任 璐，燕玲娟，羅冠龍，桑 濤，劉麗麗

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西寶雞 721400）

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，廣泛污染農(nóng)作物、食品及飼料等植物源性產(chǎn)品[1]。可引起人類和動物急性或慢性中毒，部分已被證實具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的“三致”作用。赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OA 或OTA)是一種強(qiáng)力的肝臟毒素和腎臟毒素，并有導(dǎo)致畸形、突變和致癌作用，為此國際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC 將其定為ⅡB 類致癌物[2]。玉米赤霉烯酮（Zearalenone 或ZON）是一種特殊毒性的生物毒素，具有類雌激素樣作用，能引起動物流產(chǎn)、死胎、返情等生殖機(jī)能異常，還可以導(dǎo)致生長下降、免疫抑制、不育、畸形等[3]。為此，嚴(yán)格控制食物及制品中這兩種真菌毒素物質(zhì)的含量，對保障消費(fèi)者身心安全十分重要。

對于谷物及酒類中赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮的檢測方法多為采用免疫親和柱層析凈化手段，進(jìn)行熒光光度法和高效液相色譜法[4-5]、酶聯(lián)免疫吸附法[6]、液相色譜-質(zhì)譜法[7-8]。目前采用液相色譜-質(zhì)譜法已是檢測趨勢，因為該方法檢測限低、精密度高，本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，使得方法檢測限更低，更有利于釀酒原料及白酒品質(zhì)的把控，保障白酒安全。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

樣品：原料（高粱、大麥、小麥）、成品酒取自于陜西西鳳酒股份有限公司。

試劑：甲酸、乙腈、甲醇、乙酸銨（分析純）、超純水、氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、濃鹽酸、TritonX-100。

儀器設(shè)備：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（島津公司HPLC-20A 高效液相色譜儀串聯(lián)LCMS-8045 質(zhì)譜儀），萬分之一天平（梅特勒-托利多公司），氮吹儀（天津奧特賽恩斯），OTA 免疫親和柱和ZON 免疫親和柱（德國拜發(fā)），高速均質(zhì)器（德國IKA）。

標(biāo)準(zhǔn)品：赭曲霉毒素A（OTA 純度≥98%，Pribo公司），玉米赤霉烯酮（ZON 純度≥98 %，Pribo 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品提取

原糧：準(zhǔn)確稱取粉碎后的釀酒原糧5 g于50 mL離心管中，加入20 mL提取液a渦旋混勻，靜置30 min后高速均質(zhì)3 min，5000 r/min 條件下離心15 min。準(zhǔn)確移取上清液6 mL，加入稀釋溶液b X mL，混勻后過玻璃纖維濾紙。收集濾液c，待凈化。

白酒：準(zhǔn)確吸取6 mL 白酒試樣，加入稀釋溶液b X mL，混勻后過玻璃纖維濾紙，收集濾液c，待凈化。OTA和ZON提取區(qū)別見表1。

1.2.2 樣品凈化

原糧：待免疫親和柱保護(hù)液流凈后，取待凈化濾液c Y mL，以自然重力流速通過免疫親和柱，流完后加10 mL 淋洗液d 過疫親和柱，再用5 mL 超純水淋洗，自然重力流干后擠干小柱。準(zhǔn)確加入1.5 mL 純有機(jī)試劑e 洗脫，再加入1.5 mL 超純水洗脫，擠干小柱，收集兩次洗脫液于同一試管中，待上機(jī)。白酒凈化條件同原糧一樣，具體凈化參數(shù)見表1。

表1 OTA和ZON的提取、凈化參數(shù)

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和工作液

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取OTA 和ZON 各1.0 mg，OTA 用甲醇-乙腈（1+1）溶解并定容至10 mL，ZON用乙腈定容至10 mL，分別得到0.1 mg/mL 的OTA和ZON標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃下避光保存。

OTA系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL 至100 mL 容量瓶中，用甲醇-乙腈（1+1）定容，配成100 ng/mL 的OTA 中間標(biāo)準(zhǔn)液。再分別移取OTA 中間標(biāo)準(zhǔn)液5 mL、2 mL、1 mL、0.5 mL、0.1 mL、0.05 mL 至10 mL 容量瓶中，用提取液定容，分別配成濃度為50 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5.0 ng/mL、1.0 ng/mL、0.5 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃下避光保存。

ZON 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL 至100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配成1 μg/mL 的玉米赤霉烯酮中間標(biāo)準(zhǔn)液。再分別移取中間標(biāo)準(zhǔn)液2 mL、1 mL、0.5 mL、0.1 mL、0.05 mL、0.01 mL、0.005 mL至10 mL容量瓶中，用提取液定容，分別配成濃度為200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0.5 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃下避光保存。

1.2.4 儀器參數(shù)條件

液相條件：色譜柱為Shin-pack XR-ODSIII C18(2.0 mm I.D *150 mm L.,3.0 μm)；OTA 的流動相A為0.1 %甲酸-5 mmol/L 乙酸銨，B 為乙腈；ZON 的流動相A 為超純水，B 為乙腈；進(jìn)樣量都為10 μL；柱溫OTA 和ZON 分別為30 ℃、40 ℃；流速分別為0.2 mL/min、0.3 mL/min，洗脫方式：梯度洗脫，分別見表2、表3。

表2 OTA洗脫梯度

表3 ZON洗脫梯度

質(zhì)譜條件：兩種物質(zhì)質(zhì)譜檢測條件基本一致，檢測方式都為多級反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描；離子源：ESI，負(fù)離子掃描模式；OTA 和ZON 檢測加熱塊溫度分別為：400 ℃、350 ℃；DL 溫度：250 ℃；霧化氣流速：3.0 L/min；干燥氣流速：10 L/min；駐留時間：100 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相、質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化

流動相不僅運(yùn)載樣品，而且對于物質(zhì)的分離、響應(yīng)至關(guān)重要。經(jīng)過試驗最終選擇ZON 流動相為乙腈和超純水，OTA 流動相為乙腈、0.1 %甲酸-5 mmol/L 乙酸銨。這兩種物質(zhì)都采用ESI 負(fù)離子的多級檢測模式，OTA 和ZON 的定量離子對分別為：402.10＞358.10、317.20＞175.05，其所得的MRM 色譜圖和相對應(yīng)的質(zhì)譜圖分別如圖1、圖2所示。

圖1 OTA的MRM色譜圖和相對應(yīng)的質(zhì)譜圖

圖2 ZON的MRM色譜圖和相對應(yīng)的質(zhì)譜圖

2.2 線性范圍

將OTA 和ZON 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按照1.3 分析條件進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線，如圖3、圖4 所示。OTA 曲線方程為Y=28038.5X+178.601，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，線性關(guān)系良好，方法檢出限＜0.1 ng/mL。ZON曲線方程為Y=55726.9X+1919.47，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，線性關(guān)系良好；方法定量限為0.05 ng/mL，檢出限＜0.01 ng/mL，低于國標(biāo)檢測方法。

圖3 OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 ZON標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度試驗

對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別連續(xù)測定6次，考察儀器的精密度，檢測濃度重復(fù)性結(jié)果如表4。結(jié)果顯示，不同濃度的OTA 和ZON 標(biāo)準(zhǔn)品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）在0.67 %～1.68 %之間，儀器精密度良好。

表4 濃度重復(fù)性結(jié)果(n=6)

2.4 回收率試驗

在釀酒原糧及白酒中分別加入一定量的OTA和ZON 中間標(biāo)準(zhǔn)液，得到不同濃度的樣品，再根據(jù)1.4 的方法進(jìn)行樣品處理，測定其回收率，樣品回收率的計算為：(3×檢測值-本底值)/加標(biāo)值，檢測結(jié)果如表5。在釀酒原糧（高粱、大麥、小麥）及白酒中，OTA 的回收率都在83.76 %～110.04 %之間，完全符合檢測要求；在高粱中ZON 的回收率稍大于120%，這與高粱自身的基質(zhì)有關(guān)系，采用質(zhì)譜檢測器，存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；在小麥、大麥、白酒中，ZON的回收率均≤110.04%，符合檢測要求。

表5 回收率試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀建立了釀酒原料及白酒中赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮的檢測方法。樣品經(jīng)提取液提取后過免疫親和柱凈化，收集凈化液上機(jī)檢測。結(jié)果表明，OTA 和ZON在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，r＞0.9999，方法檢出限均較低（＜0.1 ng/mL），在原糧與白酒中回收率主要集中在83.76 %～110.04 %之間，ZON 在高粱中的回收率為122%左右，這主要是高粱基質(zhì)對MS 檢測器的增強(qiáng)效應(yīng)所致。此方法操作相對簡便、快捷，完全符合企業(yè)準(zhǔn)確檢測的需要。