李水霞 孫麗蓉 蘇日娜 馬顯軍 杜曉 張毅 劉飛飛

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014000)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)表面表達(dá)CD34+、CD133+、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體等細(xì)胞分子，許多學(xué)者把同時(shí)表達(dá)CD34+、VEGF受體2(KDR)+、CD133+的細(xì)胞稱作早期的功能性EPCs，但到目前為止，并沒有直接的證據(jù)證明體外分離培養(yǎng)的外周血CD34+、KDR+、CD133+細(xì)胞能夠直接分化為內(nèi)皮細(xì)胞〔1，2〕。而單表達(dá)CD34+的EPCs在臨床上具有獨(dú)特的意義，稱之為CD34+細(xì)胞，其主要存在于骨髓中，當(dāng)機(jī)體在炎癥、缺血、損傷及腫瘤等病理狀態(tài)下，它可以從骨髓中動(dòng)員進(jìn)入外周循環(huán)血，再由外周循環(huán)血到達(dá)病變所在部位，增殖、分化為內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)血管及組織的損傷，對(duì)維持內(nèi)皮功能正常起著十分重要的作用，較低水平的外周血CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)已報(bào)道在各種肺部疾病中，包括急性肺損傷〔3〕，間質(zhì)性肺疾病〔4〕，穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。也有研究表明〔5〕，CD34+細(xì)胞水平降低與穩(wěn)定型冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，在CAD的急性事件期間，循環(huán)CD34+細(xì)胞的濃度在VEGF〔6〕和全身炎癥〔7〕的影響下顯著增加。到目前為止，CD34+細(xì)胞對(duì)COPD急性加重(AECOPD)惡化起到的作用尚未得到研究。本課題假設(shè)類似于CAD急性事件期間發(fā)生的情況，循環(huán)CD34+細(xì)胞的水平將在AECOPD期間增加，并探討這些細(xì)胞的增加是否與內(nèi)皮功能和全身炎癥的改變有關(guān)，進(jìn)一步探討COPD與內(nèi)皮細(xì)胞的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2016年10月至2017年10月內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科AECOPD患者35例，穩(wěn)定COPD患者35例，10例肺功能正常的吸煙者和10例健康從不吸煙者。所有患者符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2013年版《慢性阻塞性肺疾病診治指南》中制定的COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，AECOPD患者的選取標(biāo)準(zhǔn)是至少在入選前3個(gè)月接受了抗膽堿能藥，長(zhǎng)效β2激動(dòng)劑(LABA)和吸入皮質(zhì)類固醇激素治療。AECOPD患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有肺炎、肺栓塞、急性心腦血管疾病、腎功能不全、肝臟疾病、自身免疫疾病、任何來源的癌癥和(或)所需的機(jī)械通氣者。 COPD患者納入標(biāo)準(zhǔn)是：①根據(jù)慢性阻塞性肺病全球倡議(GOLD)標(biāo)準(zhǔn)的COPD；②在納入研究之前的12 w內(nèi)未急性加重或治療未變化而定義的臨床穩(wěn)定性；③至少在其包含前3個(gè)月用抗膽堿能藥，LABA和吸入皮質(zhì)類固醇治療。 在研究期間未接受全身性類固醇，且未患有神經(jīng)肌肉，風(fēng)濕病和(或)不穩(wěn)定的心及腦血管疾病，無吸煙史。

肺功能正常的吸煙者及肺功能正常的無吸煙者納入標(biāo)準(zhǔn)：①>50歲；②久坐不動(dòng)的生活方式；③正常的肺活量測(cè)定；④自愿參加這項(xiàng)研究。

1.2測(cè)量方法 測(cè)量均在入院的第一個(gè)24 h內(nèi)進(jìn)行，所有患者未接受過全身性皮質(zhì)類固醇和(或)抗生素的治療。對(duì)所有AECOPD患者的治療標(biāo)準(zhǔn)化：包括①霧化支氣管擴(kuò)張劑(異丙托溴銨130 μg和福莫特羅2次/d)；②吸入糖皮質(zhì)激素(布地耐德160 μg，2吸/次，2次/d)；③抗生素(頭孢他啶2.0 g，2次/d，連續(xù)7 d或左氧氟沙星500 mg，2次/d，連續(xù)7 d)；④控制氧療。 所有參與實(shí)驗(yàn)者全部在清晨空腹抽取肘靜脈血5 ml到肝素抗凝管，于-20℃冰箱保存。

1.3CD34+細(xì)胞的檢測(cè) 取4支TruCOUNT管，其中1支為測(cè)定管，另3支則為對(duì)照管，分別標(biāo)記，均加入50 μl抗凝血，測(cè)定管中加入CD34-PE，CD45-PerCP各10 μl，對(duì)照管中加入IgG1-PE，CD45-PerCP各10 μl，充分混合均勻，室溫下避光反應(yīng)15 min。四支試管中分別加入紅細(xì)胞裂解劑450 μl，充分混合均勻后，再次室溫下避光反應(yīng)15 min，24 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

流式細(xì)胞儀分析樣本數(shù)據(jù)：流式細(xì)胞儀(BD公司)，開機(jī)后以熒光校準(zhǔn)微球，自動(dòng)校準(zhǔn)軟件設(shè)置儀器狀態(tài)，包括熒光補(bǔ)償、靈敏度等參數(shù)，之后進(jìn)入ProCOUNT自動(dòng)分析軟件，對(duì)測(cè)定管和流式管進(jìn)行檢測(cè)，收集60 000個(gè)以上的有核細(xì)胞作為有效的信號(hào)，獲取數(shù)據(jù)文件，自動(dòng)分析其結(jié)果，測(cè)出CD34+細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)值，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，以上步驟一般不超過24 h。

使用市售試劑盒(BioSource，比利時(shí))通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定VEGF和C反應(yīng)蛋白(CRP)的血漿水平。 測(cè)量進(jìn)行2次，取平均值用于分析。

1.4肺功能 因AECOPD住院的患者，在出院時(shí)進(jìn)行肺功能測(cè)定。 在入院時(shí)呼吸室內(nèi)空氣的所有AECOPD患者中獲得動(dòng)脈血?dú)?IL BG3，Izasa，Spain)。所有受試者進(jìn)行靜息狀態(tài)下肺功能的測(cè)定，采用JAEGER肺功能儀完成檢測(cè)。所有受試者在檢查前的48 h內(nèi)未使用β受體激動(dòng)劑、抗膽堿類藥物、氨茶堿及糖皮質(zhì)激素等藥物，以免影響檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。主要檢測(cè)指標(biāo)為：用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1/FVC及FEV1占預(yù)計(jì)值的百分比(FEV1%)等肺功能指標(biāo)，當(dāng)吸入支氣管舒張劑后，F(xiàn)EV1/FVC<70%可以確認(rèn)為不完全可逆性氣流受阻。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20軟件進(jìn)行單向方差分析、Bonferroni檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組一般資料比較 各組年齡和體重指數(shù)(BMI)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。AECOPD組、穩(wěn)定COPD組、吸煙組心血管風(fēng)險(xiǎn)因素占比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但3組均明顯高于不吸煙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AECOPD組、穩(wěn)定COPD組FEV1、FEV1/FVC均明顯低于吸煙組和不吸煙組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；AECOPD組、穩(wěn)定COPD組氧分壓(PO2)均明顯低于吸煙組和不吸煙組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；各組二氧化碳分壓(PCO2)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組一般資料比較

2.2各組其他指標(biāo)比較 各組高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AECOPD組、穩(wěn)定COPD組和不吸煙組低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平均明顯低于吸煙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AECOPD組白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于其余3組，且吸煙組白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于不吸煙組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AECOPD組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于其余3組，且穩(wěn)定COPD組和吸煙組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于不吸煙組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；AECOPD組CD34+水平明顯高于穩(wěn)定COPD組和吸煙組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；AECOPD組VEGF水平明顯高于其余3組，且穩(wěn)定COPD組明顯高于不吸煙組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；AECOPD組CRP水平明顯高于其余3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組其他指標(biāo)比較

2.3相關(guān)性分析 AECOPD組循環(huán)CD34+細(xì)胞水平與PaO2(r=-0.23，P=0.16)和FEV1(r=-0.20，P=0.40)之間無相關(guān)性；穩(wěn)定COPD組循環(huán)CD34+細(xì)胞水平與PaO2(r=0.22，P=0.25)和FEV1(r=0.16，P=0.70)之間無相關(guān)性。AECOPD組VEGF水平與循環(huán)CD34+細(xì)胞水平之間存在正相關(guān)(r=0.35，P=0.040)，穩(wěn)定COPD組中未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性(r=0.29，P=0.83)。AECOPD組和穩(wěn)定COPD組心血管風(fēng)險(xiǎn)因素對(duì)VEGF水平無顯著影響。AECOPD組(r=0.32，P=0.85)或穩(wěn)定COPD組(r=0.304，P=0.76)循環(huán)CD34+細(xì)胞水平與CRP水平無相關(guān)性。 同樣，AECOPD組(r=- 0.07，P=0.96)或穩(wěn)定COPD組(r=0.19，P=0.25)循環(huán)中CRP和VEGF水平之間無相關(guān)性。

3 討 論

目前認(rèn)為COPD發(fā)生、發(fā)展的原因之一是肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔8〕。CD34+是參與內(nèi)皮損傷修復(fù)的細(xì)胞，可向損傷內(nèi)皮進(jìn)行趨勢(shì)，并定向分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，加速損傷內(nèi)皮的修復(fù)〔9～11〕。研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期COPD患者外周循環(huán)CD34+細(xì)胞水平及功能下降，但關(guān)于穩(wěn)定期COPD 患者外周血中 CD34+細(xì)胞水平減少的具體機(jī)制目前仍不是十分清楚，國(guó)外有學(xué)者推測(cè)可能與循環(huán)中的CD34+細(xì)胞在局部受損組織過度的積聚和被過度消耗有關(guān)〔12〕，也有學(xué)者推測(cè)與其自身的炎癥反應(yīng)有關(guān)，從而導(dǎo)致 CD34+細(xì)胞水平的降低〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn)COPD急性加重期CD34+細(xì)胞水平顯著增加，且與循環(huán)血管內(nèi)皮因子數(shù)量之間存在明顯正相關(guān)，與CRP水平無關(guān)。研究〔14，15〕表明除了VEGF可以引起內(nèi)皮祖細(xì)胞的增高，全身炎癥狀態(tài)也可能促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員，CRP水平和循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量之間存在明顯的正相關(guān)。Heeschen等〔16〕報(bào)告了內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和促紅細(xì)胞生成素之間的正相關(guān)，但與CRP水平無關(guān)。另外研究〔17〕發(fā)現(xiàn)COPD患者循環(huán)CD34+細(xì)胞水平的增高，可能與健康對(duì)照受試者的吸煙狀況不匹配有關(guān)，本研究與年齡，性別和吸煙狀況相匹配的對(duì)照組相比，COPD患者的CD34+細(xì)胞水平顯著增高。排除諸多影響CD34+細(xì)胞水平的因素外，可能循環(huán)CD34+細(xì)胞水平的增高與VEGF水平上調(diào)有關(guān)。

總之，AECOPD患者的CD34+細(xì)胞水平顯著高于穩(wěn)定期的COPD患者、健康吸煙者和健康從不吸煙者。在AECOPD期間，循環(huán)CD34+細(xì)胞水平與VEGF水平正相關(guān)，表明AECOPD患者的CD34+細(xì)胞水平的增加，可能與VEGF的增高有關(guān)。這些觀察的臨床相關(guān)性需要未來大樣本進(jìn)一步研究。