歐陽芬，張喬軒，李妙言，柯培鋒，何 敏

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種臨床表現(xiàn)為免疫炎癥的彌漫性結(jié)締組織病，以血清中出現(xiàn)多種自身抗體和免疫復(fù)合物為特點(diǎn)?？闺p鏈DNA抗體(anti-dsDNA antibody，抗dsDNA抗體)是SLE的特異性抗體，對(duì)SLE的特異性可達(dá)85%以上，被納入美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)11項(xiàng)SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)?？筪sDNA抗體陽性不僅見于SLE病人(70%～95%)，也與很多其他自身免疫性疾病有關(guān)，如藥物誘導(dǎo)性紅斑狼瘡(60%)、混合性結(jié)締組織病(20%～50%)、多肌炎/皮肌炎、硬皮病等,極少情況下出現(xiàn)于健康人群[1]。

目前臨床實(shí)驗(yàn)室有多種方法可以檢測(cè)抗dsDNA抗體[2-5]，如放射免疫法(radioimmunoassay，RIA法)、間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)、免疫印跡法(immunoblotting，IBT)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等。

本實(shí)驗(yàn)所采用的尿素洗脫抗體親合力測(cè)定方法正是以ELISA方法為基礎(chǔ)，依據(jù)抗原抗體復(fù)合物在不同鹽離子濃度下解離程度不同，高親合力的抗體其空間構(gòu)象與抗原位點(diǎn)更吻合、結(jié)合更緊密，因而在相同鹽離子濃度下更難洗脫的原理，通過檢測(cè)洗脫完畢后抗原抗體復(fù)合物的A值來得到高親合力抗dsDNA抗體水平[6]。本研究旨在探討抗dsDNA抗體和高親合力抗dsDNA抗體在SLE病人中的分布情況以及與其他指標(biāo)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2017年8月至2018年4月廣東省中醫(yī)院就診的抗dsDNA抗體陽性的血清標(biāo)本共155例。SLE病人116例，其中男7例，女109例；男女比例為1∶16，平均36歲。所有病人均符合2017年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)與歐盟抗風(fēng)濕病聯(lián)盟年補(bǔ)充及修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。非SLE組39例，其中男8例，女31例；男女比例為1∶4，平均33歲。所有樣本取空腹靜脈分離血清，于-80 ℃保存。本研究經(jīng)廣東省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：ZE2019-206)。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.2.1 IIF法檢測(cè)總抗dsDNA抗體(dsDNA-IIF) 采用德國歐蒙公司的熒光試劑，以綠繩短膜蟲為包被抗原，以異硫氰酸熒光素( fluoresceinisothiocyanate,FITC)標(biāo)記的羊抗人IgG為熒光二抗，對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行IIF檢測(cè)，以抗dsDNA抗體IIF<1∶10判為陰性，IIF≥1∶10判為陽性。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)抗dsDNA抗體 ELISA法檢測(cè)總抗dsDNA抗體(dsDNA-ELISA)：采用德國Euroimmun公司生產(chǎn)的抗dsDNA ELISA試劑盒(Lot No.E170720AM)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，以抗dsDNA抗體 ELISA<100 IU/mL判為陰性；ELISA≥100 IU/mL判為陽性。

ELISA檢測(cè)高親合力抗dsDNA抗體：在ELISA檢測(cè)的基礎(chǔ)上，在二抗溫育步驟前增加6 mol/L尿素緩沖液溫育微孔板半個(gè)小時(shí)后洗板，其余步驟同ELISA檢測(cè)總抗dsDNA抗體檢測(cè)。測(cè)出高親合力抗dsDNA抗體水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、Kappa分析和Spearman相關(guān)性分析。檢測(cè)方法間的符合率計(jì)算根據(jù)CNAS-GL038《臨床免疫學(xué)定性檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》、方法間一致性評(píng)價(jià)用Kappa分析，Kappa>0.75表示好的一致性(Kappa最大為1),<0.4表示一致性差。

2 結(jié)果

2.1 樣本人群的基本特征及2種方法檢測(cè)結(jié)果的情況 SLE多發(fā)生于中年女性病人，SLE組女性比例高于非SLE組(P<0.05)，2組的年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SLE組的dsDNA-IIF陽性率和dsDNA-ELISA陽性率均高于非SLE組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表1)。

表1 樣本人群的基本特征及2種方法檢測(cè)結(jié)果的情況

2.2 dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA檢測(cè)結(jié)果的符合率與一致性 dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA檢測(cè)結(jié)果之間存在不一致。在SLE組中，dsDNA-IIF陽性78例、陰性38例，dsDNA-ELISA陽性99例、陰性17例，兩者結(jié)果不一致共49例，在不一致中，SLE組dsDNA-IIF陰性、dsDNA-ELISA陽性的例數(shù)為35例、dsDNA-IIF陽性、dsDNA-ELISA陰性的例數(shù)為14例。非SLE組中dsDNA-IIF 39例全部為陰性，dsDNA-ELISA陽性15例、陰性24例，說明dsDNA-ELISA檢測(cè)結(jié)果特異性不高。dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA的總體符合率為58.7%(91/155)，陽性符合率為56.1%(64/114)，陰性符合率為65.9%(27/41)。在不一致中，IIF法陰性、ELISA法陽性占32.3%(50/155)，IIF法陽性、ELISA法陰性占9.0%(14/155)。主要以弱陽性總抗dsDNA抗體ELISA 100～300 IU/mL或IIF1∶10為主，分別占47.3%(26/55)、34.1%(14/41)(見表2)。經(jīng)檢驗(yàn)Kappa=0.172 <0.4，說明2種方法的一致性較低(P<0.01)。

表2 dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA結(jié)果的分布情況

2.3 dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體的符合率與一致性 dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體結(jié)果之間存在不一致，在SLE組中，高親合力抗dsDNA抗體陽性81例、陰性35例，dsDNA-ELISA陽性99例、陰性17例；在非SLE組中，高親合力抗dsDNA抗體陽性8例、陰性31例，dsDNA-ELISA陽性15例、陰性24例，SLE組dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.34，P<0.01)。dsDNA-ELISA、高親合力抗dsDNA抗體的總體符合率為77.4%(120/155)，陽性符合率為73.7%(84/114)，陰性符合率為87.8%(36/41)。dsDNA-ELISA和高親合力抗dsDNA抗體均>100 IU/mL中SLE組占91.7%(77/84)。在不一致中，dsDNA-ELISA陰性、高親合力抗dsDNA抗體陽性占3.2%(5/155)，dsDNA-ELISA陽性、高親合力抗dsDNA抗體陰性占19.4%(30/155)(見表2)。經(jīng)檢驗(yàn)Kappa=0.514，0.4

表3 dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體結(jié)果的分布情況

2.4 dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體的符合率與一致性 在SLE組中，dsDNA-IIF陽性78例，陰性38例；在非SLE組中，dsDNA-IIF陽性0例，陰性39例。dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體的總體符合率為61.9%(96/155)，陽性符合率為61.3%(54/88)，陰性符合率為63.6%(42/66)。在不一致中，dsDNA-IIF陰性、高親合力抗dsDNA抗體陽性占22.6%(35/155)，IIF法陽性、高親合力抗dsDNA抗體陰性占15.5%(24/155)。主要以高親合力抗dsDNA抗體>300～600 IU/mL、IIF 1∶10為主，分別占42.9%(18/42)、28.6%(22/77)。經(jīng)檢驗(yàn)Kappa=0.247 <0.4，說明兩種方法的一致性較低(P<0.01)(見表4)。如果將dsDNA-IIF和高親合力抗dsDNA抗體聯(lián)合診斷，則診斷敏感率為90.5%(105/116)，特異性為100%(39/39)。

表4 dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體的符合率

2.5 高親合力抗dsDNA抗體水平與其他指標(biāo)之間的相關(guān)性 高親合力抗dsDNA抗體水平與dsDNA-IIF和dsDNA-ELISA水平呈正相關(guān)(P<0.01)，與性別、年齡、是否是狼瘡腎炎無相關(guān)性(P>0.05)(見表5)。

表5 高親合力抗dsDNA抗體水平與其他指標(biāo)之間的相關(guān)性

3 討論

SLE是一種常見的、累及全身的自身免疫性疾病，2017年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)與歐盟抗風(fēng)濕病聯(lián)盟年補(bǔ)充及修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，在病人病情發(fā)展的任何階段，只要11條診斷標(biāo)準(zhǔn)中出現(xiàn)4條即可診斷SLE，其中實(shí)驗(yàn)室檢查抗dsDNA抗體陽性獨(dú)立成為一條，這足以說明血清抗dsDNA抗體檢測(cè)對(duì)于SLE診斷的重要性。然而，標(biāo)準(zhǔn)中并未就抗體的檢測(cè)方法進(jìn)行限定，但正是不同的檢測(cè)方法和不同的試劑影響著特定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果解釋。

現(xiàn)在普遍建議聯(lián)合檢測(cè)抗雙鏈DNA抗體，以高通量、敏感性較高的ELISA作為抗dsDNA抗體的初篩實(shí)驗(yàn)，減少對(duì)穩(wěn)定期SLE的漏診率；用特異度較高的IIF復(fù)查，減少假陽性和假陰性的發(fā)生[8]。當(dāng)這兩種方法出現(xiàn)不一致的時(shí)候，就會(huì)產(chǎn)生疑惑。有研究數(shù)據(jù)顯示，不一致中以IIF陰性ELISA陽性居多。而這種不一致更多地指向抗體地親合力[9]?？贵w的親合力是表征特異性抗體性質(zhì)的重要指標(biāo)，反映抗原抗體結(jié)合的強(qiáng)度。目前根據(jù)被檢測(cè)抗體與抗原dsDNA的結(jié)合和解離的特性(Kon/Koff)來界定抗dsDNA抗體的親合力高低。具有高解離常數(shù)的抗dsDNA抗體為高親合力抗dsDNA抗體。

dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體，dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA兩組都存在檢測(cè)結(jié)果不一致的情況。在dsDNA-IIF、dsDNA-ELISA的非SLE組不一致中，只出現(xiàn)了dsDNA-IIF陰性、dsDNA-ELISA陽性的情況，表明dsDNA-ELISA對(duì)SLE的特異性不高。dsDNA-IIF陰性、dsDNA-ELISA陽性的原因可能在于 ELISA檢測(cè)方法的局限。ELISA檢測(cè)方法中DNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)位點(diǎn)人為暴露、變性解鏈成ssDNA，引起非特異性反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果假陽性較多。其次 ELISA的抗原需先通過多聚L賴氨酸或魚精蛋白等介質(zhì)包被在聚乙烯板上，往往會(huì)引起免疫復(fù)合物或非特異性免疫球蛋白等物質(zhì)交叉反應(yīng)出現(xiàn)假陽性。而對(duì)于dsDNA-IIF陽性dsDNA-ELISA陰性可能由于 ELISA法在抗原包被過程中抗原位點(diǎn)被遮蔽等導(dǎo)致 ELISA檢測(cè)為假陰性。

在dsDNA-IIF、高親合力抗dsDNA抗體檢測(cè)結(jié)果的不一致中，dsDNA-IIF陰性、高親合力抗dsDNA抗體陽性占22.6%(35/155)低于dsDNA-IIF陰性、dsDNA-ELISA陽性的32.3%(50/155)，表明dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體的聯(lián)合診斷有利于降低假陽性率。

dsDNA-ELISA和高親合力抗dsDNA抗體檢測(cè)結(jié)果>100 IU/mL中SLE組占91.7%(77/84)，dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體的聯(lián)合診斷有利于提高總抗dsDNA抗體的真陽性率。疾病對(duì)照組dsDNA-ELISA陽性、高親合力抗dsDNA抗體陰性占總例數(shù)的3.2%(5/155)。dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體的聯(lián)合診斷有利于降低總抗dsDNA抗體的假陽性率。dsDNA-IIF、高親合力抗dsDNA抗體的總體符合率為61.9%(96/155)高于dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA的總體符合率58.7%(91/155)。dsDNA-IIF、高親合力抗dsDNA抗體的Kappa值為0.247大于dsDNA-IIF、dsDNA-ELISA的0.172，二者的P值均<0.01。從數(shù)據(jù)分析可得，dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體的總體符合率和一致性都大于dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA。dsDNA-IIF聯(lián)合高親合力抗體水平診斷相對(duì)于dsDNA-IIF和dsDNA-ELISA聯(lián)合診斷更有助于對(duì)SLE的診斷。另外，研究發(fā)現(xiàn)SLE女性病人居多，查閱文獻(xiàn)分析可能的原因是由于女性的雌激素和泌乳素高而導(dǎo)致女性多發(fā)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示高親合力抗體與性別無相關(guān)性。SLE病人是否又是狼瘡腎炎病人與高親合力抗dsDNA抗體無關(guān)，有待進(jìn)一步研究。