李殷康 黎雨 李文濤 柳廣南

廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南寧市 530007

感染性疾病是導(dǎo)致人類死亡的重要原因之一，其中肺部感染患者因其起病急、并發(fā)癥多、病情重、病死率較高近年來需要在重癥監(jiān)護(hù)病房住院治療的各年齡段患者數(shù)量在全球范圍內(nèi)均大幅增加[1]。正確認(rèn)識感染病原體的種類可以幫助臨床醫(yī)生針對性地使用抗生素控制患者的肺部感染，從而改善患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。目前，對感染性疾病常用的檢測方法有常規(guī)微生物培養(yǎng)及聚合酶鏈反應(yīng)等，但這些方法的靈敏度和特異度有限，已不能滿足臨床診斷的需要[2]。宏基因組測序技術(shù)為Handelsman等[3]提出的一項(xiàng)新技術(shù)，可對樣本提取到的所有微生物的遺傳序列進(jìn)行檢測，并將檢測得到的遺傳序列與數(shù)據(jù)庫中的病原菌特異性基因序列比對從而確定病原體的種類，該技術(shù)目前已經(jīng)成為檢測病原微生物的一種新興方法。本研究對我科收治的60例肺部感染患者的肺泡灌洗液進(jìn)行了宏基因組二代測序(mNGS)檢測，并與常規(guī)涂片+培養(yǎng)的病原菌檢測方法進(jìn)行了比較分析，旨為肺部感染患者的病原體診斷增添新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月至2020年5月廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的肺部感染患者60例作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合美國胸科協(xié)會(huì)關(guān)于肺部感染的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)肺部聽診可聞及啰音；(3)病情危重需要盡快明確肺部感染病原體；(4)特殊疾病患者如免疫抑制、合并基礎(chǔ)疾病、反復(fù)住院的重癥感染患者等，需要盡快明確肺部感染病原體；(5)傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)反復(fù)檢測結(jié)果均為陰性且治療效果不佳；(6)臨床懷疑為RNA病毒感染，如流感病毒感染等所致；(7)疑似某種特殊病原體感染；(8)長期發(fā)熱和(/或)伴有其他臨床癥狀、病因不明的肺部感染[4]；(9)患者或其家屬簽署檢測研究知情同意書。納入研究的60例患者中，男41例、女19例；年齡19～83歲，平均(51.5±16.0)歲。

1.2 方法

1.2.1 纖支鏡檢查前準(zhǔn)備 檢查前1天囑患者睡前使用益口含漱液清潔口腔，5 mL/次，重復(fù)3次，含漱時(shí)間2～3 min/次，最后用無菌生理鹽水100 mL清潔?；颊邫z查日晨起后禁食禁飲，再次使用益口含漱液清潔口腔，5 mL/次，重復(fù)3次，含漱時(shí)間2～3 min/次，最后用無菌生理鹽水100 mL清潔。益口含漱液的主要成分為三氯羥基二苯醚，是一種高效廣譜抗菌劑，可以有效抑制口腔細(xì)菌滋生，防止口腔定植菌隨唾液流入氣道內(nèi)引起標(biāo)本污染，常用于危重癥患者的口腔護(hù)理[4]。

1.2.2 標(biāo)本采集 推送Olympus P260纖維支氣管鏡前端至CT影像提示病變的支氣管亞段，使用37℃無菌生理鹽水100 mL進(jìn)行肺泡灌洗，回抽肺泡灌洗液，回抽的肺泡灌洗液不少于30 mL視為標(biāo)本合格[5]，將所得肺泡灌洗液平均分裝入2個(gè)無菌容器后分別送檢。

1.2.3 病原體檢測 (1)mNGS檢測：采用美國illumina高通量測序技術(shù)對樣本中的微生物DNA遺傳序列進(jìn)行宏基因組分析，將去除背景污染菌后得到的微生物遺傳序列與數(shù)據(jù)庫中微生物特異性核酸序列進(jìn)行比對，并結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)，對患者肺部感染的病原體進(jìn)行鑒定。(2)常規(guī)涂片+培養(yǎng)：采用美國BD公司生產(chǎn)的全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)microfiex LT/SH聯(lián)合鏡下形態(tài)觀察對患者肺部感染的病原菌進(jìn)行鑒定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病原體檢出情況比較 納入研究的60例患者中，進(jìn)行mNGS檢測，檢出病原微生物的患者共50例；進(jìn)行常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測，檢出病原微生物的患者共14例。見表1。

表1 60例患者的mNGS檢測與常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測的病原微生物檢出結(jié)果 (n)

2.2 mNGS與常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測的各種病原微生物檢出率比較 納入研究的60例患者中，進(jìn)行mNGS檢測，檢出病原微生物的患者共50例，檢出率為83.33%；進(jìn)行常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測，檢出病原微生物的患者共14例，檢出率為23.33%。對肺部感染患者，進(jìn)行mNGS檢測的病原微生物總檢出率顯著高于進(jìn)行常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩種檢測方法的各種病原微生物檢出率比較詳見表2。

表2 mNGS與常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測的各種病原微生物檢出率比較 [ n(%)]

3 討 論

目前對細(xì)菌、真菌和病毒導(dǎo)致的感染性疾病進(jìn)行診斷，主要是以采取標(biāo)本培養(yǎng)等手段從而獲得并對病原體作出鑒定作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但這些方法存在以下幾個(gè)缺點(diǎn)：(1)常規(guī)標(biāo)本培養(yǎng)耗時(shí)較長，通常為72 h左右，結(jié)核桿菌的培養(yǎng)時(shí)間更是長達(dá)2～6周甚至8周；(2)目前通過常規(guī)培養(yǎng)獲得的病原體種類非常有限，常規(guī)培養(yǎng)基對于苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)難以成功，對苛養(yǎng)菌進(jìn)行培養(yǎng)需要加入特定的營養(yǎng)物質(zhì)[6]；(3)常規(guī)微生物培養(yǎng)陽性率僅為13.79%～17.39%[7]；(4)存在標(biāo)本保存、轉(zhuǎn)運(yùn)、檢測過程等諸多環(huán)節(jié)，易造成標(biāo)本污染而出現(xiàn)假陽性。但對于基層醫(yī)療單位而言，盡管常規(guī)微生物培養(yǎng)的陽性率低，目前仍然是一種不可或缺的檢測手段。

mNGS可對提取到的樣本中的所有微生物的遺傳序列進(jìn)行檢測，并與數(shù)據(jù)庫中的病原菌特異性基因序列進(jìn)行對比，最后鑒定出一系列可能的感染菌群。mNGS可檢測的對象包括細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、衣原體及寄生蟲等，對罕見的病原菌感染的判斷較常規(guī)培養(yǎng)檢測具有突出的優(yōu)勢。

本研究結(jié)果顯示，細(xì)菌是肺部感染患者的主要病原體，但常規(guī)涂片+培養(yǎng)對細(xì)菌的檢出率較低，對結(jié)核分枝桿菌更是難以檢出；常規(guī)涂片+培養(yǎng)對肺部感染患者的病毒、真菌以及分枝桿菌的檢出率均顯著低于mNGS。Shah等[8]認(rèn)為，在呼吸系統(tǒng)感染中，病毒感染一直未得到足夠重視，是因?yàn)楝F(xiàn)有的檢測手段極少、技術(shù)滯后?？股氐臑E用、耐藥菌的出現(xiàn)、檢驗(yàn)手段更新慢、抗菌藥物研發(fā)滯后導(dǎo)致對肺部感染患者的診治變得愈發(fā)艱難。我國當(dāng)今已經(jīng)成為世界抗生素的生產(chǎn)大國和消費(fèi)大國之一，抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥性從最初的單一耐藥逐步演變?yōu)槎嘀啬退帲玖?qiáng)耐藥菌的產(chǎn)生無疑會(huì)顯著增加臨床醫(yī)生的工作難度，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后及生存質(zhì)量[9-10]。美國馬里蘭大學(xué)帕克學(xué)院為進(jìn)一步認(rèn)識耐藥菌及其相關(guān)信息，創(chuàng)建了抗生素耐藥性基因數(shù)據(jù)庫，目前該庫收錄的耐藥菌已多達(dá)380余種[11]。事實(shí)證明，僅靠常規(guī)的涂片與培養(yǎng)技術(shù)診斷病原菌已經(jīng)難以滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診療的需要，而mNGS檢測能憑借其先進(jìn)的技術(shù)，通過對樣本中病原體的核酸進(jìn)行檢測，無需培養(yǎng)便可以快速檢出病原菌，具有快速、準(zhǔn)確、覆蓋范圍廣泛等突出優(yōu)勢，無疑給多重感染的診斷提供了新的手段，同時(shí)還可以進(jìn)一步完善微生物的耐藥基因和毒力檢測，為臨床醫(yī)生針對性用藥提供重要依據(jù)[12]。

2019年末暴發(fā)的新型冠狀病毒肺炎如今已在全世界蔓延，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的診療方案(試行第六版)診斷標(biāo)準(zhǔn)中再次肯定了病毒基因核酸測序和COVID-19高度同源即可確診的診斷標(biāo)準(zhǔn)，這項(xiàng)診斷標(biāo)準(zhǔn)得到了中外學(xué)者的認(rèn)可[13-14]。但是，歷經(jīng)多年的發(fā)展后雖然mNGS的檢測費(fèi)用已較以前明顯降低，但仍然遠(yuǎn)高于常規(guī)涂片+培養(yǎng)的檢測費(fèi)用，因此目前難以作為普通檢測項(xiàng)目進(jìn)行推廣普及。隨著檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步以及多檢測平臺的競爭發(fā)展，相應(yīng)的檢測費(fèi)用會(huì)逐步下降，屆時(shí)二代測序技術(shù)將得以推廣應(yīng)用，更好地為患者提供服務(wù)。