周成龍，劉 念，倪海斌，潘建軍，趙晨捷

（1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，四川成都 611130）

在濃香型白酒的品評標(biāo)準(zhǔn)中，酯類物質(zhì)含量一直是判斷濃香型白酒酒質(zhì)的重要依據(jù)之一。酯類物質(zhì)生成方式主要有兩個途徑，其一：醇和酸在釀酒過程中產(chǎn)生酯化作用生成酯類物質(zhì)，其二：某些產(chǎn)酯酵母在代謝活動中的產(chǎn)物為酯類物質(zhì)。酯類物質(zhì)作為濃香大曲酒的呈香呈味主要風(fēng)味成分，其含量對產(chǎn)品質(zhì)量影響極大[1]。在發(fā)酵過程中，醇和酸作為酯化反應(yīng)的底物會在產(chǎn)酯期間被大量的消耗，然而窖內(nèi)醇或酸生成的含量并不穩(wěn)定，可能會導(dǎo)致產(chǎn)酯期生成酯類物質(zhì)含量偏少，又可能會導(dǎo)致酯化反應(yīng)底物的醇類或酸類物質(zhì)的大量余留，使得產(chǎn)品品質(zhì)無法達(dá)到要求。

目前有多篇文獻(xiàn)對如何提高濃香白酒優(yōu)質(zhì)品率相關(guān)課題進(jìn)行了闡述[2-8]。酯化反應(yīng)是一類有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，是醇與羧酸或含氧無機(jī)酸在一定溫度和催化劑條件下生成酯和水的可逆反應(yīng)。白酒釀造中屬于醇和羧酸的酯化反應(yīng)，在釀造過程允許的溫度范圍內(nèi)，溫度越高，推測酯化反應(yīng)可能越強(qiáng)烈，同時反應(yīng)底物的醇類和酸類物質(zhì)濃度越高，酯化效果可能越好。由于黃水里和酒尾中含有大量的酸類物質(zhì)，本試驗設(shè)計酸的濃度和溫度梯度不僅為了探究酯化的最佳反應(yīng)條件，還可探究在不同反應(yīng)條件下酯化后糟醅的物理性狀和酸度是否滿足糟醅下次的入窖要求，當(dāng)糟醅酸度不夠時，所產(chǎn)白酒不夠香，味道單調(diào)；而糟醅酸度過高時會抑制有益微生物（主要為酵母菌）的生長繁殖，而導(dǎo)致出酒率低且酒味欠協(xié)調(diào)[9]。

本研究將黃水與酒尾按一定比例的混合液加入糟醅中進(jìn)行模擬試驗，通過調(diào)整糟醅的酒精含量、酸度、混合液的初始溫度來探索不同條件下的酯化效果?？赏ㄟ^添加食用酒精與高酸糟醅發(fā)生酯化反應(yīng)，解決糟醅酸度過高導(dǎo)致酒質(zhì)下降、出酒率低和影響下一輪發(fā)酵的問題。本研究使用酸度高于黃水與酒尾的高酸糟醅，將黃水和酒尾混合液按比例添加到糟醅中，在一定程度上既可以起到降低酸度的作用，也可以通過醇酸酯化反應(yīng)生成更多的酯類物質(zhì)，以期為濃香型白酒生產(chǎn)的提質(zhì)降耗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

材料：出窖高酸度糟醅、優(yōu)質(zhì)窖泥、窖皮泥、發(fā)酵容器、優(yōu)質(zhì)黃水、優(yōu)質(zhì)酒尾12%vol、谷殼、粉碎后釀酒高粱、優(yōu)質(zhì)液態(tài)法高度白酒。

儀器設(shè)備：DNP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9071A 型電熱恒溫干燥箱、LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌器、安捷倫7890A-5975B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、H1300A型固相微萃取。

1.2 試驗方法

將優(yōu)質(zhì)老窖泥分別均勻地涂抹在8 個發(fā)酵容器的底面，每一個發(fā)酵容器內(nèi)放入2.5 kg 的出窖高酸度糟醅，通過理化分析可得黃水、酒尾和出窖高酸度糟醅的酒精度和酸度，再通過計算混合反應(yīng)體系中總酸含量與體積，推算出加入固定體積的黃水與酒尾混合液所能降低到最低的酸度為4.7 mmol/10 g，根據(jù)添加混合液比例差異顯著的原則設(shè)計5.2 mmol/10 g 的酸度與之對比。兩種比例的混合液又以25 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃共4 個溫度梯度分別加入到發(fā)酵容器中，加入食用酒精提升酒精度，最后涂抹窖皮泥進(jìn)行封窖處理，使整個反應(yīng)體系處于密閉的空間進(jìn)行試驗，經(jīng)歷20 d 左右的酯化期，在酯化期間每3 d對發(fā)酵容器進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，使整個容器內(nèi)的糟醅與混合液能夠均勻混合。酯化結(jié)束后對糟醅進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)的檢測分析。試驗以無混合液為空白對照組，以有混合液為試驗組；以兩組平行進(jìn)行重復(fù)性試驗驗證結(jié)論可行性。

1.3 檢測方法

糟醅指標(biāo)參照現(xiàn)行DB34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》[9]進(jìn)行分析（糟醅酸度：酸堿滴定法，糟醅水分含量：恒溫干燥法，糟醅酒精度：蒸餾法與相對密度法，糟醅還原糖測定：斐林試劑法）；風(fēng)味物質(zhì)采用半定量方法測定[10]。

固相微萃?。悍Q取5 g 糟醅置于樣品瓶，加入內(nèi)標(biāo)20 μL（12 mL/100 mL 乙酸戊酯）將萃取纖維頭插入頂空部分，在50 ℃下預(yù)熱10 min，再萃取30 min，隨后迅速插入進(jìn)樣孔在230 ℃下熱解析3 min，隨后將萃取頭取出。相同條件下進(jìn)行3次平行，數(shù)據(jù)取平均值。

色譜條件：J&W122-7062毛細(xì)管色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；不分流模式；進(jìn)樣口溫度230 ℃；壓力16.909 psi；載氣為99.999%氦氣；流速為1 mL/min。進(jìn)樣口溫度230 ℃，采用程序升溫：初始溫度50 ℃保持2 min，以4 ℃/min 升至70 ℃保持1 min，以8 ℃/min 升至200 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至230 ℃保持2 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃水、酒尾和糟醅的理化分析結(jié)果

在試驗開始前，對所需的樣品進(jìn)行基本理化檢測，為了計算在混合后反應(yīng)體系的理化數(shù)據(jù)，通過計算得出最低酸度不低于4.7，再通過計算設(shè)置5.2酸度試驗組與之進(jìn)行試驗對比。酒精度測定是為了計算混合后的乙醇含量，從而得出需要添加多少優(yōu)級液態(tài)法高度白酒才能達(dá)到所需酒精度?？偹峥傰y定是為了探究混合體系中本身帶有的酸和酯含量為多少，從而證明酯的生成不單是黃水和酒尾帶入的，而是通過酯化反應(yīng)所生成的產(chǎn)物。還原糖測定為了說明生物代謝活動強(qiáng)弱程度以及判斷微生物對整個反應(yīng)體系影響的大小。黃水、酒尾和糟醅樣品的理化指標(biāo)檢測結(jié)果如表1。

表1 黃水、酒尾和糟醅樣品理化分析

通過驗證試驗與計算，在2.5 kg糟醅中加入黃水與酒尾混合液500 mL（混合液體積到達(dá)容器中部位置，根據(jù)發(fā)酵容器大小進(jìn)行調(diào)整）的條件下，調(diào)整混合后的酸度達(dá)到4.7 mmol/10 g（A組）和5.2 mmol/10 g（B 組）所需黃水與酒尾的含量如下，無混合液試驗組僅添加食用酒精而不添加混合液。

通過計算調(diào)整混合反應(yīng)體系的酸度A組所需黃水與酒尾的比例為13∶487，而混合反應(yīng)體系的酸度B組所需黃水與酒尾的比例為304∶196。糟醅酸度調(diào)整后，對糟醅酒精度進(jìn)行調(diào)整，通過計算并使用食用酒精將所有試驗組的酒精度都調(diào)整到10 mL/100 g，則A 組所需食用酒精171 mL，B 組所需食用酒精191 mL。

2.2 混合反應(yīng)體系理化指標(biāo)分析

本試驗對調(diào)整好酸度和酒精度的糟醅進(jìn)行酯化試驗，通過混合反應(yīng)后糟醅的理化指標(biāo)檢測結(jié)果如表2 所示；不同溫度下反應(yīng)后的糟醅酸度變化如圖1 所示；不同溫度下反應(yīng)后的糟醅酸度降低情況如表3 所示；不同溫度下反應(yīng)后的糟醅酒精度變化如圖2 所示；不同溫度下反應(yīng)后糟醅的還原糖含量變化如圖3所示。

圖2 不同溫度下反應(yīng)后糟醅的酒精度變化

圖3 不同溫度下反應(yīng)后糟醅的還原糖含量變化

表2 反應(yīng)后糟醅理化檢測結(jié)果

圖1 不同溫度下反應(yīng)后的糟醅酸度變化

表3 不同溫度下反應(yīng)后糟醅的降酸率

由表2可得出，由于添加混合液體積一致，故A組與B 組水分含量差距不大且無明顯規(guī)律性，對照組由于不添加混合液則水分含量最小。

由圖1 和表3 可得，由于對照組沒有添加混合液，酯化不強(qiáng)烈，故酸度最高。圖1 中A 組整體酸度比B 組高，說明B 組酯化反應(yīng)更劇烈，消耗的總酸物質(zhì)更多，從而使反應(yīng)后糟醅酸度更低。A 組和B 組在不同溫度下反應(yīng)程度不同，在60 ℃時反應(yīng)后的酸度降低最明顯，A組降幅達(dá)45.7%，B組降幅達(dá)52.1 %。主發(fā)酵結(jié)束后，乙醇的生成基本停止。窖池進(jìn)入產(chǎn)酸期，從這一時間開始窖池也同時進(jìn)入了產(chǎn)酯期。酯類物質(zhì)的生成主要是生化反應(yīng)，窖池中的酸和醇在某些微生物所分泌的酯化酶作用下反應(yīng)生成酯[11]。

由圖2 可得，糟醅中乙醇是作為酯化反應(yīng)的底物，酯化越強(qiáng)烈，則乙醇消耗量越大，可以看出，B組測得的酒精度均比A 組低，無混合液對照組酒精度最高。試驗組內(nèi)對比發(fā)現(xiàn)，酒精度隨著混合液溫度升高整體呈現(xiàn)下降趨勢，A 組酒精度變化較小，而B 組酒精度下降幅度較大且在60 ℃時含量最低為4.51%vol，A 組和B 組所有試驗組酒精度降幅接近50%，無混合液對照組降幅達(dá)25%。

由圖3 可得，對兩個試驗組組內(nèi)進(jìn)行對比，在溫度梯度下反應(yīng)后的還原糖無明顯規(guī)律性。由于B 組所用黃水比A 組多，而黃水中還原糖和淀粉含量豐富，淀粉在酶的作用下分解為葡萄糖，在酯化反應(yīng)過程中附著在糟醅上，故B 組的還原糖含量普遍比A組高，而無混合液對照組還原糖含量最低。

2.3 酯化反應(yīng)前后糟醅風(fēng)味成分對比分析

2.3.1 酯化反應(yīng)前后糟醅的酯類物質(zhì)含量分析

本試驗對混合反應(yīng)前后的糟醅的酯類物質(zhì)進(jìn)行了GC-MS分析，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，B組酯類物質(zhì)總含量均比A 組多，而其中處理前總酯含量遠(yuǎn)少于加混合液后的試驗組，無混合液對照組由于添加了乙醇作為反應(yīng)底物并且在發(fā)酵容器內(nèi)同樣進(jìn)行了酯化反應(yīng)，酯含量依然有所增加但增幅最小。其中A 組的乙酸乙酯含量普遍比B 組高。而乙酸己酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、己酸丁酯、辛酸乙酯、己酸異戊酯等酯類物質(zhì)含量又普遍低于B 組，可以看出在以己酸為酯化反應(yīng)前驅(qū)物質(zhì)的酯類成分中，B 組中的含量均比A 組高，其中體現(xiàn)濃香型白酒主體香氣成分的己酸乙酯含量差異尤為突出。

表4 糟醅風(fēng)味物質(zhì)中酯類物質(zhì)含量 (mg/kg)

2.3.2 酯化反應(yīng)前后糟醅的酸類物質(zhì)含量分析

本試驗對混合反應(yīng)前后的糟醅的酸類物質(zhì)進(jìn)行了GC-MS分析，結(jié)果如表5所示。

表5 糟醅風(fēng)味物質(zhì)中酸類物質(zhì)含量 (mg/kg)

由表5 可知，B 組反應(yīng)后混合體系的總酸含量明顯高于A 組，其中異丁酸、正戊酸、庚酸、辛酸和己酸含量在B 組中均比A 組和對照組高，尤其是己酸含量明顯，由于B 組添加黃水含量遠(yuǎn)高于A 組，而黃水中酸類物質(zhì)種類豐富，故在添加的同時也提供了大量的酸類物質(zhì)作為反應(yīng)底物。綜合表4 可得出，B 組酯化后所得總酯含量大于A 組，但酸度過高會影響下次發(fā)酵和出酒質(zhì)量，因此后期需進(jìn)一步研究探討合適的配比方案，可檢測入池糟醅各項理化是否符合入池要求，也可輔以用物性儀對糟醅的感官質(zhì)量進(jìn)行探索[12-13]。

3 結(jié)論

本研究通過對出窖糟醅添加黃水和酒尾后進(jìn)行強(qiáng)化酯化的試驗，探究了反應(yīng)前后糟醅的理化指標(biāo)和風(fēng)味成分變化情況，結(jié)果表明混合液的不同溫度對促進(jìn)酯化反應(yīng)效果不明顯，通過測定處理后糟醅的酸度和酒精度變化，發(fā)現(xiàn)A 組酒精度和酸度略高于B 組，由于酯化反應(yīng)的進(jìn)行，醇類物質(zhì)和酸類物質(zhì)作為反應(yīng)底物其含量便會相對減少，可證明B組酯化反應(yīng)較A 組更劇烈。研究發(fā)現(xiàn)加入黃水與酒尾混合液后進(jìn)行酯化反應(yīng)的效果顯著，添加混合液前后的酯類物質(zhì)總含量相差3 倍以上。即使不進(jìn)行黃水與酒尾的添加，僅添加食用酒精也能因提高了乙醇含量而促使酯化反應(yīng)的正常進(jìn)行，其酯類物質(zhì)含量也超過了處理前糟醅的2 倍，而總酸含量在試驗前糟醅中最少，無混合液的總酸含量較高，可能由于好氧微生物的代謝作用在酯化期間產(chǎn)酸速度快于酯化速度。而B 組酸類物質(zhì)含量高于A組，其中己酸的含量最明顯。

本研究將黃水與酒尾和糟醅結(jié)合探索對糟醅進(jìn)行強(qiáng)化酯化的方法，后續(xù)可以通過物性分析、理化分析和感官分析，進(jìn)一步考察更多的影響因素來達(dá)到更好的酯化和釀酒效果，從而提升酒質(zhì)，實現(xiàn)黃水、酒尾、糟醅的資源化利用。