,在H-F時MDA含量最低。120 d菌絲MDA含量總體比培養(yǎng)40 d菌絲少。另外,在菌絲培養(yǎng)40 d時,外源添加AsA后H-V時的MDA含量顯著降低,而在其他時期無明顯影響(P>0.05)。這說明在菌絲培養(yǎng)40 d時,AsA主要作用于菌絲H-V。外源添加AsA后,H-V時菌絲MDA含量顯著降低,但在菌絲其他時期,MDA含量無顯著性變化。這說明在菌絲培養(yǎng)120 d時,外源AsA通過調(diào)控菌絲轉(zhuǎn)色這個過程,以降低脂質(zhì)過氧化和減輕膜損傷,進而影響斑玉蕈子實體發(fā)育。

圖5 不同發(fā)育時期斑玉蕈菌絲細胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量Fig.5 Content of malondialdehyde(MDA)in mycelium cells during different developmental stages

2.6 外源添加 AsA對不同發(fā)育時期斑玉蕈活性氧(ROS)含量的影響

圖6 不同發(fā)育時期斑玉蕈菌絲細胞內(nèi)活性氧(ROS)含量Fig.6 Content of reactive oxygen species(ROS)in mycelium cells during different developmental stages

在菌絲培養(yǎng)40 d時,細胞內(nèi)的過氧化氫含量呈先逐漸降低后升高的趨勢,在H-F時H2O2含量達到最大,在H-P時H2O2含量最低。120 d的菌絲中,H2O2含量呈先升高后降低再升高的趨勢,在H-V時H2O2含量最大,H-P時H2O2含量最低。培養(yǎng)120 d的菌絲H2O2含量總體比培養(yǎng)40 d的菌絲低。另外,在菌絲培養(yǎng)40 d時,添加AsA顯著增加H-M、H-P時H2O2含量;在H-V時,處理組菌絲的H2O2含量比對照組低(P>0.05)。這說明在菌絲培養(yǎng)40 d時,AsA主要作用于H-M和H-P時。外源添加AsA后,H-F時菌絲H2O2含量顯著增加,H-M、H-V時H2O2含量顯著降低,H-P時菌絲的H2O2含量則無顯著性變化。這說明在菌絲培養(yǎng)120 d時,外源加入AsA可以顯著調(diào)控菌絲恢復(fù)、轉(zhuǎn)色和子實體生長過程,進而影響斑玉蕈子實體發(fā)育。

2.7 外源添加AsA對不同發(fā)育時期斑玉蕈抗氧化酶活性的影響

由圖7可知:在菌絲培養(yǎng)40 d時,GPX活性呈逐漸升高的趨勢,在H-F時GPX活性最大,在H-M時GPX活性最低。培養(yǎng)120 d的菌絲GPX活性呈先升高后降低的趨勢,其活性總體比培養(yǎng)40 d的菌絲高;在H-V時GPX活性最大,H-F時GPX活性最低。另外,在菌絲培養(yǎng)40 d時,處理組H-F時GPX活性顯著增加;在H-M、H-V和H-P時,處理組菌絲的GPX比對照組高(P>0.05)。這說明在菌絲培養(yǎng)40 d時,AsA主要作用于子實體生長后期。外源添加AsA后,H-V的GPX酶活顯著增加,但是H-M、H-P和H-F的菌絲GPX活性無顯著性變化(圖7-B)。在菌絲培養(yǎng)120 d時,外源添加AsA后,通過顯著調(diào)控菌絲轉(zhuǎn)色這個過程,進而影響斑玉蕈子實體發(fā)育。

圖7 不同發(fā)育時期斑玉蕈菌絲細胞內(nèi)GPX、GR、SOD、CAT活性Fig.7 Activities of GPX,GR,SOD,CAT in mycelial cells of during different developmental stages GPX:谷胱甘肽過氧化氫酶Glutathione peroxidase;GR:谷胱甘肽還原酶Glutathione reductase;SOD:超氧化物歧化酶Superoxide dismutase;CAT:過氧化氫酶Catalase.

在菌絲培養(yǎng)40 和120 d時,細胞內(nèi)的GR活性均呈先升高后降低的趨勢。在菌絲培養(yǎng)40 d時,H-V時GR活性最大,H-F時GR活性最低。而培養(yǎng)120 d的菌絲,GR活性在H-P時最大,在H-F時酶活性最低,且該菌絲的GR活性總體和培養(yǎng)40 d的菌絲一樣。另外,在菌絲培養(yǎng)40 d時,外源添加AsA后,H-V時GR活性顯著降低;在H-M、H-P和H-V時,處理組菌絲GR活性比對照組低(P>0.05)。外源添加AsA對菌絲GR的活性無顯著性變化。

在菌絲培養(yǎng)40 d時,SOD活性呈先降低后升高的趨勢,在H-P時SOD活性最大,在H-M時SOD活性最低;而培養(yǎng)120 d的菌絲SOD活性則在H-F時顯著降低?？傮w來說,培養(yǎng)120 d的菌絲中SOD活性比培養(yǎng)40 d的菌絲高。另外,在菌絲培養(yǎng)40 d時,與對照組相比外源添加AsA后H-M時SOD活性顯著增加,在H-P時活性顯著降低;在其他時期活性無明顯變化(P>0.05)。

在菌絲培養(yǎng)40 和120 d時,細胞內(nèi)的CAT活性都呈先升高后降低趨勢。菌絲培養(yǎng)40 d時,在H-V時其活性最大,在H-M時CAT活性最低。在菌絲培養(yǎng)40 d時,外源添加AsA對菌絲的CAT活性無顯著影響(P>0.05)。這說明外源添加AsA后,H-F時菌絲的CAT活性顯著增加,H-M、H-V時CAT活性顯著降低,H-P時CAT活性則無顯著性變化。在菌絲培養(yǎng)120 d時,外源添加的AsA,通過顯著調(diào)控H-M、H-V和H-F這3個過程,進而影響子實體發(fā)育。

3 討論

斑玉蕈栽培周期長,即從菌絲生長到向子實體生長轉(zhuǎn)化前,必須經(jīng)過60～70 d的菌絲體后熟階段[6]。如果后熟階段時間偏短,子實體產(chǎn)量將會下降[16]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)40和120 d的菌絲搔菌后,120 d的子實體產(chǎn)量(每瓶265.23 g)是菌絲培養(yǎng)40 d產(chǎn)量(每瓶94.56 g)的2.80倍。并且,外源添加AsA對于不同培養(yǎng)時期的菌絲后熟期增產(chǎn)效率也不一樣。外源添加AsA對培養(yǎng)40 d的菌絲增產(chǎn)效率高于120 d。因此,在菌絲培養(yǎng)一定時期搔菌后,添加適量的AsA,可以提高子實體的產(chǎn)量。這為今后提高工廠化生產(chǎn)斑玉蕈的產(chǎn)量,提供了解決方法。

陳輝等[17]研究發(fā)現(xiàn),前期添加外源皂苷能抑制降解纖維素酶活性,從而不利于菌絲的生長;后期則起促進纖維素酶發(fā)揮作用,為子實體的生長發(fā)育提供更多碳源,增加子實體產(chǎn)量。張津京等[6]研究外源添加曲酸,可提高漆酶和纖維素酶活性,進而提高菌絲利用木質(zhì)纖維素的能力,為斑玉蕈子實體生長發(fā)育提供更多能源,增加子實體產(chǎn)量。添加海藻糖的培養(yǎng)基不僅能為斑玉蕈菌絲生長提供良好的營養(yǎng)和環(huán)境[18]、顯著加快食用菌菌絲的生長速度、提高菌絲生物量,還可增強斑玉蕈在培養(yǎng)過程中應(yīng)對環(huán)境脅迫的能力[19]和顯著提高斑玉蕈漆酶的活性[20]。這3種物質(zhì)均通過影響木質(zhì)素降解的相關(guān)酶活性,來達到增產(chǎn)的效果。外源添加富氫水和AsA所起的作用相似,即通過影響斑玉蕈相關(guān)的抗氧化酶活性,進而影響其生長發(fā)育,最終達到增產(chǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn),外源添加AsA能顯著提高斑玉蕈菌絲轉(zhuǎn)色期的內(nèi)源AsA含量,顯著降低MDA、ROS含量,提高培養(yǎng)40 d的菌絲恢復(fù)期和培養(yǎng)120 d的子實體SOD活性。在菌絲培養(yǎng)40 d時,外源添加AsA,菌絲恢復(fù)期的GSH含量顯著降低,而菌絲轉(zhuǎn)色期的GSH含量顯著提高。由這些結(jié)果可知,L-抗壞血酸提高斑玉蕈產(chǎn)量,并不是單一的發(fā)揮抑制或者抗氧化的作用,可能是一個綜合作用的表現(xiàn)。在測量多種抗氧化酶活性時發(fā)現(xiàn),外源添加AsA,總體上提高了GPX、GR、SOD和CAT活性,但是不同酶發(fā)揮的主要作用方式或時間不同,它們響應(yīng)L-抗壞血酸的方式有差異。

綜上所述,外源添加L-抗壞血酸能增加斑玉蕈子實體產(chǎn)量,且不同培養(yǎng)時期的增產(chǎn)率不同。在斑玉蕈生殖生長階段,外源添加L-抗壞血酸后,抗氧化酶活性提高,MDA和ROS含量降低,以達到提高菌絲的抗氧化脅迫能力。該種菌絲可降低外界傷害,為子實體的生長發(fā)育提供更好的物質(zhì)基礎(chǔ),從而提高子實體產(chǎn)量。