黃浩 石碩 王永勇 譚翔 戴磊 梁冠標(biāo) 陳銘伍

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530021

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率極高的癌癥[1]，其中肺鱗狀細(xì)胞癌(lung squamous cell carcinoma, LUSC)是一種常見的非小細(xì)胞肺癌亞型，占所有肺癌的25%～30%[2]。LUSC與吸煙密切相關(guān)，癌細(xì)胞中的靶向驅(qū)動基因頻率可能較低，具有高度的異質(zhì)性，目前有效的靶向藥物少，給臨床精確治療帶來了很大的困難。配對盒(paired box, PAX)基因是一類進化保守的基因家族，PAX基因是與生長發(fā)育調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，在胚胎發(fā)育、組織器官形成和分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。PAX9在多種腫瘤組織中異常表達，在人類口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌和唾液腺腫瘤中高表達[4]，而在食管鱗狀細(xì)胞癌和黑色素瘤中低表達[5-6]。Hsu等[7]報道，PAX9參與了多種細(xì)胞信號通路如Wnt、PI3K/AKT和BMP等，并受原癌基因c-myb的調(diào)控，PAX9基因可能在LUSC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究就PAX9基因在LUSC中的表達情況和臨床意義進行了探討，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫的采集和整理 從TCGA官方網(wǎng)站(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取TCGA-LUSC數(shù)據(jù)集，數(shù)據(jù)集包括488例LUSC患者的基因測序數(shù)據(jù)和預(yù)后數(shù)據(jù)。從Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)獲取GSE21933數(shù)據(jù)集和GSE73403數(shù)據(jù)集。GSE21933數(shù)據(jù)集包括11例成對的LUSC組織和鄰近正常肺組織的測序數(shù)據(jù)，GSE73403數(shù)據(jù)集包括69例LUSC樣本的臨床和預(yù)后資料，用于生存分析。利用limma軟件包對不同芯片的表達數(shù)據(jù)進行分位數(shù)歸一化，使其達到同一水平。

1.2 LUSC患者癌組織及癌旁組織的PAX9基因表達檢測 選取2019年6月至2020年11月廣西醫(yī)科大學(xué)收治的34例LUSC患者為研究對象，收集患者術(shù)后的LUSC組織和癌旁組織，病理學(xué)確認(rèn)。患者在術(shù)前均未接受放療、化療、介入治療以及靶向治療；所有受試者簽署知情同意書；研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批號為201910016)。

1.3 細(xì)胞株 人肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(NCI-H520)購自上海中喬新舟生物技術(shù)有限公司；人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)購自上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司。兩種細(xì)胞在實驗前均經(jīng)STR鑒定，用支原體檢測試劑盒進行支原體檢測。

1.4 定量實時RT-PCR(qRT-PCR) 用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，用PrimeScriptTM RT試劑盒(Takara)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master (德國默克公司)進行qRT-PCR。內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，GAPDH擴增引物：

上游引物(F)：5′-GTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，

下游引物(R)：5′-CGCCCAATACGACCAAAT-3′。

PAX9基因擴增引物：

上游引物(F)：5′-AGGAAGCCAGTACGGTCAG-3′，

下游引物(R)：5′-ATGTAAGGCGACCTTGGGC-3′。

引物序列由北京擎科生物技術(shù)有限公司設(shè)計和合成。

1.5 蛋白質(zhì)印跡實驗(Western Blot) 用RIPA裂解緩沖液(索萊寶公司)和1 mM苯甲基磺酰氟(索萊寶公司)提取細(xì)胞的總蛋白。用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Beyotime Biotechnology)測定蛋白質(zhì)濃度后，運用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)測定蛋白表達情況。在ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)中觀察所有蛋白條帶。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 用含有10%胎牛血清(以色列BI生物工業(yè)公司)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)NCI-H520和BEAS-2B。PAX9 siRNA (si-PAX9)和siRNA NC(si-NC)由RiboBio (Guangzhou, China)設(shè)計合成。將50 nM si-PAX9和50 nM si-NC用于NCI-H520細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48 h后，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用PCR鑒定轉(zhuǎn)染效率。采用的試劑盒為 Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟按照試劑盒說明書進行。

1.7 CCK-8試驗 轉(zhuǎn)染48 h后，分別將si-PAX9 NCI-H520和si-NC NCI-H520細(xì)胞以2×103的密度接種在96孔板中，每組設(shè)置6個重復(fù)，分別在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h時加入10 μL CCK-8試劑(日本東仁公司)。用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。

1.8 平板克隆試驗 轉(zhuǎn)染48 h后，分別將si-PAX9和si-NC NCI-H520細(xì)胞以1×103的密度接種在96孔板中，每組設(shè)置3個重復(fù)并培養(yǎng)14 d。14 d后，用1%多聚甲醛在4℃固定菌落30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min。用ImageJ軟件測量每孔克隆數(shù)。

1.9 傷口愈合試驗 轉(zhuǎn)染48 h后，分別將si-PAX9 NCI-H520和si-NC NCI-H520細(xì)胞種植于六孔板中，每組設(shè)置3個重復(fù)。當(dāng)細(xì)胞貼壁后，用100 μL的槍頭劃痕。24 h后觀察細(xì)胞劃痕并拍照。

1.10 細(xì)胞周期測定 轉(zhuǎn)染48 h后，收集si-PAX9 NCI-H520和si-NC NCI-H520細(xì)胞，PBS清洗2次，4℃、70%預(yù)冷乙醇中固定過夜。第2天，用PBS洗滌細(xì)胞，按照說明書(江蘇凱基公司)使用碘化丙啶染色，在CytoFLEX流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞周期。用FlowJo分析CytoFLEX的結(jié)果。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料的兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。繪制ROC曲線，分析PAX9基因在TCGA-LUSC、GSE21933數(shù)據(jù)集中的診斷效能。將TCGA-LUSC、GSE73403數(shù)據(jù)集中的PAX基因和具有臨床意義的指標(biāo)用于構(gòu)建列線圖模型，并采用基于生存分析的算法構(gòu)建LUSC總體生存評估模型。將數(shù)據(jù)集的樣本分為訓(xùn)練組和驗證組，在列線圖構(gòu)建完成后，將訓(xùn)練集和驗證集分別作為內(nèi)部訓(xùn)練數(shù)據(jù)集和外部驗證數(shù)據(jù)集，評估列線圖模型的性能。采用Kaplan-Meier法、log-rank檢驗分析比較不同PAX9表達水平LUSC患者的總體生存率。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PAX9基因診斷LUSC的效能 基于TCGA-LUSC數(shù)據(jù)集，繪制ROC曲線進行分析發(fā)現(xiàn)，PAX9診斷LUSC的效能良好(AUC=0.900，P<0.001，見圖1A)；基于GSE21933數(shù)據(jù)集繪制ROC進行分析發(fā)現(xiàn)，PAX9診斷LUSC的效能良好(AUC=0.960，P<0.001，見圖1B)。

圖1 基于TCGA-LUSC、GSE21933數(shù)據(jù)集的PAX9診斷LUSC的ROC曲線

2.2 建立LUSC患者預(yù)后列線圖模型 建立基于TCGA-LUSC數(shù)據(jù)集的PAX9表達、吸煙和病理分期的列線圖，建立LUSC患者預(yù)后的列線圖模型(見圖2A)，進行內(nèi)部驗證得到C指數(shù)為0.864，利用列線圖預(yù)測LUSC患者1年、3年和5年生存率的準(zhǔn)確性和特異性較高(圖2B～圖2E)。

圖2 基于TCGA-LUSC數(shù)據(jù)集的PAX9表達、吸煙和病理分期的列線圖、內(nèi)部數(shù)據(jù)驗證和C索引(圖2A：列線圖；圖2B～圖2D： 1年、3年和5年生存期的內(nèi)部驗證數(shù)據(jù)集；圖2E：列線圖的C索引)

建立基于GSE73403數(shù)據(jù)集的PAX9表達、吸煙和病理分期的列線圖(見圖3A)，進行內(nèi)部驗證得到C指數(shù)為0.795,利用列線圖預(yù)測LUSC患者1年、3年和5年生存率的效果良好(見圖3B～圖3D)。

圖3 基于GSE73403數(shù)據(jù)集的PAX9表達、吸煙和病理分期的列線圖、內(nèi)部數(shù)據(jù)驗證和C索引(圖3A：列線圖；圖3B～圖3D： 1年、3年和5年生存期的內(nèi)部驗證數(shù)據(jù)集；圖3E：列線圖的C索引)

2.3 不同PAX表達水平LUSC患者的生存分析 利用TCGA-LUSC、GSE73403數(shù)據(jù)集進行生存分析發(fā)現(xiàn)，PAX9低表達的LUSC患者的總體生存率均顯著低于PAX9高表達的LUSC患者(均P<0.05)。見圖4。

圖4 基于TCGA- LUSC數(shù)據(jù)集和GSE73403數(shù)據(jù)集的LUSC患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 LUSC患者癌組織及癌旁正常組織的PAX9基因表達情況 34例LUSC患者癌組織PAX9基因表達水平顯著低于其癌旁正常組織(P<0.05)。見圖5。

圖5 LUSC患者癌組織及其癌旁正常組織的PAX9基因表達水平比較

2.5 NCI-H520、BEAS-2B細(xì)胞的PAX9蛋白、基因的表達情況 NCI-H520 PAX9的蛋白、基因表達水平均顯著低于BEAS-2B(P<0.05)的表達水平。見圖6。

圖6 NCI-H520、BEAS-2B細(xì)胞的PAX9蛋白、基因的表達情況

2.6 PAX9基因敲除對NCI-H520細(xì)胞活力的影響 PAX9基因敲除試驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)96 h后的si-PAX9轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞的活力顯著高于si-NC對照組和空白組NCI-H520細(xì)胞活的力(P<0.05)。見圖7。

圖7 si-PAX9、si-NC和空白組NCI-H520細(xì)胞的活力比較

2.7 平板克隆試驗、傷口愈合試驗及細(xì)胞周期測定 平板克隆試驗結(jié)果提示，si-PAX9轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞的克隆數(shù)顯著多于si-NC轉(zhuǎn)染組(P<0.05，見圖8A)。傷口愈合試驗結(jié)果提示，si-PAX9轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞的愈合速度顯著快于si-NC轉(zhuǎn)染組(P<0.05，見圖8B)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與si-NC轉(zhuǎn)染組、空白組比較，si-PAX9轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞處于S期的細(xì)胞明顯減少，處于G2期的細(xì)胞明顯增加(見圖8C)。

圖8 si-PAX9轉(zhuǎn)染組、si-NC轉(zhuǎn)染組和空白組NCI-H520細(xì)胞的克隆情況、細(xì)胞損傷情況和細(xì)胞周期比較

3 討 論

肺鱗狀細(xì)胞癌(LUSC)患者起病隱匿，被診時往往已經(jīng)處于癌癥中晚期，預(yù)后差，生存率較低。在靶向治療中，由于LUSC的EGFR突變和ALK基因的重排發(fā)生率低[8]，因此只有少數(shù)LUSC患者可以采用EGFR和ALK抑制劑進行治療，并且有效率不高，療效局限[9]。尋找LUSC相關(guān)的新靶點，提高LUSC患者的診斷和靶向治療效率，才能提高LUSC患者的總體生存率。

研究[10-15]發(fā)現(xiàn)，PAX9是參與細(xì)胞分化和組織發(fā)育的一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在食管鱗狀細(xì)胞癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等鱗癌組織中異常表達，miRNA-31可以通過調(diào)節(jié)下游靶點PAX9來影響肺癌的發(fā)生，認(rèn)為PAX9基因可能在LUSC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

為探討PAX9基因在LUSC中的表達情況和臨床意義，本研究通過TCGA官方網(wǎng)站獲取TCGA-LUSC數(shù)據(jù)集，從Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫獲取GSE21933數(shù)據(jù)集和GSE73403數(shù)據(jù)集，同時選取34例LUSC患者為研究對象對其癌組織及癌旁組織的PAX9基因表達情況進行了檢測分析等研究。結(jié)果顯示，基于TCGA-LUSC及GSE21933數(shù)據(jù)集繪制ROC曲線進行分析發(fā)現(xiàn)，PAX9診斷LUSC的效能良好(AUC=0.900；AUC=0.960)。建立基于TCGA-LUSC數(shù)據(jù)集的PAX9表達、吸煙和病理分期的列線圖，建立基于GSE73403數(shù)據(jù)集的PAX9表達、吸煙和病理分期的列線圖，建立LUSC患者預(yù)后的列線圖模型進行分析發(fā)現(xiàn)，利用列線圖預(yù)測LUSC患者1年、3年和5年生存率的效果良好。利用TCGA-LUSC、GSE73403數(shù)據(jù)集進行生存分析發(fā)現(xiàn)，PAX9低表達的LUSC患者的總體生存率均顯著低于PAX9高表達的LUSC患者。蛋白、基因表達的檢測結(jié)果顯示，LUSC患者癌組織PAX9的基因表達水平顯著低于其癌旁正常組織；人肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(NCI-H520)PAX9的蛋白、基因表達水平均顯著低于人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)的表達水平。PAX9基因敲除試驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)96 h后的si-PAX9轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞的活力顯著高于si-NC對照組和空白組NCI-H520細(xì)胞的活力；平板克隆試驗結(jié)果顯示，si-PAX9轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞的克隆數(shù)顯著多于si-NC轉(zhuǎn)染組；傷口愈合試驗結(jié)果顯示，si-PAX9轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞的愈合速度顯著快于si-NC轉(zhuǎn)染組；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與si-NC轉(zhuǎn)染組、空白組比較，si-PAX9轉(zhuǎn)染組NCI-H520細(xì)胞處于S期的細(xì)胞明顯減少，處于G2期的細(xì)胞明顯增加。結(jié)果提示，PAX9是LUSC的抑癌基因，PAX9的表達水平與LUSC的發(fā)病以及患者的預(yù)后密切相關(guān)，PAX9基因與LUSC細(xì)胞的增殖、遷移和克隆有關(guān)。