唐志銘，丁繼存，翟曉翔，荊夢晴，王蒙蒙，陸 鷺

瘢痕疙瘩是因皮膚遭受創(chuàng)傷和刺激后真皮網狀層出現慢性炎癥[1]，從而導致成纖維細胞大量增殖和以膠原為主的細胞外基質過度沉積所致。其確切發(fā)生機制尚未闡明，也無理想的治療方法[2]。本課題組應用五倍子瘢痕膏治療瘢痕疙瘩臨床療效確切[3]，且前期實驗研究證實其能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖[4]，但具體作用機制尚不清楚。有研究者應用基因芯片技術證明miRNA在病理性瘢痕與正常皮膚組織中存在差異性表達[5,6]，其中miR-21在增生性瘢痕組織中表達顯著高于正常皮膚組織[7]。有研究表明miR-21可靶向抑制10號染色體張力缺失蛋白磷酸酶（phospatase and tensin homologdeleted on chromasom ten，PTEN）表達[8]，而PTEN是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路的負反饋調控因子。mTOR信號通路與細胞異常增殖密切相關，在瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖過程中具有重要作用[9]。五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖是否與其通過miR-21靶向調控mTOR通路有關？本課題組對此進行了研究探索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 兔抗人磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、PTEN、p-mTOR單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（Jackson免疫研究公司）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海索萊寶生物科技有限公司）、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega公司）、miR-21 mimic、miR-21 inhibitor（ 廣州銳博生物科技有限公司）、反轉錄試劑 盒 superscript III 、Lipofectamine 2000 轉 染 試劑、pmirGLO質粒載體（美國Invitrogen公司）。

1.1.2 主要儀器 聚合酶鏈反應（PCR）儀（加拿大Funglyn Biotech公司）、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Quantity-one凝膠成像分析系統、酶標儀（美國Bio-Rad公司）、紅外熒光成像儀（美國Li-Cor公司）、Image Pro-Plus圖像分析系統（美國Media Cybernetics公司）、流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.1.3 標本來源 標本來自徐州市中醫(yī)院皮膚科瘢痕疙瘩患者手術切除治療后的前胸部瘢痕疙瘩組織及鄰近正常皮膚組織。所有取材操作均經徐州市中醫(yī)院倫理委員會批準，且患者或其家屬簽署知情同意書。患者瘢痕疙瘩均處于增生活躍期，術前1年內未接受任何治療，并且無系統性疾病，無腫瘤病史。經術后組織病理檢查均證實為瘢痕組織，其中男3例，女5例，共8份瘢痕疙瘩組織標本，8份正常皮膚組織標本。

1.2 方法

1.2.1 瘢痕疙瘩成纖維細胞分離、培養(yǎng) 將所切取的瘢痕疙瘩及正常皮膚組織剪成1 mm3大小的組織塊，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化14 h后，200目篩網過濾，收集濾液；將濾液離心，1 000 r/min，7 min，棄上清液；用含10%胎牛血清的DMEM液5 ml混勻沉淀細胞，置于1個25 ml的培養(yǎng)瓶中；在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后，用含10%胎牛血清的DMEM換液。細胞接近長滿時，按1:3比例進行傳代。本實驗選用第3代細胞。

1.2.2 實驗分組 實驗分為7組：空白對照組（MOCK）、miR-21 mimic 組（MIM）、0.5 mg/ml五 倍子瘢痕膏提取液 +mimic組（0.5 mg/ml Galla+MIM）、1 mg/ml五倍子瘢痕膏提取液 +mimic組（1 mg/ml Galla+MIM）、miR-21 inhibitor 組（IN）、0.5 mg/ml五倍子瘢痕膏提取液 +inhibitor組（0.5 mg/ml Galla+IN）、1 mg/ml五倍子瘢痕膏提取液+inhibitor組（1mg/ml Galla+IN）。

1.2.3 將第3代成纖維細胞配成單個細胞懸液，以1.0×l04/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至融合度為60%～70%時，更換無血清培養(yǎng)基后進行轉染，MIM 組、0.5 mg/ml Galla+MIM 組 及 1 mg/ml Galla+MIM 組轉染 miR-21 mimic，而 IN 組、0.5 mg/ml Galla+IN 組 及 1 mg/ml Galla+IN 組 轉 染 miR-21 inhibitor，MOCK組不轉染。轉染12 h后吸去培養(yǎng)板孔內舊培養(yǎng)液，再每孔加入DMEM液180 μl，然后各個實驗組分別加入相應濃度五倍子瘢痕膏提取液[為五倍子瘢痕膏藥物組方（五倍子、蜈蚣、丹參、威靈仙、地骨皮、黑醋、白礬）的提取物]20 μl，MOCK組則加入含10%胎牛血清的DMEM液20 μl，培養(yǎng)24 h后收集細胞提取總RNA，48 h后收集細胞提取蛋白。

1.2.4 逆轉錄（RT）-PCR檢測miR-21、PTEN mRNA的表達 將所切取的瘢痕疙瘩和正常皮膚組織制成組織勻漿后用RT-PCR試劑盒進行總RNA提取。瘢痕疙瘩成纖維細胞按前述方法分離培養(yǎng)及分組干預后，標準環(huán)境下孵育24 h，然后采用RT-PCR試劑盒進行總RNA提取。電泳鑒定提取RNA的完整性。取6 μl RNA 為反轉錄模板。反轉錄反應體系為 20 μl，反應條件 ：37℃ 1 h，95℃ 3 min。標準曲線定量法制備cDNA模板標準品，依次10倍梯度稀釋，制備成5個梯度的cDNA模板定量標準品。內參基因選用?-肌動蛋白，在GenBank數據庫中獲得目的基因mRNA序列，采用Primer express2.0軟件，在CDS區(qū)設計特異性引物。引物序列見表1。

表1 miR-21、PTEN基因引物序列及擴增產物片段長度

PCR反應體系為50 μl，反應條件：93℃預變性3 min，93℃變性 30 s，57℃退火 30 s，共循環(huán) 30 次，72℃延伸 5 min。取 6 μl PCR 產物于 1.5% 瓊脂糖凝膠中電泳，用Quantity-one凝膠成像分析系統分析各條帶的灰度值，以各目的基因與內參基因U6的灰度值比值表示mRNA的相對表達量。

1.2.5 Western Blot檢測 PTEN、PI3K、P-Akt、p-mTOR蛋白的表達 收集培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液洗2次，加入細胞裂解液，在冰面上靜置 10 ～ 20 min，用細胞刮勻漿后，4℃下 15 000 r/min離心10 min，取上清。用Lowry 法對上清進行蛋白定量，取50 μg蛋白上樣到15% 的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。待溴酚藍進入凝膠底部后，將蛋白質再印跡到硝酸纖維素膜上，加入一抗4℃孵育過夜，最后加入HRP標記的相應二抗，室溫孵育1 h，洗膜后，odyssey紅外熒光成像儀掃描膜并成像，成像圖用Image Pro-Plus圖像分析系統測定其灰度值，以?-肌動蛋白為內參計算蛋白相對表達量。

1.2.6 螢光素酶報告基因檢測 應用生物信息學方法預測miR-21與PTEN mRNA 的結合位點，然后合成PTEN-WT 3'UTR和PTEN-MT 3'UTR引物序列，并插入雙酶切位點。以人瘢痕成纖維細胞基因組 DNA為模板進行 PCR擴增，獲得含miR-21靶序列的3'-UTR基因片段?；厥掌危盖衟mirGLO與3'-UTR基因片段連接，構建野生型pmirGLO -PTEN-3'UTR-WT和突變型pmirGLOPTEN-3'UTR-MT重組載體質粒。應用Lipofectamine 2000 轉染試劑，將PTEN野生型和突變型質粒分別與 miR-21 mimic、miR-21 inhibitor及陰性對照共轉染瘢痕疙瘩成纖維細胞72 h，然后應用螢光素酶檢測試劑盒檢測螢光素酶活性。

1.2.7 CCK8法檢測細胞增殖狀況 將瘢痕疙瘩成纖維細胞以1.0×l04/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，每組設8個復孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，吸去細胞上清液，加入無血清DMEM培養(yǎng)液100 μl靜置24 h，使其同步化。吸去培養(yǎng)板孔內舊培養(yǎng)液，按分組加入含相應濃度藥品的培養(yǎng)液100 μl，空白對照組則直接加入 DMEM 液 100 μl。繼續(xù)培養(yǎng)，然后分別于不同時間點（24 h、36 h、48 h），每孔加入 CCK-8 10 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，在酶標儀波長490 nm處測定各孔吸光度（A）值，以A值大小表示細胞增殖能力。

1.2.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期情況 收集培養(yǎng)48 h后的瘢痕疙瘩成纖維細胞，PBS洗3次，將Annexin V-FITC 5 μL 加入細胞懸液 195 μl中，避光孵育 15 min，加入碘化丙啶（ PI） 5 μl，4℃避光反應5 min，然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率及細胞周期各時相DNA水平。

1.3 統計學方法

應用SPSS20.0軟件對實驗數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，多樣本均數間的兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖狀況

CCK8法檢測結果顯示，miR-21 mimic能明顯促進瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，而五倍子瘢痕膏提取液能減弱這一作用且呈時間、濃度依賴性（圖1a）；miR-21 inhibitor能明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，而五倍子瘢痕膏提取液能增強這一作用且呈時間、濃度依賴性（圖1b）。

圖1 各組瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖狀況

2.2 瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡及周期情況

流式細胞儀檢測結果顯示（n=8），MIM組、0.5 mg/ml Galla+MIM 組 及 1 mg/ml Galla+MIM 組 瘢 痕疙瘩成纖維細胞總凋亡率分別為3.13±0.78、5.10±1.02、8.19±1.26，均低于MOCK組（10.17±1.64），差異具有統計學意義（P＜0.05，圖2）；IN組、0.5 mg/ml Galla+IN 組及 1 mg/ml Galla+IN 組瘢痕疙瘩成纖維細胞總凋亡率分別為18.36±2.37、22.50±2.65、29.47±2.86，均高于MOCK組，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖2）。

細胞周期分析結果顯示，與MOCK組[G1期、S 期細胞比例分別為（57.7±5.8）%、（20.5±2.7）%]相比， MIM 組 [（32.8±3.2）%、（21.3±2.9）%]、0.5 mg/ml Galla+MIM 組 [（38.4±3.5）%、（19.5±2.5）%]及 1 mg/ml Galla+MIM 組 [（47.8±4.5）%、（15.6±2.2）%]G1期、S 期細胞比例降低；與MOCK相比，IN 組、0.5 mg/ml Galla+IN 組及 1 mg/ml Galla+IN 組G1期細胞比例 [分別為（67.6±5.8）%、（70.7±6.3）%、（75.5±6.8）%]明顯性增加，尤以 1 mg/ml Galla+MIM組增加明顯，而S 期細胞比例降低[分別為（12.4±2.4）%、（11.3±2.1）%、（15.8±3.2）%]（圖3）。

2.3 雙螢光素酶報告基因實驗結果

將野生型或突變型PTEN-3'UTR質粒與miR-21 mimic、miR-21 inhibitor或陰性對照（miR-NC）共轉染到瘢痕疙瘩成纖維細胞中（n=8），然后檢測熒光素酶相對活性。結果顯示，共轉染野生型pmirGLO-PTEN-3'UTR-WT質粒轉染時，miR-21 mimic能降低螢光素酶活性（0.28±0.07），而miR-21 inhibitor能增加螢光素酶活性（1.56±0.17），與陰性對照組（1.00±0.00）相比具有顯著性差異（P＜0.05，圖4）；而共轉染突變型pmirGLO-PTEN-3'UTR-MT質粒，兩組螢光素酶活性（1.01±0.03、0.98±0.02）與陰性對照組（1.00±0.00）相比均無明顯變化（P＞0.05）。這提示 miR-21可直接結合于 PTEN 3'-UTR，靶控 PTEN的表達。

圖4 雙螢光素酶報告基因實驗結果

2.4 瘢痕疙瘩組織中miR-21、PTEN的表達

RT-PCR檢測結果顯示（n=8），與正常皮膚組織（0.73±0.04）相比，miR-21在瘢痕疙瘩組織中（1.76±0.13）表達明顯增加（P＜0.05，圖5a）；Western blot檢測結果顯示（n=8），與正常皮膚組織（2.13±0.21）相比，瘢痕疙瘩組織中（0.94±0.10）PTEN表達顯著降低（P＜0.05，圖5b，5c）。Pearson法相關性分析顯示，miR-21與PTEN 相對表達量呈負相關（r=-0.772，P＜ 0.05）。

圖5 正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中miR-21及 PTEN表達

2.5 瘢痕疙瘩成纖維細胞中miR-21、PTEN mRNA的表達

RT-PCR檢測結果顯示（n=8），與MOCK組（1.00±0.00）相比，miR-21mRNA相對表達量在MIM組、0.5 mg/ml Galla+MIM 組及 1 mg/ml Galla+MIM 組（分別為8.13±0.97、6.26±0.86、4.37±0.81）中增加，尤以MIM組表達量增加明顯（P＜0.01，圖6a），而PTEN mRNA相對表達量（分別為0.29±0.04、0.44±0.06、0.68±0.08）降低，尤以MIM組表達量降低明顯（P＜0.05，圖6b）。與MOCK組（1.00±0.00）相比，miR-21mRNA相對表達量在IN組、0.5 mg/ml Galla+IN組及1mg/ml Galla+IN組（分別為0.69±0.08、0.45±0.07、0.28±0.04） 中 降 低， 尤 以 1 mg/ml Galla+IN組表達量降低明顯（P＜0.05，圖6c），而PTEN mRNA相對表達量（分別為8.85±1.04、10.39±1.26、12.99±1.82）增加，尤以 1 mg/ml Galla+IN組表達量增加明顯（P＜0.01，圖6d）。

圖6 各組瘢痕疙瘩成纖維細胞miR-21、PTEN mRNA相對表達量

2.6 瘢痕疙瘩成纖維細胞PI3K、PTEN、p-Akt、p-mTOR蛋白表達

Western Blot檢測結果顯示（n=8），PI3K 蛋白相對表達量在 MIM 組、0.5 mg/ml Galla+MIM 組及1mg/ml Galla+MIM 組分別為 0.80±0.07、0.87±0.08、0.88±0.11，與MOCK組（1.00±0.00）相比無明顯差異（P＞ 0.05），在 IN 組、0.5 mg/ml Galla+IN 組及 1 mg/ml Galla+IN 組分別為 1.02±0.17、0.95±0.15、0.95±0.14，與MOCK組（1.00±0.00）相比亦無明顯差異（P＞0.05，圖7a）。

圖7 各組瘢痕疙瘩成纖維細胞PI3K、PTEN、p-Akt、p-mTOR蛋白表達

與MOCK相比（1.00±0.00），MIM組、0.5 mg/ml Galla+MIM 組 及 1 mg/ml Galla+MIM 組 PTEN 蛋白相對表達量（分別為0.53±0.04、0.74±0.06、0.83±0.08）降低，尤以MIM組降低明顯（P＜0.05，圖 7b）；與 MOCK 相比（1.00±0.00）， MIM 組、0.5 mg/ml Galla+MIM組p-Akt蛋白相對表達量（分別為1.54±0.17、1.44±0.16）及p-mTOR蛋白相對表達量（分別為1.38±0.18、1.27±0.21）增加，而1 mg/ml Galla+MIM 組 p-Akt、p-mTOR 蛋白相對表達量（分別為0.87±0.08、0.78±0.09）降低（P＜0.05，圖 7c，7d）。

與 MOCK 相 比，IN 組、0.5 mg/ml Galla+IN 組及1 mg/ml Galla+IN組PTEN蛋白相對表達量（分別為1.53±0.18、2.07±0.31、2.23±0.36）增加，尤以 1 mg/ml Galla+MIM組增加明顯（P＜0.05，圖7e）；而p-Akt蛋白相對表達量（分別為0.83±0.07、0.69±0.05、0.36±0.03）及p-mTOR蛋白相對表達量（分別為0.63±0.06、0.52±0.05、0.46±0.02）降低，尤以 1 mg/ml Galla+MIM組降低明顯（P＜0.05，圖7f，7g）。

3 討論

中醫(yī)學認為瘢痕疙瘩屬“肉龜瘡”、“肉蜈蚣”、“蟹足腫”等范疇，其基本病機為“濕毒搏結，氣血瘀滯”，即機體素有濕濁內蘊，復有金刀、火毒和蟲毒外襲，傷及肌膚，致營衛(wèi)不和，濕毒搏結，日久則經絡痹阻，氣血瘀滯而成[10]。五倍子瘢痕膏是已故中醫(yī)皮膚科大家歐陽恒教授在這一病機理論指導下，以化瘀軟堅解毒法為組方原則創(chuàng)制而成（具體方藥為黑醋、五倍子、蜈蚣、丹參、威靈仙、地骨皮、白礬）。本課題組前期臨床研究表明五倍子瘢痕膏治療瘢痕疙瘩療效確切[3]。此外，前期實驗研究顯示五倍子瘢痕膏能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖[4]及膠原合成[11]，但具體作用機制尚不清楚。

有研究表明，miRNAs在瘢痕疙瘩瘢痕形成過程中起著重要作用[12]，其在病理性瘢痕與正常皮膚組織中存在著差異性表達[5,6]，其中miR-21在增生性瘢痕組織中表達顯著高于正常皮膚組織[7]。這提示miR-21與瘢痕疙瘩的發(fā)生有密切的關系。有研究證實miR-21可靶向抑制PTEN表達促進肺癌細胞增殖侵襲[8],而PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因[13]，也是mTOR信號通路的一個重要負反饋調控因子。mTOR信號通路是調控蛋白質合成的主要信號通路，與細胞增殖、分化密切相關。mTOR信號通路包括PI3K、PTEN、Akt、mTOR等關鍵分子，其中PTEN是負反饋調節(jié)因子。研究證實，mTOR基因與細胞異常增殖及腫瘤的發(fā)生密切相關，在多種腫瘤組織中表達明顯增強[14,15]。瘢痕疙瘩屬于良性實體瘤，可向周圍正常組織呈侵襲性生長，其組織病理特點與腫瘤極為相似，具有類腫瘤特性。因此，筆者推測在瘢痕疙瘩形成過程中mTOR信號通路具有重要的作用，且miR-21對該信號通路存在調控作用，而五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖可能與其通過miR-21靶向調控mTOR通路有關。

為證實以上科研假設，本課題組應用雙螢光素酶報告基因驗證了miR-21可直接結合于 PTEN 3'-UTR而靶向調控 PTEN的表達。RT-PCR及Western Blot檢測結果顯示，瘢痕疙瘩組織中miR-21高表達而PTEN低表達。CCK8法、流式細胞儀、RT-PCR、Western Blot等檢測結果顯示，轉染 miR-21 mimic 后瘢痕疙瘩成纖維細胞miR-21表達增加、PTEN表達降低及p-Akt、p-mTOR表達增加，且能明顯促進瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并抑制其凋亡，而五倍子瘢痕膏提取液能減弱這一作用且呈濃度依賴性。轉染miR-21 inhibitor后瘢痕疙瘩成纖維細胞miR-21表達降低、PTEN表達增加及p-Akt、p-mTOR表達降低，且能明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并促進其凋亡，而五倍子瘢痕膏提取液能增強這一作用且呈濃度依賴性。

以上研究結果表明，miR-21 可通過靶基因PTEN調控瘢痕疙瘩成纖維細胞mTOR信號通路關鍵分子p-Akt、p-mTOR的表達。而五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的機制與其抑制miR-21表達進而上調mTOR信號通路中PTEN表達，從而抑制p-Akt、p-mTOR表達有關，這為五倍子瘢痕膏治療瘢痕疙瘩提供了理論依據。