張世微 徐章 張志海 何煥然

(1湖北職業(yè)技術學院，湖北 孝感 432000；2孝感市中心醫(yī)院；3漢川市血防辦公室；4孝感市孝南區(qū)血防辦公室)

銅綠假單胞菌是一種常見的機會致病菌，是肺炎的常見病原菌，尤其是在醫(yī)院獲得性肺炎中極為常見〔1〕。銅綠假單胞菌肺部感染后極易誘發(fā)全身性炎癥反應，甚至有可能發(fā)展成為多器官功能障礙綜合征，嚴重者會導致死亡〔2〕。LncRNA MALAT1是最早鑒定出與人類疾病相關的LncRNA之一〔3〕。研究表明。LncRNA MALAT1與人類多種肺部疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關，有研究報道LncRNA MALAT1參與了脂多糖誘導的急性肺損傷〔4〕，同時LncRNA MALAT1還可以作為預測非小細胞肺癌患者預后的生物標志物〔5〕。核因子(NF)-κB是一種廣泛存在的多效應轉錄因子，參與了大鼠銅綠假單胞菌肺炎的發(fā)生和發(fā)展〔6〕。LncRNA MALAT1作為NF-κB的前體調控因子〔7〕，有可能參與了銅綠假單胞菌導致肺炎的發(fā)展過程。本研究通過構建銅綠假單胞菌大鼠肺炎模型，探討LncRNA MALAT1在銅綠假單胞菌大鼠肺炎中作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與菌種 清潔級SD大鼠30只，雌雄各15只，周齡8～12 w，體重180～230 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(實驗動物合格證編號：12910371116)。銅綠假單胞菌標準株(ACTT27853)購于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司。

1.2實驗試劑及主要儀器 SD大鼠C反應蛋白(CRP)、白細胞介素(IL)-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α定量酶聯(lián)免疫試劑盒購于上海滬震實業(yè)有限公司；SD大鼠超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購于上海研啟生物科技有限公司；TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；PCR Master Mix試劑盒和qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；SD大鼠NF-κB免疫組化試劑盒購于上海雅吉生物科技有限公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白質濃度測定試劑盒購于福州奧研實驗器材有限責任公司。大鼠固定臺；XFA6130全自動動物血液細胞分析儀；光學顯微鏡；分光光度儀；酶標儀。

1.3動物模型構建及樣本收集 采用隨機數(shù)字法將實驗動物分為對照組、模型組和敲降LncRNA MALAT1模型組，每組10只。敲降LncRNA MALAT1模型組使用10%水合氯醛(0.1 ml/100 g)腹腔注射麻醉后將含有sh-MALATA1-RNA的PFU聚合酶經(jīng)鼻吸入大鼠肺內，繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)72 h后用于后續(xù)實驗。在模型構建前1 d將銅綠假單胞菌標準株接種于MH瓊脂平板上，置于恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h，肉眼可見綠色銅綠假單胞菌生長后進行滅菌，配制成2個麥氏單位濃度(6×1011cfu/L)的菌液待用。使用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠完全麻醉后將其固定在固定臺上，使用止血鉗拉出大鼠舌頭后固定于外部。使用注射器抽取0.4 ml菌液并插入大鼠氣管內，注菌完成后立即豎立大鼠并固定，左右搖晃固定臺1 min。對照組采用同樣的方法注入0.4 ml滅菌生理鹽水。

接種24 h后處死各組大鼠，使用EP管從眼窩處收集各組大鼠1.5 ml血液。分離大鼠氣管后使用1.0 ml生理鹽水進行灌洗并收集灌洗液。將大鼠血液和支氣管肺泡灌洗液在4℃條件下3 000 r/min離心5 min，收集上清液后凍存于-80℃冰箱中待用。在無菌條件下剖取各組大鼠肺組織，凍存于-20℃冰箱中待用。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定大鼠血清CRP水平 取0.5 ml大鼠血液，在4℃條件下3 000 r/min離心5 min后收集上清，使用大鼠CRP定量酶聯(lián)免疫試劑盒，參照試劑盒說明書檢測各組大鼠血液中CRP水平。

1.5ELISA測定大鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α水平 取各組大鼠肺組織(6 mm×6 mm×6 mm)在研磨器中研磨成組織勻漿，在4℃條件下12 000 r/min離心15 min，并收集組織勻漿上清液。使用大鼠IL-8和TNF-α定量免疫酶聯(lián)試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書檢測大鼠肺組織勻漿和支氣管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平。

1.6RT-qPCR檢測大鼠肺組織內LncRNA MALAT1表達 取各組大鼠肺組織后研磨成組織勻漿。使用TRIzol試劑提取組織中的總RNA，使用PCR Master Mix試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，使用qPCR SYBR Green Master Mix進行實時熒光定量PCR，以GAPDH為內參，使用2-ΔΔCt法進行計算。LncRNA MALAT1上游引物序列：5′-GCGAGCAGGCATTGTGGAGAG-3′；下游引物序列：5′-GCCGACCTCAAGAATGTTACCG-3′。GAPDH上游引物序列：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；下游引物序列：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。

1.7大鼠肺組織中SOD和MDA水平檢測 取各組大鼠肺組織后研磨成組織勻漿，在4℃條件下12 000 r/min離心15 min，并收集組織勻漿上清液。使用大鼠SOD和丙二醛檢測試劑盒，使用分光光度儀參照試劑盒說明書檢測大鼠肺組織中SOD和MDA水平。

1.8大鼠肺組織和血液中蛋白質濃度測定 收集各組大鼠肺組織和血液。處理后使用酶標儀測定樣本在562 nm處的吸光光度值，使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定各組大鼠肺組織和血液中的蛋白質濃度。

1.9免疫組化染色檢測各組大鼠肺組織中NF-κB的活性 收集大鼠肺組織，4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋。切片后進行常規(guī)脫蠟入水，參照試劑盒說明書使用鏈霉親和素-生物素復合物法堿性免疫組化染色。

1.10統(tǒng)計學處理 使用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1SD大鼠銅綠假單胞菌肺炎模型的構建 模型組接種銅綠假單胞菌24 h后臨床表現(xiàn)為呼吸急促，雙側胸廓呼吸幅度增加，懶動，精神狀態(tài)和食欲欠佳，蜷縮與鼠籠角落，對周圍刺激反應較差，體毛粗糙且無光澤。對照組大鼠接種滅菌生理鹽水前后無明顯變化。接種前兩組血液中WBC、NEUT、NEUTr%和CRP水平無明顯差異(t=0.001、0.000、0.500、3.0.252,P>0.05)，接種后24 h模型組均明顯升高(t=27.893、18.434、12.926、30.929,P<0.05)，對照組接種滅菌生理鹽水24 h后血液中各指標無明顯變化(t=0.707、0.877、0.097、0.485,P>0.05)，見表1。

表1 兩組接種前后血液中各指標變化

2.2體內LncRNA MALAT1和炎癥因子表達水平 RT-qPCR檢測結果顯示，模型組肺組織中LncRNA MALAT1水平(1.66±0.02)明顯高于對照組(0.97±0.01，P<0.05)。ELISA檢測結果顯示，相較于對照組，模型組肺組織內IL-8和TNF-α水平明顯升高(t=60.976、20.551,P<0.05)，且模型組支氣管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平也明顯升高(t=23.494、22.533,P<0.05)，敲降LncRNA MALAT1的模型大鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平相較于模型組明顯降低(t=43.244、16.033,P<0.05)，支氣管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平也明顯降低(t=7.365、14.397,P<0.05)，見表2。

表2 各組肺組織和支氣管肺泡灌洗中炎癥因子表達水平

2.3敲降LncRNA MALAT1可減輕銅綠假單胞菌引起的大鼠肺損傷 RT-qPCR檢測結果顯示，敲降LncRNA MALAT1后大鼠肺組織內LncRNA MALAT1表達水平(0.85±0.01)顯著低于對照組與模型組(1.02±0.02、1.53±0.02，P<0.05)。相較于對照組，模型組肺組織和血清中蛋白質濃度均顯著增加(t=9.351、3.436,P<0.05)，肺組織中SOD水平明顯降低(t=13.751,P<0.05)，MDA水平明顯升高(t=7.894,P<0.05)。

敲降LncRNA MALAT1的模型大鼠肺組織和血清中蛋白質濃度相較于模型組明顯降低(t=5.543、2.614,P<0.05)，且肺組織中SOD水平明顯升高(t=12.374,P<0.05)，MDA水平明顯降低(t=5.031,P<0.05)，見表3。

表3 各組肺損傷情況

2.4敲降LncRNA MALATA1對小鼠NF-κB活性的影響 免疫組化結果顯示，模型組肺組織中細胞質和細胞核內較對照組(1.09±0.78)均有明顯NF-κB著色(P<0.05)，敲降LncRNA MALAT1的模型大鼠肺組織細胞質和細胞核NF-κB著色(15.13±2.13)相較于模型組(24.27±3.46)明顯減少(P<0.05)。

3 討 論

銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界的濕潤環(huán)境中，也常定植于人體的呼吸道中。由于銅綠假單胞菌表面有抗吞噬和滲透作用的生物膜包覆〔8〕，且還具有多重耐藥性〔9〕，因此銅綠假單胞菌導致的肺炎在治療過程中存在諸多困難。隨著銅綠假單胞菌感染的日益增多，其發(fā)病機制、病理改變和預防治療成為了研究重點。

NF-κB信號通路參與了多種病原菌導致的肺炎〔10,11〕。本研究結果提示銅綠假單胞菌感染導致了大鼠肺組織中NF-κB信號通路的激活。研究顯示，NF-κB信號通路的激活能調控一系列參與肺部炎癥的炎癥因子表達〔12〕，如IL-8和TNF-α。TNF-α作為一種重要的炎性介質，介導創(chuàng)傷后炎癥反應，引起多器官組織損傷，同時還可刺激其他炎癥因子表達，如IL-6和IL-8等。IL-8能促進溶酶體酶的釋放，導致局部血管舒張、通透性增加，進而引起炎癥反應。本研究結果顯示，接種銅綠假單胞菌的模型大鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平均明顯增加。

LncRNA MALAT1參與了人體多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，但在炎癥調節(jié)中的機制較為復雜。Gu等〔7〕研究顯示敲降LncRNA MALAT1可通過抑制NF-κB信號通路的活性減輕肺支原體誘導的肺部損傷。Cao等〔13〕研究顯示，敲降LncRNA MALAT1減輕了小鼠腦缺血后的炎癥反應，且過表達LncRNA MALAT1加劇了腦缺血后的炎癥反應。然而Sun等〔14〕研究顯示LncRNA MALAT1可保護脂多糖誘導的心肌細胞損傷，Cermer等〔15〕研究也表明LncRNA MALAT1抑制了血管內皮細胞的炎癥反應，延緩了小鼠動脈粥樣硬化病變的形成。LncRNA MALAT1在不同研究中不一致的作用可能是因為其在不同疾病中調控機制的差異所導致。本研究結果提示敲降LncRNA MALAT1可顯著抑制銅綠假單胞菌肺炎大鼠的炎癥反應并減輕因其導致的肺損傷，其機制可能與抑制NF-κB活性有關。

總之，銅綠假單胞菌感染上調了LncRNA MALAT1在大鼠肺組織中的表達，促進了NF-κB信號通路的激活。敲降LncRNA MALAT1后抑制了銅綠假單胞菌介導的大鼠肺部炎癥反應并減輕了大鼠肺損傷，其機制可能是通過抑制NF-κB信號通路活性實現(xiàn)的。