周妮妮,安家慧,祝可心,于棟,萬玉萌,李玉峰

(南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,江蘇 南京 210095)

副豬嗜血桿菌是豬格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)的病原,可引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎[1-2],每年給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[3]。副豬嗜血桿菌菌株分為15種標準血清型[4],血清型1、5、10、12、13和14被認為是強毒株,能夠?qū)е仑i的高死亡率,血清型2、4、8和15的毒力較弱,而3、6、7、9和11則被認為是無毒力菌株[5]。副豬嗜血桿菌的強毒株通過黏附和侵入上皮細胞而定殖并引發(fā)感染,這些過程也是感染的第一步[6],并且其侵入細胞與全身性感染有關(guān)[7]。由于不同血清型菌株間的交叉保護作用很弱,疫苗控制該疾病的效果不明顯。氟苯尼考已被廣泛用于該病的治療,但對氟苯尼考耐藥的副豬嗜血桿菌菌株已出現(xiàn)[8]。因此,深入探究副豬嗜血桿菌與宿主之間的相互作用關(guān)系,有助于進一步揭示副豬嗜血桿菌的致病機制。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)被定義為長度大于200 nt的缺乏蛋白質(zhì)編碼潛力的轉(zhuǎn)錄物。雖然lncRNA在大多數(shù)真核細胞中都有表達,但在不同的細胞和組織中發(fā)現(xiàn)的特異性lncRNA群體較mRNA的表達水平低。lncRNA在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學水平上調(diào)編碼基因的表達,且在真核細胞的分化和胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[9-10]。大量數(shù)據(jù)表明,lncRNA可調(diào)節(jié)細菌感染。在被幽門螺桿菌感染的人胃上皮細胞中,23種lncRNA上調(diào),21種下調(diào)。幽門螺桿菌陽性患者的胃黏膜組織中XLOC-004122和XLOC-014388的水平顯著降低[11]。在lncRNA-Aw112010中“隱藏”的新ORF的翻譯對于細菌感染和結(jié)腸炎期間的黏膜免疫至關(guān)重要[12]。越來越多哺乳動物細胞中表達的lncRNA被證實與免疫功能失調(diào)和宿主防御有關(guān)[13-14]。這包括lncRNA NeST,它通過增強小鼠體內(nèi)局部IFN-γ的產(chǎn)生來促進沙門氏菌的清除[15]。此外,隨著沙門氏菌在宿主細胞內(nèi)復制,核RNA的降解失調(diào),從而促使另外一組不穩(wěn)定lncRNA的積累,其中一些對于機體抵抗細菌的入侵至關(guān)重要[16]。有研究發(fā)現(xiàn),microRNA miR-1通過降解胞質(zhì)lncRNA Sros1間接穩(wěn)定Stat1信使RNA來促進巨噬細胞中干擾素γ介導的李斯特菌的清除[17]。

脊椎動物的先天性免疫應(yīng)答是機體抵抗微生物入侵的第一道防線,作為先天性免疫的重要組成部分,巨噬細胞在宿主防御感染的過程中起重要作用,它們通過釋放細胞因子和趨化因子來介導微生物的殺滅,以及引發(fā)、維持和解決宿主的炎癥反應(yīng)[18-19]。豬肺泡巨噬細胞被認為是機體抵御副豬嗜血桿菌感染的重要防線[20]。副豬嗜血桿菌感染豬體后,在豬肺泡巨噬細胞中鑒定出多個差異表達的基因,這些基因主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、微管聚合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導有關(guān)[21]。

轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)途徑在控制動物細胞生長、分化和最終命運的信號網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)中心位置[22]。作為TGF-β家族的成員,TGF-β1調(diào)節(jié)多種生物學過程,包括細胞程序性死亡、纖維化、細胞分化、血管生成和細胞免疫。此外,TGF-β1調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)(ECM)表達和一些整合素亞單位。例如TGF-β1上調(diào)上皮細胞中α5整合素和纖連蛋白(Fn)的表達[23]。整合素是由α和β亞基組成的糖蛋白,是已知的ECM受體,α5β1整合素可作為纖連蛋白的細胞受體[24]。長鏈非編碼RNA-MEG3的靶基因包括TGF-β途徑基因,其結(jié)合位點的全基因圖譜顯示,MEG3通過與遠端調(diào)控元件的結(jié)合來調(diào)節(jié)TGF-β1基因的活性[25]。我們之前曾報道過副豬嗜血桿菌的感染增強了PK-15細胞中TGF-β1的表達[26],表明TGF-β1在副豬嗜血桿菌的發(fā)病機制中起重要作用。

本試驗中,我們擬用標準血清型5型副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細胞3D4/21,用RNA-Seq鑒定差異表達的lncRNA,探究差異表達的lncRNA候選基因在副豬嗜血桿菌致病機制中的潛在作用,為揭示致病菌與其靶標間相互作用以及相關(guān)lncRNA的調(diào)控機制提供一個新的研究手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Anti-Fibronectin(ab194395)是小鼠單克隆抗體(同種型是IgG1,輕鏈型是K),購自英國Abcam公司。小鼠抗人CD49e抗體(a5 integrin,555651)購自美國BD Biosciences公司。HRP標記的羊抗鼠抗體IgG(H+L)以及鼠抗FLAG標簽抗體購自南京碧云天生物技術(shù)公司。小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染試劑 Micropoly-transfecterTMCell Reagent 購自南通Micropoly公司。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipoMaxTMReagent購自南京SUDGEN公司。熒光定量試劑PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix購自美國Thermo Fisher公司。RIPA細胞裂解液購自Cell Signaling Technologies公司。Alexa Fluor 488結(jié)合的山羊抗小鼠抗體IgG(H+L)購自美國Proteintech公司。

1.2 細菌菌株培養(yǎng)

本試驗使用的3種副豬嗜血桿菌的標準血清型菌株(血清型4、5、7,分別稱為Hps4、Hps5和Hps7),菌株編號依次為SW124、Nagasaki和174。細菌在37 ℃的胰蛋白酶大豆瓊脂和胰蛋白胨大豆肉湯(以下分別簡稱為TSA和TSB,購自英格蘭OXOID公司)中培養(yǎng),添加有10 g·L-1煙酰胺嘌呤二核苷酸(NAD,南京博全科技有限公司)和5%滅活牛血清(Thermo Fisher)。試驗前,將細菌接種于TSB中,在37 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)過夜,然后用新鮮培養(yǎng)基稀釋,再培養(yǎng)至D600值達0.6。

1.3 細胞吞噬副豬嗜血桿菌試驗

3D4/21細胞,源自豬肺泡巨噬細胞原代細胞的傳代細胞系(原代豬肺泡巨噬細胞轉(zhuǎn)入大T抗原永生化后獲得,ATCC CRL2843)。將細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所用細胞培養(yǎng)基RPMI 1640(Gibco)中加入10%滅活胎牛血清(FBS,Gibco)、10 g·L-1青霉素(鏈霉素)和10 g·L-1非必需氨基酸(Sigma)。待細胞生長至90%匯合度時,進行傳代培養(yǎng)。

將新鮮培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌菌液8 000g離心1 min,然后用無菌PBS洗滌3次,用RPMI 1640重懸,調(diào)整細菌密度為2.5×108mL-1,進行細菌感染試驗,步驟稍作修改[27]。過夜培養(yǎng)的3D4/21細胞,在試驗前用無菌PBS洗滌3次,更換為無抗生素的培養(yǎng)基。將細胞與不同血清型副豬嗜血桿菌一起孵育,再用紫外線滅活細菌。將細胞板800g離心10 min,于溫箱中孵育2 h;用PBS沖洗細胞5次,加入新鮮的細胞培養(yǎng)基(包含100 U·mL-1青霉素G和0.25 mg·mL-1慶大霉素);孵育1 h以殺死細胞外的副豬嗜血桿菌,再用無菌PBS洗滌細胞(除去抗生素);向細胞中加入100 μL的0.25 μg·L-1胰蛋白酶,37 ℃孵育10 min。收集細胞,12 000g離心10 min,棄上清液,用無菌PBS重懸細胞并涂布TSA平板。

1.4 RNA的高通量測序

共培養(yǎng)6個T-75細胞瓶的3D4/21細胞,其中3個瓶的細胞以200 MOI的比例感染細菌Hps5(命名為Hps5-1、-2和-3),以另外3個瓶中未感染的細胞作為對照(命名為對照1、2和3)。感染36 h后棄培養(yǎng)基,加無菌PBS沖洗細胞3次。從細胞瓶內(nèi)刮下細胞,使用Trizol試劑提取細胞內(nèi)的總RNA。通過 10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,并且使用NanoPhotometer分光光度計檢查其純度。使用Qubit RNA Assay Kit 和Qubit 2.0 Flurometer測定RNA濃度。提交RNA樣品至Novogene公司進行RNA-seq高通量測序。獲取的高質(zhì)量數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析,包括Q20、Q30和GC含量的計算。

每個樣品的映射讀數(shù)是使用Scripture(beta2)[28]和 Cufflinks(v2.1.1)獲取的[29]。利用HTSeq和 SusScrofa 參考基因組(ftp://ftp.bl.org/pub/relea-84/fasta/sus-scrofa/),查找映射基因編碼的蛋白質(zhì)。

1.5 lncRNA和mRNA的鑒定

用Cuffdiff v2.1.1計算lncRNA和編碼基因的每百萬個圖譜片段(FPKM)和每千堿基外顯子的片段[29]。將每個基因組中轉(zhuǎn)錄本的FPKM相加來計算基因的FPKM。Cuffdiff使用基于負二項分布的模型為分析數(shù)字轉(zhuǎn)錄本或基因表達數(shù)據(jù)中的差異表達提供統(tǒng)計程序[29]。調(diào)整后P<0.05的轉(zhuǎn)錄本為差異表達。使用4種分析工具(CNCI v2、CPC v0.9-r2、Pfam-scan v1.3和PhyloCSF v20121028)鑒定新的lncRNA候選基因。只有經(jīng)過4種工具共同確認的lncRNA才能被認為是候選者,用轉(zhuǎn)錄本的FPKM檢測表達水平,與對照組表達水平差異在2.0以上的lncRNA被認為表達差異顯著。

1.6 熒光定量PCR(qPCR)分析差異表達的lncRNA

參照NCBI數(shù)據(jù)庫中野豬(Susscrofa)基因組數(shù)據(jù)庫的序列,設(shè)計針對10個上調(diào)lncRNA和 TGF-β1 的引物(表1)。持家基因β-actin引物購自TaKaRa公司。如上所述,將3D4/21細胞接種6孔細胞板并用 5型副豬嗜血桿菌感染。分別在12、24和36 h收集細胞,提取總RNA,然后用SYBR-Green試劑進行qPCR,以β-actin作為內(nèi)參計算lncRNA的相對表達水平。相對表達水平的計算采用2-ΔΔCT法。

表1 本試驗所用的引物對序列Table 1 Primer pairs sequence used in this study

1.7 細菌感染與lncRNA的表達

由Biotend Biotechnologies公司設(shè)計合成靶向LNC_000165(lncRNA 165)的3條小干擾RNA片段(siRNA)(表2)以及1個非特異性隨機片段(NC,數(shù)據(jù)未提供)。為優(yōu)化基因沉默的轉(zhuǎn)染條件,接種3D4/21細胞于24孔細胞板中,每孔細胞為1.4×105個。細胞生長至50%的匯合度時,用不同濃度的siRNA片段轉(zhuǎn)染細胞,然后在不同時間收集細胞,測得靶向lncRNA 165的siRNA片段轉(zhuǎn)染細胞的最佳劑量為每孔0.06 mol。培養(yǎng)60 h后,以MOI為200的比例,用Hps5感染細胞。細菌感染試驗具體過程如1.3所述。收集細胞,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后進行qPCR試驗。

表2 靶向lncRNA 165的特異siRNA序列Table 2 SiRNA sequences specific targeting lncRNA 165

利用PCR擴增,在lncRNA 165基因序列的N端加上起始密碼子ATG,在C端加上FLAG標簽及終止密碼子,并將其克隆到pcDNA 3.1中,構(gòu)建表達lncRNA 165基因的重組質(zhì)粒。以每孔1.3×105個細胞的密度在24孔細胞板中接種細胞。細胞融合度至50%時,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒(每孔1.0 μg)。孵育24 h后收集細胞,提取總RNA,用于qPCR試驗,以計算lncRNA 165的表達水平。同時,為了驗證lncRNA 165是否正確表達,在冰上將平行樣品置于RIPA緩沖液中裂解,用FLAG抗體進行Western blot分析。在24孔細胞板上接種3D4/21細胞(每孔1.3×105個)。當細胞達到50%匯合度時,用lncRNA 165-FLAG和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細胞,24 h后,以MOI為200的比例感染Hps5。

1.8 Fn和α 5整合素的表達

在24孔細胞板上以每孔1.3×105個細胞的密度接種3D4/21細胞。轉(zhuǎn)染后,用胰蛋白酶消化細胞,刮取細胞到無菌離心管中,300g離心5 min。用含1% BSA的PBS洗滌細胞3次,然后分別與纖連蛋白(fibronectin,Fn)和整合素蛋白(α5)抗體(每106個細胞加1 μg)在37 ℃孵育30 min。將細胞洗滌2次后,加入100 μL含1% BSA的PBS重懸,再加入Alexa Fluor 488結(jié)合的山羊抗小鼠抗體IgG(H+L,1∶100稀釋),37 ℃避光孵育30 min。洗滌細胞后將其重懸于200 μL含1% BSA的PBS中,然后使用流式細胞儀分析Fn和α5的表達。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

圖1 CNCI、CPC、Pfam-scan和PhyloCSF 4種分析工具 鑒定3D4/21細胞中新的lncRNAFig.1 CNCI,CPC,Pfam-scan and PhyloCSF were used to identify novel lncRNA in 3D4/21 cells

2 結(jié)果與分析

2.1 3D4/21細胞中l(wèi)ncRNA和mRNA的鑒定

利用IlluminaHiSeq 2000平臺分別對未感染和感染Hps5的細胞RNA進行高通量測序分析,產(chǎn)生的對照1、2、3和Hps5-1、Hps5-2、Hps5-3的清潔讀數(shù)分別為10 616 284、 92 270 238、100 291 152和 103 948 420、105 623 050、10 383 024。Q20(%)值為96.45%～97.52%,大多數(shù)(66.5%)的映射基因編碼蛋白質(zhì)。對轉(zhuǎn)錄本進行分類并鑒定lncRNA,共有25 512個mRNA和2 654個lncRNA,其中1 163個為有注釋的lncRNA,1 491 個為新發(fā)現(xiàn)的lncRNA(圖1)。剔除56個miscRNA和加工轉(zhuǎn)錄本后,2 439 個為大的基因間非編碼RNA(lincRNA),159個為反義lncRNA(anti-sense lncRNA),沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子 lncRNA。lncRNA的2種亞型在基因結(jié)構(gòu)和表達水平上存在較大差異,lincRNA比反義 lncRNA長,中位長度分別為1.929和1.699 kb(圖2-a)。外顯子的數(shù)量也不同,lincRNA和反義lncRNA的外顯子數(shù)量中值分別是2.6和3.0(圖2-b)。根據(jù)FPKM值,lincRNA的表達水平高于反義 lncRNA,中位值為8.7和3.9(圖2-c)。

圖2 2種lncRNA亞型轉(zhuǎn)錄長度(a)、外顯子數(shù)量(b)和表達水平(c)的比較Fig.2 Comparasion of transcript length(a),number of exons(b)and expression level(c)for two lncRNA subtypes

分析結(jié)果(圖3)顯示:在感染后36 h,與未感染細胞相比,受感染細胞中有110個lncRNA表達上調(diào),216個lncRNA表達下調(diào);同時,分別有1 586和1 039個mRNA表達上調(diào)和下調(diào)(圖3-a、c)。分層聚類分析表明,這些轉(zhuǎn)變在感染組和對照組中是可重復的(圖3-b、d)。

圖3 差異表達的lncRNA和mRNA的分類Fig.3 Classification of differentially expressed lncRNA and mRNA a、c.如果lncRNA的表達水平(感染/未感染)的log2大于或小于2,并且-lg q超過1.3,則定義為差異表達;b.分層聚類顯示不同樣品中l(wèi)ncRNA表達水平的可重復性;d. mRNA的層次聚類分析,使用lg(FPKM+1)進行層次聚類分析,紅色表示高表達的基因,藍色表示低表達的基因。a,c. lncRNA was defined as differentially expressed if log2 of its expression level(infected/uninfected)was greater than or less than 2,and -lg q exceeded 1.3;b. Hierarchical clustering showing the reproducibility of lncRNA expression levels in different samples;. d. Hierarchical clustering analysis for mRNA,lg(FPKM+1)was used to perform hierarchical clustering analysis. Highly expressed genes were indicated in red,and blue indicated genes with lower expression.

2.2 qPCR分析差異表達的lncRNA

為了驗證RNA-seq檢測到的轉(zhuǎn)錄組差異,選取10個在感染細胞中表達水平顯著上調(diào)的 lncRNA,用于qPCR分析。盡管表達方式不同,但與對照相比,在感染后36 h內(nèi),10個lncRNA在感染細胞中的表達水平均提高(圖4)。特別是,lncRNA 165和3304表現(xiàn)出更強的時間依賴性表達,在36 h時達到最高值。而lncRNA 166、9129、6491、644、893和345表達水平較低,且在36 h時未出現(xiàn)表達水平明顯上升的現(xiàn)象。

圖4 lncRNA表達基因的qPCR驗證Fig.4 Validation of gene expression by qPCR

2.3 細菌侵入對lncRNA表達的影響

為探索細菌侵入與吸附對lncRNA表達的影響是否存在差異,我們用紫外滅活和未滅活的Hps5感染細胞,比較細胞中的4種lncRNA的表達。未滅活的Hps5感染細胞后,lncRNA的表達水平顯著升高(圖5),特別是lncRNA 165和3304,其表達水平分別是對照組細胞的8.2和5.6倍(P<0.01)。

圖5 副豬嗜血桿菌的吸附與侵入對lncRNA表達的影響Fig.5 The effect of adherence and invasion of H.parasuis on the expression of lncRNAUV-Hps5:紫外線滅活的Hps5 Ultro-violet inactivated Hps5. *P<0.05, **P<0.01. The same as follows.

2.4 細菌毒力對lncRNA表達的影響

將3D4/21細胞用弱毒力(Hps4)、強毒力(Hps5)和無毒力(Hps7)標準血清型的副豬嗜血桿菌進行感染,分別在12、24和36 h時收集細胞進行qPCR分析。qPCR結(jié)果(圖6)顯示:Hps4、 Hps5和Hps7感染組中,lncRNA 165和3304在24和36 h時的表達水平都高于lncRNA 1125和3472。在24 h時,被Hps5感染細胞中l(wèi)ncRNA 3304的表達水平高于其他lncRNA,但在12和36 h時,其表達水平?jīng)]有顯著差異,而 lncRNA 165在副豬嗜血桿菌感染的細胞中穩(wěn)定上調(diào)。

圖6 不同毒力菌株對lncRNA表達水平的影響Fig.6 Effects of different virulent strains on the expression level of lncRNA

2.5 lncRNA 165的表達對細菌侵入的影響

細菌毒力與lncRNA表達關(guān)系的研究表明,lncRNA 165的表達可能與副豬嗜血桿菌的感染密切相關(guān)。為了驗證這一假設(shè),我們用靶向lncRNA 165的siRNA片段和非特異性隨機片段(NC)轉(zhuǎn)染3D4/21細胞,然后用qPCR檢測lncRNA 165的表達情況。結(jié)果表明,RNA干擾可將lncRNA 165的表達降低約20%(圖7-a)。轉(zhuǎn)染后,細胞感染Hps5,然后計數(shù)侵入細胞內(nèi)的細菌數(shù)。siRNA片段處理細胞內(nèi)的細菌數(shù)顯著少于對照組(P<0.05),減少約60%(圖7-b)。

培養(yǎng)3D4/21細胞,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒lncRNA 165-FLAG、pcAGGS-FLAG和pcDNA3.1,24 h后收集細胞,制備蛋白樣品進行Western blot。結(jié)果顯示:lncRNA 165無法翻譯成蛋白質(zhì),這表明lncRNA 165是以lncRNA形式表達的(圖7-c)。同時,與對照組細胞相比,轉(zhuǎn)染了lncRNA 165-FLAG的細胞,其lncRNA 165的表達水平提高了90.5倍(圖7-d)。同上,用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3D4/21細胞,24 h時后用Hps5感染細胞,lncRNA 165-FLAG處理細胞內(nèi)的細菌數(shù)量顯著增加(P<0.05),為對照組的2.6倍(圖7-e)。

圖7 副豬嗜血桿菌侵入對lncRNA表達的影響Fig.7 Influence of invasion of H.parasuis on the expression of lncRNA a. siRNA干擾后lncRNA 165的表達;b. 轉(zhuǎn)染siRNA后細菌對細胞的侵入;c. 表達lncRNA 165重組質(zhì)粒表達的鑒定;d. 轉(zhuǎn)染lncRNA 165重組質(zhì)粒后lncRNA 165的表達;e. 過表達lncRNA 165后細菌對細胞的侵入。NC. 無關(guān)RNA干擾片段。a. The expression of lncRNA 165 interfered using siRNA fragments;b. The number of invasion of bacterium after interfering by siRNA fragments;c. The identification of recombinant plasmid expression lncRNA 165;d. The expression of lncRNA 165 in cells after transfection with recombinant plasmid expressing lncRNA 165;e. The number of invasion bacterium after overexpression of lncRNA 165. NC. Scamble RNA frogment.

2.6 lncRNA 165表達與TGF-β1表達的分析

用靶向lncRNA 165的siRNA片段和非特異性隨機片段(NC)轉(zhuǎn)染3D4/21細胞,收集樣品,qPCR檢測TGF-β1mRNA的表達。結(jié)果(圖8-a)顯示,降低lncRNA 165表達水平時,TGF-β1mRNA表達水平降低6.3%。

用重組TGF-β1預處理3D4/21細胞24 h后,使用qPCR分析lncRNA 165的表達。結(jié)果(圖8-b)表明,用TGF-β1預處理細胞可以促進lncRNA 165的表達,表達水平升高4.1倍。

圖8 TGF-β1 mRNA表達與lncRNA之間的關(guān)系Fig.8 Association between lncRNA expression and TGF-β1 mRNA expression a. 下調(diào)lncRNA 165的表達對TGF-β1 mRNA表達的影響;b. TGF-β1處理對lncRNA 165表達的影響。a. The down-regulation of lncRNA 165 affects the expression of TGF-β1 mRNA;b. The expression of lncRNA 165 was affected by the incubation of TGF-β1.

2.7 RNA干擾對3D4/21細胞中Fn和α5表達的影響

用特異性靶向lncRNA 165的siRNA片段以及非特異性隨機片段(NC)轉(zhuǎn)染3D4/21細胞,60 h后收集細胞,與抗纖連蛋白(Fn)和整合素蛋白(α5)抗體一起孵育,然后進行流式細胞分析。結(jié)果(圖9)顯示:與對照相比,siRNA轉(zhuǎn)染細胞的α5(56.69% VS 76.94%)和Fn(2.51% VS 4.21%)表達量顯著降低(P<0.05)。

圖9 RNA干擾對3D4/21細胞中Fn和α5表達的影響Fig.9 Effect of RNA interference on the expression of Fn and α5 in 3D4/21 cells

3 討論

豬格拉瑟氏病造成世界范圍養(yǎng)豬行業(yè)的巨大損失,免疫接種對15種已知標準血清型副豬嗜血桿菌的保護效果很差,或是僅對血清型中的一部分菌株有保護作用[8]。目前對該菌致病機制的研究主要集中在毒力因子方面[30]。關(guān)于副豬嗜血桿菌與宿主間相互作用機制的研究很少。眾所周知,lncRNA能夠參與病原與宿主間的相互作用[31]。而巨噬細胞作為抵御病原體侵入機體的第一道防線也有著重要作用[20]。

試驗中,我們用副豬嗜血桿菌標準血清5型感染豬肺泡巨噬細胞3D4/21細胞系,然后用RNA-Seq篩選差異表達的lncRNA,發(fā)現(xiàn)Hps5的感染明顯影響了lncRNA在3D4/21細胞中的表達,這說明lncRNA在副豬嗜血桿菌感染過程中發(fā)揮著重要作用。

我們采用qPCR技術(shù)對RNA-seq篩選出的感染細胞中較為豐富的10個lncRNA表達情況進行分析,證明了副豬嗜血桿菌的侵襲對lncRNA的表達具有更大的影響。同時,我們還確定了lncRNA 165和3304的高效表達與細菌毒力之間缺少相關(guān)性。但是,我們發(fā)現(xiàn)當細菌感染細胞36 h時,lncRNA 165的表達水平顯著上調(diào),這表明lncRNA 165有作為檢測副豬嗜血桿菌感染宿主的分子標記的可能。siRNA干擾試驗支持lncRNA 165參與調(diào)節(jié)副豬嗜血桿菌侵入的假設(shè)。

TGF-β的表達與多種疾病和繼發(fā)感染有關(guān)。甲型流感病毒感染細胞后會引起細胞TGF-β1的表達水平升高,同時Fn和α5的表達水平也隨之增加,從而導致嚴重的細菌繼發(fā)感染[32]。在被Group A Streptococcus(GAS)感染的上皮細胞中發(fā)現(xiàn)其誘導TGF-β1的產(chǎn)生,而且TGF-β1上調(diào)Fn和整合素α5可增強GAS對上皮細胞的侵入[23]。我們之前曾報道過副豬嗜血桿菌感染增強了PK-15細胞中TGF-β1的表達[26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾lncRNA 165的表達會顯著調(diào)控TGF-β1的表達水平,同時Fn和整合素蛋白α5的表達水平也隨之變化,證明lncRNA 165的表達與TGF-β1的表達密切相關(guān)。同時,發(fā)現(xiàn)lncRNA 165的表達水平與副豬嗜血桿菌對3D4/21細胞的侵入呈正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌感染可調(diào)節(jié)多種lncRNA的表達,尤其是lncRNA 165在細胞中通過TGF-β信號通路調(diào)控對副豬嗜血桿菌的吞噬。因此,我們得出結(jié)論,lncRNA是副豬嗜血桿菌和宿主相互作用過程中的重要組成部分。

對于本試驗篩選出的lncRNA 165,除了需要了解其在副豬嗜血桿菌和宿主相互作用過程中的功能外,還需要進行更廣泛的功能研究,包括其相關(guān)蛋白的研究,探索其作為檢測副豬嗜血桿菌感染宿主靶標的可能性,為開發(fā)新的診斷和治療方法提供新思路。