許苗菁 鐘花 趙振強(qiáng) 陳薪旭 馮曉麗 張海英 王埮

(海南醫(yī)學(xué)院 1第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 海口 570102;2海南熱帶腦科學(xué)研究與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn))

Sodium butyrate improving the motor function and decreasing the anxiety-like behavior in mice damaged by 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine (MPTP)

XU Miao-Jing, ZHONG Hua, ZHAO Zhen-Qiang,etal.

Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570100, Hainan,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the influences of sodium butyrate (NaB) on motor function and anxious behavior of PD model.MethodsMice were divided into control, model, NaB groups. Control group of mice were intrapertioneally injected with saline for 28 days, model group of mice were injected with MPTP intrapertioneally for 14 days and continued to inject with saline for 14 days, NaB group of mice were injected with MPTP intrapertioneally for 14 days and continued to inject with NaB for 14 days. The behaviour experiment of mice were measured by rotarod test, pole test and open field. Western blot and immunochemistry were used to detect expression of TH protein in brains of mice.ResultsIn the rotarod test, the time on the rotarod of model mice were shorter than that of normal group, however the time of NaB group were increased significantly than that of model group. In pole test, compared with normal mice, the time to climb pole of model mice were significantly prolonged. In contrast, the time of NaB group of mice were shorter than that of model group. In open field, the numbers of crossing the middle region of model mice were less than that of control group, but were increased in NaB group. In addition, the total distance of model group was reduced compared with control group, while NaB group of mice were increased. In Western blot and immunochemistry test, compared with control group, TH expression of model mice was decreased, while it was increased in NaB group.ConclusionsNaB could increase the expression of TH in brain of MPTP model mice, reduce the loss of dopamine neurons, and improve the motor function and decrease the anxiety-like behavior in mice.

【Keywords】 Parkinson disease; Sodium butyrate;1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine; Motor function; Anxiety-like behavior

中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元缺失是帕金森病(PD)病理特點(diǎn)〔1〕。PD癥狀分運(yùn)動(dòng)癥狀和非運(yùn)動(dòng)癥狀，非運(yùn)動(dòng)癥狀包括焦慮，抑郁、睡眠障礙等〔2〕。目前PD因機(jī)制未能完全明確，針對(duì)性的治療一直是研究熱點(diǎn)。丁酸鈉(NaB)是一種去乙酰化酶抑制劑，也是一種重要神經(jīng)保護(hù)劑，其對(duì)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括PD具有一定的保護(hù)作用〔3～7〕。目前對(duì)丁酸鈉改善PD小鼠模型非運(yùn)動(dòng)癥狀，尤其是焦慮行為的改善作用未能完全明確，本文通過5，1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP )構(gòu)建 PD 小鼠模型，探究 NaB 通過減少多巴胺神經(jīng)元丟失，進(jìn)一步對(duì)PD小鼠運(yùn)動(dòng)及部分非運(yùn)動(dòng)癥狀的影響及作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與材料 動(dòng)物：150只SPF級(jí)C57小鼠，體重(20.09±0.39)g，8～10周齡，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，室溫21～23℃、濕度55%～60%SPF級(jí)動(dòng)物房養(yǎng)殖，12 h晝夜節(jié)律，自然光照，自由飲水進(jìn)食。小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和給藥組各50只。主要材料：MPTP及NaB粉末購自美國Sigma；酪氨酸羥化酶(TH)抗體及β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購自美國CST；苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)量試劑盒、電化學(xué)發(fā)光液(ECL)購自碧云天；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉生物有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購自天能科技有限公司；病理切片機(jī)購自萊卡；正置光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯；小鼠曠場實(shí)驗(yàn)軌跡分析儀器購自上海欣軟信息科技有限公司；小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)儀器購自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.2MPTP腹腔注射構(gòu)建PD 小鼠模型 MPTP 粉末配制成 5 mg/ml 濃度溶液，小鼠稱重后，按25 mg/kg進(jìn)行腹腔注射，持續(xù)注射14 d。正常組腹腔注射生理鹽水14 d。

1.3藥物干預(yù) 建模后，NaB粉末配制成240 mg/ml，按 1 200 mg/kg 進(jìn)行腹腔注射，持續(xù)14 d，正常組和模型組腹腔注射生理鹽水14 d。

1.4行為學(xué)檢測(cè)

1.4.1轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 設(shè)置轉(zhuǎn)棒裝置參數(shù)為3～30 r/min，逐漸加速，最長時(shí)間5 min。實(shí)驗(yàn)前3 d，小鼠預(yù)先進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，小鼠預(yù)先在滾棒上適應(yīng)30 s，然后啟動(dòng)裝置，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)記錄小鼠掉落時(shí)間。每只小鼠重復(fù)檢測(cè)3次，每次間隔1 min，計(jì)算平均掉落時(shí)間。實(shí)驗(yàn)間隔使用75%乙醇消除氣味。

1.4.2爬桿實(shí)驗(yàn) 取一長50 cm，直徑為1 cm表面粗糙木桿，在頂端固定一直徑2.5 cm 的泡沫小球，與地板傾斜度呈45°放置，將小鼠放置于頂端的泡沫小球上，記錄其從頂端到爬完桿時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)前3 d，預(yù)先使小鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，然后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)間隔使用75%乙醇清除氣味。每只小鼠重復(fù)檢測(cè) 3 次，中間間隔 1 min，取3次檢測(cè)結(jié)果的平均值作為最終的爬桿時(shí)間。時(shí)間越長，說明運(yùn)動(dòng)功能越差。

1.4.3曠場實(shí)驗(yàn) 取一500×500×300 mm3實(shí)驗(yàn)箱子，實(shí)驗(yàn)操作室上方裝有攝像機(jī)，連接軌跡分析儀，實(shí)驗(yàn)開始后，攝像機(jī)可完全記錄小鼠行動(dòng)軌跡，傳至分析儀，分析儀會(huì)對(duì)小鼠在箱子總路程及小鼠進(jìn)入中間區(qū)域次數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

1.5Western印跡 小鼠完善行為學(xué)后，苯巴比妥腹腔麻醉后，經(jīng)冰生理鹽水小鼠心臟灌注后取鼠腦，分離得到中腦黑質(zhì)，液氮速凍，以50 mg/ml比例加入含有PMSF裂解液，經(jīng)超聲裂解后得到總蛋白。采用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，取部分蛋白溶液，加入上樣緩沖液，沸水中變性3 min。微量器加量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，PVDF轉(zhuǎn)膜，一抗(抗TH)4°孵育過夜，次日，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入二抗，室溫孵育2 h,凝膠成像儀顯影拍照，使用Image J進(jìn)行灰度值分析。

1.6免疫組化 小鼠完善行為學(xué)后，苯巴比妥腹腔麻醉后，冰生理鹽水小鼠心臟灌注及4%多聚甲醛內(nèi)固定后迅速取出鼠腦，放入預(yù)冷4%多聚甲醛進(jìn)行外固定，經(jīng)不同梯度濃度乙醇進(jìn)行脫水，浸蠟包埋。萊卡切片機(jī)切片，使得石蠟片厚度為6 μm。石蠟片經(jīng)脫蠟水化，抗原修復(fù)、封閉等步驟后，使用一抗(抗TH抗體)4℃進(jìn)行孵育過夜，次日，二抗室溫下孵育30 min,DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，經(jīng)不同濃度乙醇脫水及二甲苯透明后，中性樹脂進(jìn)行封片。最后顯微鏡下觀察TH染色情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD 檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1NaB 改善 PD 模型小鼠運(yùn)動(dòng)癥狀 模型組轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間明顯比正常組短(P<0.001)，而藥物組則顯著延長(P<0.001)。模型組爬桿時(shí)間比正常組顯著延長(P<0.001)，丁酸鈉組爬桿時(shí)間比模型組顯著縮短(P<0.001)。見表1。

表1 3組轉(zhuǎn)棒及爬稈時(shí)間比較

2.2NaB 改善 PD 小鼠焦慮行為 模型組穿越中間區(qū)域次數(shù)較正常組顯著減少(P<0.01)，藥物組則較模型組顯著增多(P<0.05)。相對(duì)于正常組，模型組總路程顯著減少(P<0.01)，而給藥組則比模型組明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 3組曠場實(shí)驗(yàn)穿越中間區(qū)域次數(shù)及 總路程比較

2.3NaB 減少多巴胺神經(jīng)丟失 Western印跡結(jié)果顯示，模型組鼠腦 TH(0.75±0.093)表達(dá)較正常組(1.67±0.10)明顯下降(P<0.001)，而給藥組(1.20±0.021)則較模型組表達(dá)顯著上升(P<0.01)。免疫組化實(shí)驗(yàn)中，模型組鼠腦 TH(81.00±10.21)表達(dá)較正常組(161.33±12.34)明顯下降(P<0.01)，而給藥組(130.66±11.57)則較模型組表達(dá)顯著上升(P<0.05)。見圖1，圖2。

圖1 Western印跡檢測(cè) TH 表達(dá)

圖2 免疫組化檢測(cè)TH表達(dá)(×10)

3 討 論

PD是兩大神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變之一，發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病〔8〕。PD在年齡超80歲人群中發(fā)病率為1%～4%〔9〕，超65歲人群中發(fā)病率為2%～3%〔10〕。但在65歲以下，PD患病也逐漸增多，發(fā)病在45～65歲PD人群稱為早發(fā)型PD，除此之外，21～45歲PD病例也有報(bào)道〔11〕。PD在老年人中發(fā)病率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。但有關(guān)PD發(fā)病機(jī)制未被闡明，既往研究表明PD發(fā)病與神經(jīng)研炎癥、氧化應(yīng)激及線粒體功能失調(diào)等相關(guān)〔12～17〕。雖然PD病因未明，但炎癥、年齡、基因、環(huán)境等均被認(rèn)為涉及PD發(fā)生發(fā)展進(jìn)程〔18～20〕。鑒于其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制及病因，對(duì)PD治療仍為難題，現(xiàn)今治療主要是藥物替代治療為主，如左旋多巴等，但目前的治療方案只能延緩病情，而無法阻止病情進(jìn)展。

MPTP是β單胺氧化酶產(chǎn)物，可以代謝成為活性神經(jīng)毒物1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)〔21〕，作用于神經(jīng)元線粒體電子傳遞鏈，產(chǎn)生活性氧(ROS)及炎癥，可導(dǎo)致動(dòng)物腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)元死亡。因而常用來構(gòu)建PD動(dòng)物模型〔22,23〕；He等〔24〕實(shí)驗(yàn)中腹腔注射MPTP小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)及焦慮行為；鮑宇等〔25〕運(yùn)用MPTP刺激食蟹猴，構(gòu)建PD慢性疾病模型，同樣發(fā)現(xiàn)食蟹猴出現(xiàn)隨意運(yùn)動(dòng)受限、動(dòng)作遲緩、焦慮抑郁等行為。在本研究中采用對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射MPTP構(gòu)建PD小鼠模型。

PD主要以運(yùn)動(dòng)癥狀為主，包括靜止性震顫、肌強(qiáng)直、姿勢(shì)障礙等。非運(yùn)動(dòng)癥狀包括焦慮、抑郁、便秘及睡眠障礙等。為了驗(yàn)證模型成功性，在本研究中，選擇爬桿實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)對(duì) PD 小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)，結(jié)果說明 MPTP 小鼠運(yùn)動(dòng)功能嚴(yán)重受損，這與既往研究一致〔7〕。除了運(yùn)動(dòng)功能受損外，本研究選擇曠場實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)小鼠是否存在焦慮，結(jié)果表明其較正常小鼠焦慮行為增加。

TH 作為限速酶，可以催化酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮喟?，調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成，如：多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素等〔26〕。臨床數(shù)據(jù)顯示紋狀體內(nèi) TH 表達(dá)下降是 PD 患者重要標(biāo)志，隨著多巴胺神經(jīng)元丟失，TH 活性也進(jìn)行下降〔27〕。因此研究認(rèn)為 TH 是多巴胺神經(jīng)元標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)說明MPTP 小鼠模型可成功再現(xiàn) PD 相關(guān)表型。

NaB是一種短鏈脂肪酸，主要是由結(jié)腸共生菌(酪酸梭菌等)發(fā)酵食物纖維的代謝產(chǎn)物〔28〕，同時(shí)它也是一種重要的去乙酰化酶抑制劑(HDACi)〔4〕，可調(diào)控多種基因表達(dá)。Liu 等〔7〕發(fā)現(xiàn) NaB 可促進(jìn)結(jié)腸分泌胰高血糖肽(GLP)-1及顱腦內(nèi)胰高血糖肽-1 受體(GLP-1R)表達(dá)，通過腦腸軸發(fā)揮 PD 小鼠神經(jīng)保護(hù)作用；同時(shí)該研究發(fā)現(xiàn)NaB 可上調(diào)胞質(zhì)蛋白(ZO)-1,ZO-2,ZO-3和跨膜蛋白表達(dá)，減輕PD小鼠血腦屏障的破壞程度；此外，NaB 還可調(diào)控凋亡蛋白Bcl2 和 Bax 比例，減少細(xì)胞凋亡，最終改善 PD 小鼠的認(rèn)知功能及運(yùn)動(dòng)功能。相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示 NaB 可增加細(xì)胞周期蛋白激酶(CDK)6表達(dá)，提高D3細(xì)胞周期蛋白(D3)/周期蛋白依賴激酶(CDK6)/磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)信號(hào)通路活性，改善 6-羥多巴胺(OHDA，一種很強(qiáng)兒茶酚胺能神經(jīng)毒性藥物)對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的存活率的影響〔29〕。本研究結(jié)果表明 NaB 可顯著改善 PD 小鼠運(yùn)動(dòng)功能。

焦慮行為是PD常見非運(yùn)動(dòng)癥狀，目前有效減輕 PD 病人焦慮的有效藥物較少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NaB 可減輕模型鼠的焦慮行為。由此可得出，NaB不僅能改善 PD 小鼠運(yùn)動(dòng)功能，而且在一定程度可減輕 PD 小鼠焦慮行為。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NaB 可顯著減少多巴胺神經(jīng)元丟失，這從病理層面驗(yàn)證了 NaB 的有效性。

綜上所述，NaB 對(duì) PD 有一定保護(hù)作用，它可通過減少多巴胺神經(jīng)元缺失，進(jìn)而改善對(duì) PD 運(yùn)動(dòng)功能及部分非運(yùn)動(dòng)功能，這對(duì)今后 PD 的治療提供了一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及治療策略。但本研究有不足之處，雖然從行為學(xué)及病理學(xué)上進(jìn)一步驗(yàn)證 NaB 對(duì) PD 保護(hù)作用，但缺少具體發(fā)病機(jī)制研究，因 NaB 是一種去乙?；敢种苿?，今后研究將以表觀遺傳學(xué)為側(cè)重點(diǎn)，通過對(duì)各組小鼠進(jìn)行基因組測(cè)序，尋找相應(yīng)信號(hào)通路，深入研究其發(fā)病機(jī)制。