宋錦添 陳奕貴* 鄭亮 蔡雄超 王益

福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院&福建省腫瘤醫(yī)院，1 腹部腫瘤內(nèi)科，2 腹部腫瘤外科，福州市 350014

胃癌，僅次于肺癌，是全球第2大癌癥死亡原因[1]。胃癌患者被確診時(shí)通常已處于晚期，多已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，中位生存期約為10～12個(gè)月[2]。臨床上治療晚期胃癌患者最常用的化療藥物是人表皮生長因子受體2(HER2)靶向藥物，但該類藥物具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，患者惡心嘔吐、骨髓抑制和脫發(fā)等副作用嚴(yán)重[3]。腫瘤血管生成在腫瘤發(fā)生過程中的作用越來越受到人們的關(guān)注[4]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGFs)是血管形成過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與受體酪氨酸激酶(RTK)結(jié)合后稱為VEGFR1-R3[5-6]。血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)可以作為靶向位點(diǎn)用于癌癥治療藥物的研發(fā)[7-10]。阿帕替尼是我國自主研發(fā)的一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，可以特異性與細(xì)胞內(nèi)VEGFR2的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤新生血管的生成[11]。阿帕替尼有抗多種實(shí)體瘤的作用，包括肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和晚期卵巢癌等[12-15]。在我國進(jìn)行的胃癌Ⅱ期臨床研究結(jié)果顯示，阿帕替尼是一種治療胃癌的有效藥物[16]。為探討阿帕替尼治療胃癌的作用機(jī)制，本研究就阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和VEGFR通路的影響進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞系HGC-27(貨號(hào)：TCHu 22)和NCI-N87(貨號(hào)：SCSP-534)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)，將其置于10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，貨號(hào)：31800022)中，在37℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。收集第3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理。稱取50 mg阿帕替尼溶于二甲基亞砜(DMSO) 1 mL后放入-20 ℃冰箱保存，使用時(shí)用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.2 CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn) 使用Cell Counting Kit-8試劑盒(上海Beyotime)檢測細(xì)胞增殖情況。對(duì)NCI-N87和HGC-27細(xì)胞分別設(shè)置對(duì)照組及加藥組(10 μM組，20 μM組，30 μM組，40 μM組，50 μM組)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。加藥組細(xì)胞給予不同濃度的阿帕替尼(10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50 μM)處理，對(duì)照組細(xì)胞加相同體積的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后向每個(gè)孔中迅速加入10 μL CCK-8， 37 ℃孵育2 h后使用酶標(biāo)儀(Bio-Rad，CA，USA)檢測每個(gè)孔450 nm處的吸光度。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的NCI-N87和HGC-27細(xì)胞，常規(guī)離心收集，設(shè)對(duì)照組及加藥組，將細(xì)胞接種到6孔板(每孔1×103)中， 37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)24 h。對(duì)照組細(xì)胞給予1‰ DMSO處理，加藥組細(xì)胞分別給予10 μM、20 μM阿帕替尼處理，37℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)2周。細(xì)胞集落用4%多聚甲醛固定30 min，之后用0.5%結(jié)晶紫染色30 min。用無菌水洗去染液，Odyssey掃描拍照，使用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)。

1.4 流式細(xì)胞檢測 取對(duì)數(shù)生長期的NCI-N87和HGC-27細(xì)胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分為對(duì)照組和阿帕替尼處理組。對(duì)照組細(xì)胞給予1‰DMSO處理，阿帕替尼處理組細(xì)胞分別給予10 μM、20 μM阿帕替尼處理。48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集，用FITC-Annexin V/PI試劑(Roche，Basel，Switzerland)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，San Jose，USA)檢測凋亡細(xì)胞情況。

1.5 Western blot NCI-N87及HGC-27細(xì)胞給予10 μM和20 μM阿帕替尼處理，分組。對(duì)照組細(xì)胞給予1‰ DMSO處理，48 h后收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，使用SDS裂解液裂解細(xì)胞，使用BCA分析試劑盒(Bio-Rad，Hercules，美國)測量蛋白質(zhì)濃度。10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，放入預(yù)先配好的Bcl-2(ab32124，1 ∶1000)、Bax(ab32503，1 ∶1 000)、Caspase 3(ab13847，1 ∶500)、Cleaved-Caspase 3(ab2302，1 ∶500)和內(nèi)參β-Actin(ab8227，1 ∶1 000)的一抗緩沖液中4℃孵育過夜。用TBST洗滌30 min后室溫孵育二抗IgG H&L(ab6721，1 ∶3 000)1 h，用TBST緩沖液洗滌30 min。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)檢測條帶灰度值。

采用膜蛋白抽提試劑盒(貨號(hào)：444810，Sigma-Aldrich，Darmstadt，Germany)檢測VEGFR2蛋白水平，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。一抗選擇VEGFR2(ab134191，1 ∶1 000)，二抗選擇IgG H&L(ab6721，1 ∶3000)，內(nèi)參選擇NaK ATPase(ab58475，1 ∶500)。抗體均購自Abcam(上海，中國)，一抗均為兔抗，二抗均為山羊抗兔。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)檢測條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 阿帕替尼抑制胃癌細(xì)胞的增殖 用不同濃度阿帕替尼(10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50 μM)分別處理NCI-N87及HGC-27細(xì)胞48 h，NCI-N87、HGC-27細(xì)胞存活率隨著阿帕替尼濃度增高而降低，見圖1A。根據(jù)48 h時(shí)的IC50值(圖1B)選用10 μM和20 μM的阿帕替尼進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別用10 μM和20 μM的阿帕替尼處理NCI-N87及HGC-27細(xì)胞2周，隨著阿帕替尼濃度的增高，NCI-N87及HGC-27細(xì)胞克隆數(shù)逐漸下降(圖1C)。

圖1 阿帕替尼抑制胃癌細(xì)胞增殖情況

2.2 阿帕替尼誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，隨著阿帕替尼濃度的增加，NCI-N87及HGC-27細(xì)胞凋亡率顯著增加，見圖2A。Western blotting結(jié)果顯示，隨著阿帕替尼濃度的增加，NCI-N87及HGC-27細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高， Cleaved-Caspase3表達(dá)水平升高，見圖2B。

圖2 阿帕替尼誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡情況

2.3 阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞VEGFR通路的影響 Western blotting結(jié)果顯示，隨著阿帕替尼濃度升高，NCI-N87及HGC-27細(xì)胞的VEGFR2蛋白表達(dá)水平均下降，見圖3。

圖3 Western blot檢測VEGFR2蛋白表達(dá)水平

3 討 論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一，晚期胃癌患者病情進(jìn)展迅速、預(yù)后極差，一直是臨床治療的難題[17]。我國自主研發(fā)的阿帕替尼在胃癌患者的臨床治療中表現(xiàn)出具有顯著的療效[18]。為深入探討阿帕替尼治療胃癌的作用機(jī)制，本研究就阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及VEGFR通路的影響進(jìn)行了研究。

細(xì)胞增殖與腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，NCI-N87、HGC-27細(xì)胞的存活率、細(xì)胞克隆數(shù)隨著阿帕替尼濃度的增高而降低，提示阿帕替尼具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用。細(xì)胞凋亡在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和維持其穩(wěn)態(tài)中具有重要意義，目前有很多藥物是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)其抗癌作用，如長春新堿即是通過阻滯細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而達(dá)到治療癌癥的目的[20-21]。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，具有明顯的抑制細(xì)胞凋亡的作用；而Bax是一種促凋亡蛋白，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí)，Caspase 3會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘?Cleaved-Caspase 3，參與細(xì)胞凋亡過程。本研究結(jié)果顯示，隨著阿帕替尼濃度的增加，NCI-N87及HGC-27細(xì)胞凋亡率顯著增加，Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax、Cleaved-Caspase3表達(dá)水平升高，提示阿帕替尼可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。VEGFR是血管內(nèi)皮生長因子受體，對(duì)腫瘤細(xì)胞的血管生成有重要作用[22]。本研究結(jié)果顯示，隨著阿帕替尼濃度的升高，NCI-N87及HGC-27細(xì)胞的VEGFR2蛋白表達(dá)水平下降，提示阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞VEGFR通路具有抑制作用，可阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤新生血管的生長。

綜上所述，阿帕替尼可抑制胃癌細(xì)胞增殖，同時(shí)具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡和抑制VEGFR通路的作用。