李 磊，徐志鵬，夏 群，邱兆磊，程 峰，竇賀賀，姜 海，宋 琦，王振杰

腸道屏障是由腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs)之間的緊密連接組成的，是抵御有害物質由腸道入侵機體的關鍵[1]。在創(chuàng)傷失血性休克(traumatic hemorrhagic shock，THS)中，人體血量的再分配顯著減少腸黏膜的血流量，以優(yōu)化心臟和大腦等重要器官的血供。然而，缺血缺氧性損傷對IECs的另一個后果是ATP減少和緊密連接破裂，進一步導致腸道屏障功能障礙[2]。腸道含有的大量細菌和其他微生物分子從腸道移位到循環(huán)系統(tǒng)被認為是該系統(tǒng)介導全身炎癥反應發(fā)生的重要貢獻者[3]。人們逐漸認識到腸屏障功能的損害成為THS誘導多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的啟動和發(fā)展的關鍵因素[4]。因此，預防或改善腸屏障功能障礙將是預防THS相關MODS發(fā)生一個關鍵的治療策略。近年來發(fā)現(xiàn)，人類疾病與腸道益生菌越來越相關，而乳酸菌(LAB)作為最具有代表性的益生菌研究最為廣泛[5]。而目前對于THS在應用新型復蘇液醋酸鈉林格液復蘇基礎上應用乳酸菌探究對腸黏膜屏障的保護作用的研究較少。

既往研究[6-7]表明，TLR4-MAPK信號通路與急性腸道/肺損傷密切相關。因此針對TLR4-MAPK信號通路研究醋酸鈉林格液復蘇聯(lián)合乳酸菌對THS大鼠腸黏膜屏障的保護作用是可行的。本研究通過前期應用乳酸菌素片飼養(yǎng)SD大鼠，后期通過建立THS模型，探究醋酸鈉林格液復蘇基礎上應用乳酸菌對THS大鼠腸黏膜屏障作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 取健康SD大鼠30只，SPF級，雌雄不限，體質量(270±10)g(由上海杰思捷實驗動物有限公司提供)。于蚌埠醫(yī)學院動物實驗中心在室溫(22±1)℃、濕度40%～45%、以12 h光照/黑暗周期下飼養(yǎng)1周。乳酸菌素片購于江西江中藥業(yè)股份有限公司(每粒0.4 g，編號：A13202222273)，醋酸鈉林格液購于湖南康源制藥有限公司，一抗稀釋液(MDL MD412899)，二抗稀釋液(MDL MD51233)，中等蛋白分子量marker(DA2019)，ZO-1 antibody(MD1502)、Claudin-1antibody(MD2430)、TLR4 antibody(MD2233)、P-JNK antibody(MD3452)，P-P38 antibody(MD7543)均購于MDL公司。ELISA試劑盒購于上海代軒生物科技有限公司。

1.2 動物分組 取30只SD大鼠數(shù)字法隨機分為THS未復蘇組(THS組，n=10)，醋酸鈉林格液復蘇組(AR組，n=10)，醋酸鈉林格液聯(lián)合乳酸菌復蘇組(AL組，n=10)，其中AL組大鼠建立休克模型前在正常喂養(yǎng)的基礎上加服用乳酸菌素片1周(按照體積面積換算，大鼠每次服用劑量108 mg/kg，每天3次)。

1.3 THS模型的建立 將3組大鼠通過腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行麻醉后，將大鼠固定在恒溫手術臺，右側股骨通過重物墜落撞擊構建粉碎性骨折，右側股動脈置管快速放血，左側股動脈置管予以監(jiān)測平均動脈壓(MAP)(測壓管中預先應用2.5%的枸櫞酸鈉葡萄糖注射液預防血液凝固)，并于30 min內將MAP降至(35±5)mmHg，維持4 h；左側股靜脈置管后期予以休克復蘇補液。置管后，大鼠適應20 min。THS組、AR組及AL組制作休克模型：用1 mL含有提前填充枸櫞酸鈉溶液0.1 mL注射器從股動脈以2 mL/3min速度緩慢放血，直至MAP達(35±5)mmHg，大概需要20 min，后續(xù)通過緩慢回輸自體血或少量放血維持MAP在(35±5)mmHg區(qū)間波動1 h，THS組不予以液體復蘇，觀察4 h后取大鼠回腸組織。AR組與AL組在休克維持1 h后，利用醋酸鈉林格液于左側股靜脈通過微量泵進行限制性液體復蘇(通過限制輸入液體的量和靜脈泵入速度，30 min內控制65 mmHg≤MAP<70 mmHg，并維持30 min，后繼續(xù)將大鼠復蘇至正常血壓水平)，復蘇成功后觀察4 h后處死取大鼠回腸組織置于-80 ℃冰箱保存。本研究嚴格按照美國國立衛(wèi)生研究院《實驗動物的護理和使用指南》的建議進行，并得到了蚌埠醫(yī)學院實驗動物管理和倫理委員會批準進行。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 ELISA法檢測大鼠外周血TNF-α、IL-6、IL-4、及IL-10含量 按照ELISA試劑盒操作說明，檢測3組大鼠外周血中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL-6)、IL-4及IL-10含量。

1.4.2 Western blotting法檢測回腸組織ZO-1、Claudin-1、TLR4、p38磷酸化及JNK磷酸化蛋白相對表達水平 取超低溫冰箱中冷凍的回腸組織，加入裂解液離心30 min獲取上清液，于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。采用BCA試劑檢測上述蛋白濃度后，經SDS-PAGE分離后經過轉移電泳轉印至PVDF膜。分別加入相應一抗在4 ℃孵育過夜并經過TBST 洗膜3次，再加入堿性磷酸酶(AP)標記的二抗，室溫孵育1 h后利用TBST洗膜3次，ECL化學發(fā)光、顯影、定影、拍照，最后利用圖像分析軟件Scion Image 對蛋白帶進行吸光度分析。將目的蛋白與β-actin灰度值進行比值即為蛋白相對表達量。

1.4.3 回腸組織病理學檢查 回腸組織在經過10%甲醛溶液內固定、石蠟包埋且卡片、HE染色后在光鏡下進行小腸組織形態(tài)學觀察。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用單因素方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 3組大鼠體質量、基礎MAP比較 經單因素方差分析，3組大鼠體質量、基礎MAP差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 3組大鼠體質量和基礎平均動脈壓比較

2.2 3組大鼠外周血細胞因子含量比較 與THS組相比，AL組大鼠外周血TNF-α、IL-6含量降低，IL-4、IL-10含量升高，AR組TNF-α含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與AR組比較，AL組大鼠外周血TNF-α含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各細胞因子水平AR組和AL組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 3組大鼠外周血細胞因子含量比較

2.3 3組大鼠回腸組織ZO-1、Claudin-1、TLR4、p38磷酸化及JNK磷酸化蛋白相對表達水平比較 各組回腸組織，與THS組相比，AR組大鼠外周血TLR4、P-P38、P-JNK含量降低，AL組ZO-1、Claudin-1 含量升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與AR組相比，AL組ZO-1、Claudin-1 含量升高，TLR4、P-JNK含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1、表3)。

表3 3組大鼠回腸組織ZO-1、Claudin-1、TLR4、p38磷酸化及JNK磷酸化蛋白相對表達水平比較

2.4 回腸組織病理學改變 在光鏡下觀察：THS組回腸黏膜完整性破壞，黏膜層可見大量中性粒細胞浸潤，絨毛黏膜及黏膜下間質水腫明顯，間質層可見淤血；AR組較THS組回腸黏膜完整性破壞少，可見中性粒細胞浸潤，黏膜下間質水腫減輕；AL組回腸黏膜結構完整，較少中性粒細胞浸潤，無間質淤血表現(xiàn)，間質無明顯水腫(見圖2)。

3 討論

THS病人腸道血流減少導致的腸道菌群移位是介導全身炎癥反應的重要因素[8]。本研究的重點是前期應用乳酸菌飼養(yǎng)SD大鼠，通過建立THS模型，觀察利用醋酸鈉林格液限制性液體復蘇對大鼠腸黏膜屏障的影響。

THS激發(fā)全身炎癥反應包括激活先天免疫反應和瀑布樣促炎細胞因子的釋放,尤其是TLR4在宿主防御病原微生物入侵并識別與病原相關分子模式中扮演一個關鍵角色[9]。TLR4活化已被證實在許多細胞內信號轉導途徑，包括MAPK和NF-κB途徑(這些都是炎癥反應激活的關鍵調節(jié)劑)中發(fā)揮重要作用[9-10]。絲裂原激活蛋白激酶(MAPKs)是一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，特別是在介導炎癥介質和細胞因子釋放發(fā)揮重要作用。在哺乳動物中，MAPK家族的主要成員包括細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，其中JNK和p38 MAPK在應激反應過程中發(fā)揮重要作用[11]。BARRENSCHEE等[12]研究表明，TLR4激活p38 MAPK上調了炎癥相關基因的表達，并刺激了炎癥細胞因子的釋放。既往研究[13]表明，p38 MAPK的激活導致血紅素加氧酶-1(HO-1)在腸組織中產生，早期抑制p38 MAPK活化可能是預防出血性休克后腸組織損傷和多器官功能衰竭發(fā)展的有效手段，因此，TLR4-p38MAPK/JNK信號通路介導的THS腸損傷過程是可行的。

醋酸鈉林格液作為臨床常用的新一代平衡鹽溶液，前期本研究團隊發(fā)現(xiàn)[7，14-15]，醋酸鈉林格液不會引起乳酸蓄積及較少導致高血糖，而且在THS繼發(fā)重要臟器(心、肝、肺)損傷方面具有保護作用。然而在腸道損傷方面，目前國內外研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，應用醋酸鈉林格液限制性復蘇THS大鼠后，大鼠腸組織病理在光鏡下觀察其腸道的炎性水腫及炎細胞的浸潤較休克不復蘇組明顯好轉，說明醋酸鈉林格液對THS大鼠腸道具有保護作用。

腸道作為是THS后啟動MODS的“中心器官”，腸道損傷后最主要表現(xiàn)為腸黏膜屏障功能障礙，進而使腸腔內高濃度的細菌、毒素等通過受損腸道進入門靜脈匯入體循環(huán)導致全身炎癥反應的發(fā)生[16]。乳酸菌最常用的益生菌菌株與病原體競爭，通過其黏附于腸上皮來增強黏膜屏障完整性，同時通過識別TLR4影響腸道上皮細胞，這些相互作用可刺激保護性細胞因子的產生，例如IL-10，可以抑制上皮細胞凋亡并增強上皮細胞再生[17]。本研究在建立THS模型前期通過給大鼠服用乳酸菌素片來補充乳酸菌，發(fā)現(xiàn)在醋酸鈉林格液聯(lián)合乳酸菌組TLR4、P-P38、P-JNK、TNF-α、IL-6表達水平較單純應用醋酸鈉林格液復蘇組明顯降低，在常規(guī)液體復蘇基礎上應用乳酸菌可以抑制TLR4-p38MAPK/JNK炎性信號通路介導的腸損傷，同時發(fā)現(xiàn)抗炎因子IL-4及IL-10表達水平增加，也證實上述觀點。腸上皮細胞中ZO-1、Claudin-1蛋白相互作用形成緊密連接，保證其腸黏膜屏障的完整性具有重要作用。本研究通過利用Western blotting檢測ZO-1蛋白和Claudin-1蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)醋酸鈉聯(lián)合乳酸菌組較單純應用醋酸鈉組蛋白表達水平增加，也進一步證實了乳酸菌在保護腸黏膜屏障上具有重要作用。

綜上所述，我們推測在常規(guī)液體復蘇THS基礎上，應用乳酸菌可能進一步抑制TLR4-p38MAPK/JNK炎性信號通路的表達，進而抑制下游促炎因子TNF-α和IL-6的表達，同時增加抗炎因子IL-4和IL-10表達，進而逆轉了休克造成的促炎因子和抗炎因子的表達失衡，減輕了THS腸道損傷，為臨床控制休克病人腸道損傷提供理論基礎，但考慮到Toll樣受體家族龐大，信號通路復雜，本研究尚處于初步階段，還需進一步大樣本深入探究。