季書立,贠陽,賈沛璐,甘振丁,張昊,張莉莉,王恬

(南京農業(yè)大學動物科技學院,江蘇 南京 210095)

氧化應激是內、外環(huán)境因素誘導機體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡的狀態(tài)[1]。母豬在分娩時,仔豬從低氧的宮內環(huán)境進入高氧的宮外環(huán)境,引起血液氧分壓驟變、細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)爆發(fā)式增多、氧化還原失衡,造成大腦、肝臟和腸道等代謝旺盛組織的氧化損傷,導致新生仔豬發(fā)病率和死亡率升高[2-3]。

腸道組織既是營養(yǎng)物質消化、吸收和代謝的主要器官,也是最大的免疫器官,對機體抵御病原體及有害物質的侵襲起著重要作用[4]。在新生階段,仔豬腸道形態(tài)結構和生理功能尚不完善,對各種應激反應高度敏感,易導致腸道損傷和多種疾病的發(fā)生,嚴重影響仔豬的生長發(fā)育[5]。添加適宜的抗氧化活性物質是緩解仔豬腸道損傷、促進腸道發(fā)育的一種有效方法[6-8]。

近年的研究表明,黃酮類物質是一種高效的抗氧化劑,能夠有效緩解由氧化應激引起的腸道損傷,改善腸道完整性,提高其抗氧化能力[9-10]。竹葉提取物(bamboo leaf extract,BLE)是一種源于竹葉、富含黃酮和多酚的天然活性物質,具有抗氧化和抑菌等多種生物學功效,被廣泛應用于食品和化妝品行業(yè)[11-12]。研究表明,竹葉黃酮提取物可通過上調核轉錄因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)和血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)的表達緩解油酸誘導的HepG2細胞的氧化應激[13]。BLE還可以提高小鼠血清和肝臟的抗氧化酶活性,降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,減少氧化應激引起的急性胃黏膜損傷和肝損傷[14-15]。近年來,BLE更是以其豐富的原料來源、明確的功能因子、良好的食用安全性,在飼料添加劑領域嶄露頭角。Shen等[16]研究發(fā)現(xiàn),日糧中添加BLE能有效提高肉雞肌肉清除自由基的能力和抗氧化酶的活性。粟明月等[17]報道,奶牛日糧中添加BLE能顯著降低血漿中的MDA含量。但BLE對哺乳仔豬腸道健康影響的研究尚未見報道。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn),灌喂適宜水平的BLE能在一定程度上促進哺乳仔豬的生長,但其潛在機制尚不明確。鑒于初生仔豬易受環(huán)境影響發(fā)生腸道氧化應激,阻礙仔豬健康發(fā)育,故本試驗旨在研究BLE對哺乳仔豬回腸形態(tài)和抗氧化性能的影響,以期為BLE作為抗氧化劑在生豬養(yǎng)殖中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

BLE由浙江新篁生物科技有限公司提供,其有效成分包括總黃酮70 mg·g-1、總多酚50.42 mg·g-1。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

本試驗在蘇州安佑太倉種豬場進行。試驗選取體重相近、胎次相同的3日齡雄性仔豬64頭,隨機分為4組,每組8個重復,每個重復2頭仔豬。對照組(CON組)仔豬每天灌喂羧甲基纖維素鈉溶液10 mL,試驗組分別灌喂含100、200和300 mg·kg-1BLE的羧甲基纖維素鈉溶液10 mL,試驗期21 d。試驗期間仔豬自由采食母乳和飲水,并按照豬場的正常免疫措施等進行飼養(yǎng)管理。

1.3 樣品采集

試驗結束時,從每個重復中隨機選取一頭仔豬,前腔靜脈采集血液,4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min,分離血清,保存于-80 ℃冰箱備用。腹腔注射戊巴比妥鈉溶液,放血致死后剖開腹腔,分離回腸。從回腸中段取2 cm腸段縱向切開后,先用預冷的生理鹽水沖洗內容物,再置于4%的多聚甲醛中固定,用于形態(tài)學觀察。用無菌載玻片刮取回腸黏膜,保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 腸道組織形態(tài)學觀察將保存于4%多聚甲醛固定液中的回腸組織用不同梯度的乙醇溶液干燥處理。經二甲苯洗凈,石蠟包埋,制備成5 μm的切片后,用蘇木精和伊紅染色,置于光學雙目顯微鏡下觀察。每張切片選取20個完整的絨毛和隱窩,使用Image-Pro Plus軟件(Media Cybernetics,USA)測量其絨毛高度(villi height,VH)和隱窩深度(crypt depth,CD),計算其比值(VH/CD)。

1.4.2 氧化損傷以及抗氧化相關指標測定取適量回腸黏膜按照1∶4(m/v,質量體積比)的比例加入預冷的生理鹽水,冰水浴中破碎、勻漿后,3 500 r·min-1離心10 min,取上清液保存于-20 ℃?zhèn)溆??；啬c黏膜勻漿和血清中的總蛋白含量采用二喹啉甲酸(BCA)法測量。MDA、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量和總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)以及總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性均采用試劑盒(南京建成生物科技有限公司)進行測量。

1.4.3 回腸黏膜RNA的提取和mRNA表達量的測定稱取0.1 g回腸黏膜樣品,加入1 mL Trizol后按照說明書提取回腸黏膜總RNA。經NanoDrop1000(Thermo Scientific,UK)進行純度和濃度的檢測后,再用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,于-20 ℃保存。使用SYBRPremixExTaq試劑盒(TaKaRa,大連)進行實時熒光定量PCR(qPCR)反應。qPCR程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。目的基因的相對表達含量以β-actin為內參,采用2-ΔΔCT法計算。引物序列見表1。

表1 本試驗實時熒光qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time qPCR in this study

1.4.4 回腸黏膜蛋白的提取和蛋白表達量的測定將冷凍的回腸黏膜切成小塊,用蛋白裂解液RIPA和苯甲磺酰氟研磨,提取冷凍腸黏膜中的蛋白質,并用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品平衡至統(tǒng)一濃度后,加入等體積的上樣緩沖液進行變性處理,樣品-80 ℃保存。

用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對蛋白樣品進行電泳,在300 mA條件下將蛋白濕轉至聚偏二氟乙烯膜上。在室溫條件下用50 g·L-1脫脂奶粉封閉膜2 h后,用含有0.1%吐溫20的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液(TBST)清洗干凈,再依次經4 ℃一抗孵育過夜,室溫二抗孵育,TBST清洗,顯影液浸泡,最后用天能4600SF全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)掃描,掃描圖像用Image-Pro Plus軟件進行量化分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 竹葉提取物對哺乳仔豬回腸黏膜形態(tài)的影響

由圖1和表2可知:灌喂BLE改善了哺乳仔豬回腸絨毛形態(tài)。與CON組相比,灌喂BLE可提高仔豬回腸絨毛高度(VH),其劑量為300 mg·kg-1時效果顯著(P<0.05),但對隱窩深度(CD)無顯著影響(P>0.05)。另外,300 mg·kg-1BLE組仔豬VH/CD值相對于CON組顯著提高(P<0.05)。說明BLE能促進仔豬回腸發(fā)育。

圖1 竹葉提取物(BLE)對哺乳仔豬回腸絨毛形態(tài)的影響Fig.1 Effects of dietary supplementation with bamboo leaf extrat(BLE)on histologic morphology in the ileum of suckling piglets

表2 BLE對哺乳仔豬回腸腸道形態(tài)的影響Table 2 Effect of dietary BLE on histologic morphology in the ileum of suckling piglets

2.2 竹葉提取物對哺乳仔豬血清抗氧化指標的影響

由表3可知:與CON組相比,200和300 mg·kg-1BLE組仔豬血清中MDA含量均顯著降低(P<0.05)。此外,200和300 mg·kg-1BLE組仔豬血清中T-AOC和GSH-Px活性較CON組均顯著提高(P<0.05)。

表3 BLE對哺乳仔豬血清抗氧化功能的影響Table 3 Effects of dietary BLE on serum antioxidant function of suckling piglet

2.3 竹葉提取物對哺乳仔豬回腸黏膜抗氧化指標的影響

由表4可知:與CON組相比,灌喂BLE能顯著降低哺乳仔豬回腸黏膜MDA含量(P<0.05)。300 mg·kg-1BLE組仔豬回腸黏膜SOD和GSH-Px活性相對于CON組顯著提高(P<0.05),200 mg·kg-1BLE組仔豬回腸黏膜中GSH-Px活性相對于CON組顯著提高(P<0.05),但對CAT和T-AOC活性影響不顯著(P<0.05)。

表4 BLE對哺乳仔豬回腸黏膜抗氧化功能的影響Table 4 Effect of dietary BLE on antioxidant function in ileum mucosa of suckling piglets

2.4 竹葉提取物對哺乳仔豬回腸黏膜中基因mRNA表達水平的影響

由圖2可以看出:與CON組相比,200和300 mg·kg-1BLE組仔豬回腸黏膜中Nrf2和GSH-PxmRNA表達水平均顯著提高(P<0.05)。同時,與CON組相比,300 mg·kg-1BLE組仔豬回腸黏膜中SOD2和HO-1mRNA表達量也均顯著提高(P<0.05),而灌喂BLE對哺乳仔豬回腸黏膜中CAT和GRmRNA表達沒有顯著影響(P>0.05)。

圖2 BLE對哺乳仔豬回腸黏膜抗氧化基因mRNA表達量的影響Fig.2 Effects of dietary supplementation with BLE on antioxidant gene expression level in the ileum mucosa of suckling piglets

2.5 竹葉提取物對哺乳仔豬回腸黏膜抗氧化相關蛋白表達水平的影響

由圖3可以看出:與CON組相比,200和300 mg·kg-1BLE組仔豬回腸黏膜Nrf2和SOD2蛋白表達水平均顯著提高(P<0.05),表明BLE可以激活Nrf2蛋白并上調其下游SOD2蛋白的表達。

圖3 BLE對哺乳仔豬回腸黏膜Nrf2和SOD2蛋白表達量的影響Fig.3 Effects of dietary supplementation with BLE on the protein expression levels of Nrf2 and SOD2 in the ileum mucosa of suckling piglets

3 討論

小腸作為機體營養(yǎng)物質消化吸收代謝的主要器官,對動物體的生長發(fā)育起著重要作用。尤其在哺乳階段仔豬尚不成熟的腸道形態(tài)結構和生理功能將迅速發(fā)育,其健康狀況決定了仔豬的存活率及后期生長速率[18]。氧化應激會引起腸上皮細胞的凋亡,損傷腸道絨毛的完整性,影響腸道功能[19-20]。諸多研究表明,改善動物腸道氧化還原平衡對促進絨毛形態(tài)和組織發(fā)育具有積極意義[21-22]。本試驗結果顯示,灌喂BLE能提高哺乳仔豬回腸VH和VH/CD值。腸道絨毛的增長與上皮細胞的發(fā)育和成熟密切相關,在生長階段,大量細胞由隱窩遷移至絨毛頂端,促使絨毛增長。這說明BLE可能通過提高仔豬回腸腸道抗氧化能力,促進仔豬腸道黏膜上皮細胞的發(fā)育,從而促進腸道絨毛的生長[23]。另一方面,小腸VH和VH/CD值越大,說明腸上皮表面積越大,腸道的消化吸收能力就會越強[24]。這意味著BLE具有促進回腸絨毛發(fā)育,提高仔豬消化能力的作用,這與前人的研究結果一致[25]。

對于需氧生物來說,一定濃度的氧化劑可以促進其生長、細胞分化、凋亡和免疫等各種生命活動[26]。但在新生階段,動物機體發(fā)育不完善,抗氧化機能不健全,很容易受到外界環(huán)境影響導致應激反應的發(fā)生。由此產生的大量ROS堆積在體內得不到清除,導致機體氧化還原系統(tǒng)的平衡被打破,并造成氧化損傷[27]。

MDA作為脂質氧化的主要產物之一,其水平的高低常被用來衡量機體氧化損傷的程度[28]。本試驗結果顯示,灌喂200或300 mg·kg-1BLE均能有效降低仔豬血清和回腸黏膜中的MDA含量,這可能與黃酮類和多酚類植物提取物可以通過清除自由基和螯合過渡金屬離子來降低脂質氧化的能力有關[29]。此外,灌喂300 mg·kg-1BLE能夠顯著提高仔豬血清中的T-AOC、SOD和GSH-Px活性以及回腸黏膜中的SOD和GSH-Px活性,從而提高機體的抗氧化水平。

還有研究表明,許多黃酮類、多酚類植物衍生物可以作為Nrf2通路的潛在誘導劑[30-31]。Nrf2是氧化還原穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)因子,負責調節(jié)細胞防御機制對抗氧化應激。正常生理狀態(tài)下,Nrf2被其負調控因子Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1錨定在細胞質中。當機體發(fā)生氧化應激時,Nrf2被激活并移位至細胞核中,與小Maf蛋白聚合形成二聚體后再與抗氧化反應元件結合,調控其下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達[32]。本試驗結果顯示,灌喂200和300 mg·kg-1的BLE均能顯著上調哺乳仔豬回腸黏膜Nrf2mRNA和蛋白的表達,并促進其下游HO-1、GSH-Px和SOD2等抗氧化基因的表達。HO-1能夠催化鐵與血紅素基團結合為膽綠素,降低血紅素基團促氧能力。膽綠素的生成能夠有效清除過氧化物和超氧化物自由基,降低氧化損傷的發(fā)生[33]。這表明BLE能夠激活Nrf2并調節(jié)其相關抗氧化酶的表達,提高機體的抗氧化能力。Shen等[34]發(fā)現(xiàn)日糧中添加BLE可以上調肉雞肝臟中SOD和GSH-PxmRNA的表達,提高肝臟抗氧化能力。本試驗結果與上述研究結果相一致。

綜上所述,灌喂BLE促進了哺乳仔豬腸道絨毛形態(tài)結構的發(fā)育,這可能是因為BLE通過激活Nrf2信號通路,提高哺乳仔豬回腸抗氧化能力,從而緩解出生應激帶來的腸道損傷,有利于仔豬腸道及機體的健康發(fā)育。但有關BLE對仔豬回腸炎癥水平的影響以及仔豬回腸抗炎能力和腸道發(fā)育之間是否存在相關性仍不明確,需進一步研究。