亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        五株酵母菌的分離鑒定及產(chǎn)丁二酸能力分析

        2021-07-28 14:45:52雷學(xué)俊楊康卓羅青春廖勤儉劉多濤喬宗偉
        釀酒科技 2021年6期
        關(guān)鍵詞:株菌丁二酸麥芽

        張 霞,雷學(xué)俊,楊康卓,羅青春,廖勤儉,劉多濤,喬宗偉,2,鄭 佳,2

        (1.宜賓五糧液股份有限公司,四川宜賓 644007;2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室,四川宜賓 644007)

        酵母菌是白酒釀造微生物區(qū)系中非常重要的組成部分,它可以分解釀造原料產(chǎn)生酯類、醇類、酮類、酸類、酚類、烯類、吡嗪類等風味物質(zhì)[1],對產(chǎn)酒率和酒質(zhì)至關(guān)重要。

        酵母菌發(fā)酵代謝可產(chǎn)生一種叫丁二酸的物質(zhì),又叫琥珀酸,是一種二元羧酸,能發(fā)生二元酸的大多數(shù)典型反應(yīng),如鹵化、酯化、碘化等,也是合成各種復(fù)雜有機物的中間體。丁二酸作為三羧酸循環(huán)過程中的一種四碳化合物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)等行業(yè)[2-3],可用于合成氨基酸、鎮(zhèn)靜劑、維生素、1,4-丁二醇、N-甲基吡咯烷酮以及酸化劑、風味調(diào)節(jié)劑等[4-6],琥珀酸(包括鹽類)可產(chǎn)生酸味和呈味物質(zhì),可用于豆醬、醬油、日本酒、調(diào)味料[6]等。丁二酸進行酯化形成的丁二酸酯類是一種生物活性成分,可以提高白酒的健康價值,而且丁二酸酯類具有愉快的氣味,對酒類的香味呈現(xiàn)有著一定的貢獻[7-10]。丁二酸還可以作為中間體合成γ-丁內(nèi)酯、1,4-丁二胺、四氫呋喃等化合物[11],這些化合物對白酒的風味形成有重要作用。

        盧春芳等[12]在6株酵母菌中篩選出高活性酵母菌,其中熱帶假絲酵母產(chǎn)丁二酸的能力最強,培養(yǎng)液中丁二酸含量為119.70 μg/mL;高翠娟等[13]通過基因敲除的方法獲得可積累琥珀酸的解脂酵母重組菌,以提高琥珀酸的產(chǎn)量;申乃坤等[14]以牛胃內(nèi)容物為菌源,利用富馬酸鈉為唯一碳源并加入高濃度丁二酸鈉的選擇培養(yǎng)基篩選到1 株丁二酸產(chǎn)量較高,副產(chǎn)物較少的菌株,經(jīng)鑒定為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌。

        本研究從不同培養(yǎng)基之間產(chǎn)丁二酸能力高低出發(fā),通過5 株不同屬的酵母菌在不同培養(yǎng)基之間發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的對比,發(fā)現(xiàn)這5 株不同屬的酵母菌在五糧粉液中產(chǎn)丁二酸能力最強,而五糧粉則是五糧液釀造的糧食原材料,這對研究五糧液白酒風味多樣性的形成有一定的幫助。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌株

        所有酵母菌株均由本實驗室保藏,分離自五糧液釀造環(huán)境中。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        分離篩選培養(yǎng)基:麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、YEPD瓊脂培養(yǎng)基均為商業(yè)用合成培養(yǎng)基。

        發(fā)酵培養(yǎng)基:麥芽汁培養(yǎng)基、YPD 液體培養(yǎng)基均為商業(yè)用合成培養(yǎng)基。

        五糧粉[15]糖化液:五糧粉糖化液由高粱、小麥、大米、糯米和玉米5 種糧食按一定比例打碎混合組成,五糧粉∶水以1∶10 比例煮沸糊化,冷卻后加入糖化酶、液化酶,最后過濾調(diào)糖度終濃度至12~13°Bx。

        以上培養(yǎng)基均121 ℃下0.1 MPa滅菌20 min。

        1.2 主要試劑和儀器

        麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、YEPD 瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、YPD 液體培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司;葡萄糖(分析純),國藥集團化學(xué)試劑有限公司;Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;API20ACUX 鑒定試劑盒,生物梅里埃公司;FKC-1型浮游菌采樣器,浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司;離心機,Eppendorf 公司;顯微鏡,Olympus 公司;生化培養(yǎng)箱,上海一恒科技儀器有限公司;美國Agilent 公司1290 系列高效液相色譜儀(HPLC)-6520B 系列質(zhì)譜檢測器(QTOF),Agilent MassHunter 數(shù)據(jù)采集工作軟件、定性定量分析軟件,Milli-Q 超純水機(美國Millipore公司)。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 菌株的分離

        在五糧液釀酒車間和制曲車間外圍環(huán)境采集樣品,采用FKC-1 型浮游菌采樣器,距離地面80 cm,將直徑為9 cm 的麥芽汁瓊脂平板置于采樣器內(nèi),每次采樣設(shè)置3 個平行,空氣流量為100 L/min,采樣時間為1 min。然后將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3 d,待菌落長出后,挑選菌落形態(tài)不同的疑似酵母單菌落于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中,編號并劃線純化,重復(fù)純化2~3 次,直至平板上的菌落都為同一形態(tài),利用傳代培養(yǎng)法,在4 ℃下進行斜面保存并編號。

        1.3.2 菌株的鑒定

        1.3.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

        參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》進行[16]。

        菌落形態(tài)觀察:將純化后的菌株接種于YEPD平板,置28 ℃下培養(yǎng)2~3 d,單菌落觀察,并記錄菌落的大小、顏色、形狀、質(zhì)地、透明度、邊緣、濕潤程度等菌落特征。

        顯微鏡觀察細胞形態(tài):挑取單菌落于5 mL YPD 液體培養(yǎng)基中28 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h,顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)特征。

        1.3.2.2 菌株生理生化鑒定

        按照API 20A CUX 鑒定試劑盒所述方法測定菌株的生理生化特征。假菌絲觀察:將酵母接種于玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)3 d,觀察酵母是否含有假菌絲。

        1.3.2.3 菌株分子鑒定

        基因組DNA的提?。簩⒒罨木杲尤?0 mL麥芽汁培養(yǎng)基中,160 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h 后,室溫、12000 r/min 離心5 min 獲得菌體,用Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取菌株的基因組DNA,置于-20 ℃下備用。

        PCR 擴增:采用酵母菌通用引物為NL1(5-GCATATCAA TAAGCGGAGGAAAAG-3')和NL4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'),PCR 反 應(yīng)體系包括0.5 μL 的基因組DNA、2.5 μL 的10×Buffer(含Mg2+)、1 μL的dNTP、0.2 μL的聚合酶、0.5 μL的引物、0.5 μL 模板,加雙蒸水至25 mL;PCR 循環(huán)條件為94 ℃4 min 預(yù)變性、94 ℃45 s 變性、55 ℃45 s退火、72 ℃1 min延伸、循環(huán)30次,72 ℃10 min修復(fù)延伸,4 ℃終止反應(yīng)。經(jīng)PCR 反應(yīng)擴增出26S rDNA 產(chǎn)物,用PCR 及酶反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒將PCR 產(chǎn)物進行純化,將純化產(chǎn)物交由上海生工生物工程股份有限公司完成測序工作。

        1.3.3 酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

        參考文獻[17],將測得的26S rDNA D1/D2 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對,選取相似度較高的模式菌株的26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列作為參比對象;利用MEGA5.0 軟件進行多序列比對、Kimura-2 模型計算進化距離、最后采用鄰位相連(Neighbor-Joining)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹,其中進化樹拓撲分析為1000次重復(fù)取樣的結(jié)果。

        1.3.4 丁二酸的測定

        取終濃度酵母菌活菌數(shù)105~106個/mL菌液接種于3 種發(fā)酵培養(yǎng)基中,以未接菌的培養(yǎng)基作為對照。28 ℃靜置培養(yǎng)48 h 后,將發(fā)酵液12000 r/min離心5 min,取上清液0.22 μm 濾膜過濾,用HPLC法測定發(fā)酵液中丁二酸的含量。色譜條件:色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(2.1*100 mm 1.8-micron);柱溫:30 ℃;流速:0.2 mL/min;進樣量:2 μL;流動相為甲醇B(液質(zhì)級)和超純水A(含0.05 g/L甲酸);梯度洗脫條件:0~8 min:2 %~98 %B,8.1~12 min:98 %B,12.1~14 min:2 %B,15 min:stop。質(zhì)譜條件:采用電噴霧電離源(DESI);負離子模式掃描;離子源溫度為325 ℃;干燥氣流量為10 L/min;霧化器壓力為40 psig;碰撞電壓為90 V。標曲:Y=202.7x+10770。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌株的鑒定

        2.1.1 形態(tài)特征

        5株不同屬酵母菌菌落和顯微鏡形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖1,具體形態(tài)結(jié)構(gòu)描述見表1。

        表1 酵母菌的菌落和微觀形態(tài)描述

        圖1 酵母菌的菌落和微觀結(jié)構(gòu)

        2.1.2 生理生化特征

        生理生化特征鑒定結(jié)果如表2 所示,此5 株菌均能發(fā)酵利用葡萄糖作為碳源,均不能發(fā)酵利用2-酮基-葡萄糖酸鹽、L-阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、木糖醇和N-乙酰氨基葡萄糖。Y3可利用D-木糖,其他4 株菌則不可以;Y1、Y2、Y3、Y5 可發(fā)酵利用的碳源種類較多,而Y4 僅可利用D-半乳糖和纖維二糖兩種碳源。形態(tài)學(xué)試驗結(jié)果顯示,除了Y5 有假菌絲外,其他4株菌均沒有假菌絲出現(xiàn)。

        表2 酵母菌生理生化檢測結(jié)果

        2.1.3 菌株的分子鑒定結(jié)果

        從表3 可以看出,Y1 與Kazachstania bulderi的相似度為100 %、Y2 與Saccharomyces cerevisiae的相似度為100 %、Y3 與Zygosaccharomyces bailii的相似度為100 %、Y4 與Naumovozyma castellii的相似度為99.52 %、Y5 與Saccharomycopsis fibuligera的相似度為100%,說明菌株Y1、Y2、Y3、Y4 和Y5都已經(jīng)在NCBI中找到相似度非常高的菌株。

        表3 酵母菌26S rDNA的同源性分析結(jié)果

        2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

        此5 株不同屬的酵母菌株的26S rDNA D1/D2序列和用BLAST 檢索到的與之有高度同源性菌株的26S rDNA D1/D2 序列通過MEGA5.0 軟件進行比對和構(gòu)建N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖2。可通過系統(tǒng)發(fā)育樹的建立對此5 株不同屬的酵母菌種間親緣關(guān)系進行直觀界定。

        由圖2 可以直觀地看出,Y1 和Kazachstania bulderi聚為一支、Y2 和Saccharomyces cerevisiae聚為一支、Y3 和Zygosaccharomyces bailii聚為一支、Y4 和Naumovozyma castellii聚為一支、Y5 和Saccharomycopsis fibuligera聚為一支。結(jié)合相似度(表3)和系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),該5 株酵母菌可以清晰地鑒定到種。

        圖2 基于26S rDNA D1/D2區(qū)域序列和neighbor-joining分析法繪制菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

        2.3 不同培養(yǎng)基條件下丁二酸產(chǎn)量的測定

        用HPLC 法測定發(fā)酵液中丁二酸的含量,結(jié)果如圖3 所示。同一菌株在3 種培養(yǎng)基中丁二酸的產(chǎn)量有顯著性差異(p<0.05),該5 株菌都是在五糧粉液培養(yǎng)基中產(chǎn)丁二酸能力最強,其次是麥芽汁液體培養(yǎng)基,YPD液體培養(yǎng)基中丁二酸產(chǎn)量最低。菌株Y4 在五糧粉液培養(yǎng)基中丁二酸產(chǎn)量最高,可高達478.8 mg/L。五糧粉液中葡萄糖含量較高,通過葡萄糖代謝提高了丁二酸的糖酸轉(zhuǎn)化率[18],但對于此5株菌在五糧粉液培養(yǎng)基中產(chǎn)丁二酸能力最強的原因目前尚未完全弄清楚,還有待于進一步研究。菌株Y4 為Naumovozyma castellii,為產(chǎn)乙醇酵母,其在五糧粉液培養(yǎng)基中產(chǎn)乙醇能力較強,應(yīng)該是通過乙醇合成丁二酸途徑產(chǎn)丁二酸。

        圖3 5株菌在不同培養(yǎng)基中丁二酸的產(chǎn)量

        3 結(jié)論

        從五糧液釀造環(huán)境中分離到5 株不同屬的酵母菌株,此5 株酵母菌用26S rDNA 序列可以鑒定到種,分屬于Kazachstania bulderi、Saccharomyces cerevisiae、Zygosaccharomyces bailii、Naumovozyma castellii、和Saccharomycopsis fibuligera5 個不同的屬;5 株不同屬酵母菌在3 種不同培養(yǎng)基中產(chǎn)丁二酸的能力有明顯不同,在五糧粉液培養(yǎng)基中產(chǎn)丁二酸能力均為最強,其次是麥芽汁液體培養(yǎng)基,YPD液體培養(yǎng)基中丁二酸產(chǎn)量最低。其中,菌株Y4(Naumovozyma castellii)在五糧粉液培養(yǎng)基中丁二酸產(chǎn)量最高。

        猜你喜歡
        株菌丁二酸麥芽
        異麥芽酮糖醇在卷煙增香保潤中的應(yīng)用
        云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:31:04
        吃心情的麥芽精
        卷柏素對唑類藥物體外抗念株菌的增效作用
        丁二酸對化學(xué)鍍Ni-P-納米TiO2復(fù)合鍍層性能的影響
        3株耐鹽細菌對萘、菲、惹烯和苯并[α]芘的降解性能
        生麥芽雞內(nèi)金茶
        特別健康(2018年3期)2018-07-20 00:24:54
        張云鴻:對待麥芽,就像對待自己的作品
        商周刊(2017年10期)2017-08-23 13:30:41
        Clustering of Virtual Network Function Instances Oriented to Compatibility in 5G Network
        聚丁二酸丁二醇酯/淀粉共混物阻燃改性的研究
        中國塑料(2016年1期)2016-05-17 06:13:05
        阻燃聚丁二酸丁二醇酯復(fù)合材料的制備及其阻燃性能研究
        中國塑料(2016年11期)2016-04-16 05:25:58
        青青草成人免费在线观看视频| 国产爆乳无码一区二区在线 | 国产三级黄色的在线观看| 蜜桃视频羞羞在线观看| 国产又色又爽无遮挡免费软件| 疯狂做受xxxx高潮欧美日本| аⅴ天堂一区视频在线观看 | 国产毛片视频一区二区| 亚洲精品熟女国产| 国产精品成人嫩妇| 精品少妇一区二区三区四区| 偷拍综合在线视频二区| 人妻无码αv中文字幕久久琪琪布| a级福利毛片| 精品一区2区3区4区| 国产成人午夜高潮毛片| 亚洲va中文字幕无码久久不卡 | 国产mv在线天堂mv免费观看| 极品av在线播放| 精品国产亚洲第一区二区三区| 亚洲人成色7777在线观看不卡| 色老头一区二区三区| 手机av在线观看视频| 国产内射爽爽大片| 欲色天天网综合久久| 欧美在线成人免费国产| 国产av无毛无遮挡网站| 永久黄网站色视频免费看| 色老头一区二区三区| 精品久久一区二区av| 一本无码中文字幕在线观| 久久国产精久久精产国| aⅴ色综合久久天堂av色综合| 久草福利国产精品资源| 丰满人妻熟妇乱又伦精品软件| 亚洲综合色区无码专区| 国产激情小视频在线观看| 国内最真实的xxxx人伦| 国产成人久久综合热| 全程国语对白资源在线观看| 中文字幕日韩精品有码视频|