錢旭東 王東 徐倩倩 李國蕓 王紅梅 張曉璇 馬征

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000；2呼吸內(nèi)科)

我國血管性癡呆(VD)的發(fā)病率不斷上升，目前僅次于阿爾茨海默病(AD)，癡呆患者中大約有1/5是VD患者〔1〕。突觸是神經(jīng)信息傳遞與處理過程的中心環(huán)節(jié)，研究報道稱神經(jīng)突觸的超微結構與認知功能密切相關，表明突觸的數(shù)量及功能狀態(tài)對認知功能有決定性作用〔2，3〕。對艾地苯醌在VD方面的研究發(fā)現(xiàn)，其能促進 VD 大鼠海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達，而 BDNF 與其受體共同作用可促進突觸再生，提高突觸可塑性，從而改善 VD 大鼠癡呆狀況〔4〕。為進一步明確艾地苯醌對 VD 大鼠海馬區(qū)突觸的影響，本研究從突觸相關蛋白的表達和突觸超微結構的角度進行研究。

1 資料與方法

1.1實驗動物 實驗動物 SPF級，體重250～300 g，7周齡，健康SD清潔級雄性大鼠40只，動物使用許可證號：SCXK(冀)2008-1-003，動物合格證編號：1404010，來源河北醫(yī)科大學實驗動物中心。在濕度50%～70%、室溫20℃～25℃中飼養(yǎng)，每籠5 只，喂養(yǎng)普通顆粒型大鼠飼料，正式實驗之前，適應性飼養(yǎng)1 w。

1.2試劑與儀器 小鼠抗大鼠微管相關蛋白(MAP)-2抗體、小鼠抗大鼠突觸素(SYP)抗體及小鼠抗大鼠突觸后密度蛋白(PSD)-95抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司，山羊抗小鼠〔辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗〕購自上海Abcam公司，Western印跡ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司，ZS-001 Morris水迷宮購自北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，TH4-200倒置顯微系統(tǒng)購自日本OLYMPUS。

1.3動物建模與分組 適應性喂養(yǎng)1 w后，按照隨機數(shù)字表將大鼠分為手術組(n=28)及假手術組(n=12)。手術組采用改良雙血管阻斷(2-VO)法建立大鼠 VD 模型，具體方法為：大鼠采用異氟烷吸入麻醉后先分離右側頸總動脈并兩端結扎，從結扎中心剪斷頸總動脈，分層縫合并以青霉素 40萬U/只局部注射預防感染，1 w后以同樣方法處理左側頸總動脈。假手術組不結扎及剪斷頸總動脈，其余操作步驟同手術組。模型建立6 w后，運用Morris 水迷宮方法挑選28只成功建模的大鼠。(逃避潛伏期各時段成績均值-平均對照組逃避時間)/逃避潛伏期該組大鼠均值≥0.2作為模型成功的辨別條件。將28只成模大鼠平均分為兩組，分別是艾地苯醌組、模型組，兩組給藥采取腹腔注射，10 mg/kg，持續(xù)給藥4 w，模型組及假手術組注入等量的生理鹽水。

1.4大鼠學習記憶能力檢測 給藥30 d后，對每組大鼠進行Morris 水迷宮實驗，持續(xù)6 d，前5 d用于定位航行，空間探索實驗利用最后1 d。水溫穩(wěn)定在22℃左右，水深約0.35 m，用攝像頭跟蹤老鼠的位置。通過水迷宮分析系統(tǒng)對采集的圖像及視頻進行數(shù)據(jù)分析。定位航行測試：進水點是以每個象限的中點為標記，統(tǒng)計2 min內(nèi)大鼠發(fā)現(xiàn)平臺的位置，停留在平臺上時間超過2 s是避開潛伏期。1天4次，算出平均值?？臻g探索測試：撤除原平臺，將大鼠隨機選一進水點放入水中，統(tǒng)計2 min內(nèi)大鼠穿越原平臺的次數(shù)和停留時間。

1.5免疫組織化學檢測 取各組大鼠腦組織切片通過二甲苯對石蠟切片進行兩次脫蠟過程，使用酒精梯度清洗脫蠟后的組織：二甲苯孵化5 min，棄二甲苯，重新添加二甲苯再次孵化5 min，無水乙醇、無水乙醇Ⅱ洗滌、95%乙醇依次洗滌3 min，80%乙醇 洗滌3 min，而后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min；將切片放至含有0.01 mmol/L檸檬酸緩沖液中，對切片進行恢復，并放入微波爐，加熱15 min，冷卻至室溫；將石蠟切片取出，放置在3% H2O2中(13±2)min，然后使用PBS洗滌3次；按照1∶500的比例加入NMDAR抗體，對石蠟組織切片進行室溫孵育1 h或者4℃孵育過夜，之后用PBS沖洗3次，每次3 min；按照1∶1 000的比例加入HRP二抗，對石蠟組織切片進行室溫孵育40 min，之后用PBS沖洗3次，每次3 min；加入DAB試劑盒中的顯色劑，室溫孵育5～10 min，然后清水沖洗；再進行蘇木素復染室溫孵育3～5 min，清水沖洗；對染色后的切片進行梯度酒精水化處理，采用樹脂進行封膠固定后觀察。對組織切片中的NMDAR采取上述相同的操作方法進行免疫組織化學染色觀察。

1.6突觸顯微結構觀察 每組選擇 3 只大鼠，使用10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉后進行斷頭處死，此時對腦組織進行快速剝離，順著視交叉前端切一個冠狀面，選取3 塊、大小約為1 mm3的大鼠左邊腦部CA1 區(qū)海馬組織，按照固定-漂洗-脫水-滲透-包埋順序操作后，制作60～80 nm超薄切片。采用鈾鉛進行雙染色，并經(jīng)充分瀝水過夜后，利用透射電鏡研究突觸情況。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗及方差分析。

2 結 果

2.13組學習記憶能力比較 連續(xù)給藥1 w后，與假手術組比較，模型組逃避潛伏時間明顯增高，而穿越平臺次數(shù)明顯減少(均P<0.05)；與模型組比較，艾地苯醌組逃避潛伏時間明顯減少，而穿越平臺次數(shù)明顯增高(均P<0.05)。見表1。

表1 3組學習記憶能力比較

2.23組海馬相關突觸蛋白的表達 3組MAP-2、SYP、PSD-95表達水平比較：艾地苯醌組>假手術組>模型組(均P<0.05)。見表2，圖1、圖2。

表2 3組海馬突觸蛋白表達比較

圖1 各組海馬MAP-2表達(DAB，×400)

圖2 各組海馬突觸相關蛋白表達(DAB，×400)

2.33組突觸超微結構的變化 假手術組突觸結構完整，突觸間隙清晰可見，突觸前后膜間吻合良好，突觸后膜可見均勻增厚，突觸曲面弧度規(guī)整，突觸小泡豐富，有結構完整的線粒體；模型組無突觸間隙，前后突觸膜界限難以區(qū)分，弧度不整齊，具有較少的突觸小泡，線粒體出現(xiàn)腫大或消失；艾地苯醌可見清晰突觸間隙、均勻增厚的突觸后膜，突觸結構大體完整，有較多的突觸小泡和完整、豐富的線粒體結構。見圖3。

圖3 各組突觸超微結構(×3 000)

3 討 論

VD是最常見的認知功能障礙病因之一，病變的腦血管引起全腦或局部供血、供氧不足，從而導致參與認知記憶等腦部特定神經(jīng)組織受損可能與其發(fā)病的機制相關〔5〕。中樞神經(jīng)系統(tǒng)對缺血缺氧有高度的敏感性，特別是小腦、海馬、大腦皮質(zhì)(第三層)等部位〔6〕。腦缺血受損會引發(fā)級聯(lián)反應，比如氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應、腦梗死周圍去極化、興奮性氨基酸毒性及能量衰竭等環(huán)節(jié)會使突觸傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控受到影響，促使神經(jīng)元突變受損，進而使學習記憶功能出現(xiàn)障礙〔7〕。大鼠和人類一樣，具有完整的Willis環(huán)，因此本研究采用2-VO法建立大鼠VD模型，而雙側頸總動脈阻斷后可導致大鼠海馬慢性供血不足。海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對缺血、缺氧損害極其敏感，頸總動脈阻斷導致的缺血缺氧性病變勢必導致神經(jīng)元凋亡及突觸的變性和丟失，使突觸數(shù)量下降，可塑性降低，突觸相關蛋白表達發(fā)生改變，并進一步影響突觸的結構與功能〔8，9〕。研究表明，突觸相關蛋白可調(diào)控突觸的生長、發(fā)育、成熟，并與突觸可塑性密切相關，當其表達發(fā)生變化后會導致個體產(chǎn)生交流缺陷、認知功能受損與感覺、焦慮等神經(jīng)精神癥狀及社會活動缺陷等，因此突觸相關蛋白的表達是突觸數(shù)量及功能狀態(tài)的標志，能夠從微觀層面反映突觸的病理生理變化〔10〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，艾地苯醌能明顯改善VD大鼠的學習記憶能力。免疫組化檢測則進一步證實艾地苯醌能明顯促進突觸相關蛋白SYP、MAP-2、PSD-95的表達。SYP是一種突觸前囊泡特定蛋白，由313個氨基酸組成，分子量38 kD，對突觸形成和突觸功能的維持意義重大，是突觸重建的重要標志〔10〕。SYP可作為突觸結構的標志物，在神經(jīng)外科手術中常用來標記突觸終末，避免神經(jīng)損傷。作為樹突生長神經(jīng)元標志蛋白的MAP-2主要在突觸后致密區(qū)、樹突棘、樹突、神經(jīng)元胞體中表達，與樹突棘的功能及形態(tài)和突觸可塑性緊密關聯(lián)，有調(diào)控突觸可塑性，促進神經(jīng)元突起成形等作用，與癲癇等疾病密切相關〔11〕。PSD-95是一種由724個氨基酸構成的突觸后蛋白，與突觸的可塑性、學習記憶等相關，其變異可導致個體智能障礙〔12〕。PSD-95不僅參與突觸信號的修飾，而且對樹突棘從生長-發(fā)育-分支-成熟的過程中都扮演著主要的作用。神經(jīng)元PSD-95的表達增多和突觸興奮性增強相關，而AD及輕度認知障礙(MCI)患者的神經(jīng)元PSD-95表達則明顯下降〔13～16〕。艾地苯醌MAP-2表達水平上升提示艾地苯醌對樹突成形和新突觸形成有促進作用，改善突觸可塑性，增強大鼠的學習和記憶能力；另一方面，艾地苯醌大鼠SYP與PSD-95也明顯升高，說明艾地苯醌能夠保存現(xiàn)有突觸，并促進了突觸重建與再生，從而保護了缺血缺氧損傷的神經(jīng)組織。PSD-95與MAP-2表達水平提升說明生成的神經(jīng)元樹突及增多和成熟的樹突棘創(chuàng)造了突觸重建的條件。電鏡觀察也進一步表明大鼠經(jīng)艾地苯醌治療后有正常突觸結構，豐富的突觸囊泡，突觸的尺寸變大，這些變化為神經(jīng)信息的有效傳遞和治療提供了物質(zhì)基礎。模型組無突觸間隙，前后突觸膜界限難以區(qū)分，無正常曲面，弧度不整齊，有較少的突觸小泡，線粒體出現(xiàn)腫大或消失；PSD-95、MAP-2、SYP比假手術組和艾地苯醌明顯降低，提示學習記憶能力下降與突觸損害、萎縮或凋亡緊密相關。

綜上，艾地苯醌可能對強突觸相關蛋白SYP、PSD-95、MAP-2的表達以上調(diào)的方式，改善學習記憶功能。動物實驗表明艾地苯醌還能促使突觸再生，確保了突觸的生理結構及功能正常，為神經(jīng)信息有序高效的處理創(chuàng)造了物質(zhì)前提。