盛莉 王琳 康延海 陳鄧林 楊生輝 李向璐 李賽 孔燦燦 袁波

(海南省人民醫(yī)院 海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院 1腫瘤內(nèi)一科，海南 ?？?570311；2心理科；3內(nèi)鏡診療中心；4胃腸外科)

結(jié)直腸癌發(fā)病率在我國(guó)老年人群惡性腫瘤中位居第三位，死亡率居第五位，是威脅老年人生命健康的主要疾病之一〔1〕。尋找有臨床意義的分子用于結(jié)直腸癌的診斷及監(jiān)測(cè)一直是學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)，近年來(lái)隨著基因調(diào)控研究由編碼基因深入到非編碼基因水平，長(zhǎng)鏈非編碼RNA在結(jié)直腸癌中的作用逐漸被揭示，有望與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物協(xié)同從而提高老年結(jié)直腸癌的診療水平〔2〕。HAGLR是2017年首次發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其在食管癌、肝癌及結(jié)直腸癌細(xì)胞中均表現(xiàn)出促癌活性〔3～5〕，提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有成為腫瘤分子標(biāo)志物的潛能，但有關(guān)其在老年結(jié)直腸癌患者中的臨床意義尚未見報(bào)道。本研究擬分析HAGLR在老年結(jié)直腸癌患者組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年5月至2019年6月在海南省人民醫(yī)院手術(shù)的患者組織樣本215例(觀察組)，同期選取年齡及性別與觀察組匹配的患者100例，經(jīng)結(jié)直腸鏡活檢結(jié)果為增生性息肉或炎性息肉，手術(shù)切除標(biāo)本及活檢組織標(biāo)本均使用生理鹽水沖洗后剪碎裝入凍存管，置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。回顧分析患者臨床資料包括年齡、性別、腫瘤位置、大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤分化程度〔6〕及術(shù)前癌胚抗原(CEA)水平，采用電話隨訪或門診復(fù)診的方式，自手術(shù)當(dāng)日起進(jìn)行隨訪，截止時(shí)間為2020年6月30日，記錄患者總生存時(shí)間(病理確診日期至患者死亡或最后1次隨訪日期)和無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間(病理確診日期至局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或最后1次隨訪日期)〔7〕。本研究已報(bào)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。對(duì)照組男72例，女28例；年齡64～75歲，平均(67.8±6.9)歲。觀察組男144例，女71例；年齡61～77歲，平均(68.4±7.5)歲；腫瘤位置：結(jié)腸12例，直腸94例；腫瘤大小2.3～6.9 cm，平均(4.5±2.3)cm；浸潤(rùn)深度：T1 46例，T2 65例，T3 104例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N0 54例，N1 75例，N2 86例；臨床分期：Ⅰ期66例，Ⅱ期37例，Ⅲ期112例；腫瘤分化程度：低分化71例，中分化77例，高分化67例。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前活檢及術(shù)后組織病理報(bào)告明確為普通管狀腺癌；②接受結(jié)直腸癌根治手術(shù)且完整切除腫瘤(腫瘤浸潤(rùn)最深處與切緣軟組織距離>1 mm)；③術(shù)前未接受放療、化療、靶向治療和生物治療等輔助治療；④患者神志清楚且積極配合研究；⑤年齡>60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前經(jīng)CT或磁共振成像(MRI)證實(shí)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②特殊病理類型如印戒細(xì)胞癌、鱗癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等；③接受姑息性切除；④5年內(nèi)有其他惡性腫瘤既往史者；⑤合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能不全者。

1.3Trizol法 提取總RNA 取100 mg組織加入1 ml Trizol(中國(guó)，上海，賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)15596026)，制備組織勻漿后轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管，室溫靜置5 min后加入200 μl氯仿，顛倒混勻后室溫靜置5 min，4℃下12 377 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相至新1.5 ml離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10 min，4℃下12 377 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 ml 75%乙醇4℃下9 790 r/min離心5 min清洗2次，棄乙醇留取沉淀，自然晾干10 min后20 μl 焦碳酸二乙酯水溶解沉淀。采用超微量分光光度計(jì)(中國(guó)，上海，賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)NanoDrop2000)測(cè)定總RNA濃度及純度，合格RNA樣品A260與A280比值為1.8～2.0。

1.4逆轉(zhuǎn)錄 cDNA合成根據(jù)步驟1.3中總RNA的濃度計(jì)算逆轉(zhuǎn)錄中所需模板RNA體積，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(中國(guó)，上海，賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)K1621)合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系：2 μg總RNA，1 μl逆轉(zhuǎn)錄引物，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，1 μl 200 U/μl逆轉(zhuǎn)錄酶，5 μl 5倍逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，1 μl 20 U/μl RNA酶抑制劑，并用無(wú)RNA酶水將總反應(yīng)體積補(bǔ)至20 μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量 PCR采用 TB Green?Fast qPCR Mix(中國(guó)，北京，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)RR430S)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR體系：10 μl 2×TB Green Fast qPCR Mix，上下游10 μmol/L引物各0.8 μl，0.4 μl 50×ROX，2 μl模板cDNA，6 μl滅菌水。使用7500HT快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(中國(guó)，上海，賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)4351107)進(jìn)行PCR。以GADPH作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s預(yù)變性后，95℃ 3 s，60℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后設(shè)置熔解曲線分析程序。 所用引物序列如下：HAGLR上游引物5′-GGCTCTTCCCTAATGTGTGG-3′，下游引物5′-CAGGTCCAGCATGAAACAGA-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GACTCATGACCACAAGTCCATGC-3′，下游引物5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。每反應(yīng)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)各孔獲得的循環(huán)閾值(CT)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，采用2-ΔΔCT法分析基因表達(dá)水平，相對(duì)表達(dá)的倍數(shù) N=2-ΔΔCT，其中ΔΔCT =ΔCT實(shí)驗(yàn)-ΔCT對(duì)照組，ΔCT實(shí)驗(yàn)/對(duì)照=CT目的基因-CT內(nèi)參。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)；使用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估診斷效能；術(shù)后生存率用Kaplan-Meier檢驗(yàn)，曲線差異用對(duì)數(shù)秩分析，生存率用壽命表法計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1HAGLR對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能 觀察組HAGLR表達(dá)量及術(shù)前CEA水平〔(7.1±5.0)ng/ml〕高于對(duì)照組〔(0.6±0.2),(4.2±1.9)ng/ml〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.001)，HAGLR對(duì)結(jié)直腸癌診斷的曲線下面積(AUC)值〔0.890(95%CI0.851～0.923)〕高于CEA〔0.718(95%CI0.665～0.767)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1。根據(jù)ROC曲線確定HAGLR和CEA最佳靈敏度和特異度下截?cái)嘀捣謩e為0.86和7.37 ng/ml。HAGLR診斷結(jié)直腸癌的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及正確指數(shù)分別為73.5%、91.0%、94.6%、61.5%、0.64；CEA對(duì)診斷結(jié)直腸癌分別為52.6%、94.0%、95.0%、48.0%、0.47。

圖1 HAGLR診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

2.2HAGLR與患者臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)HAGLR表達(dá)水平將患者分為高表達(dá)組(HAGLR表達(dá)>0.86)128例及低表達(dá)組(HAGLR表達(dá)≤0.86)87例。高表達(dá)組男性比例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、臨床分期及術(shù)前CEA水平均高于低表達(dá)組，腫瘤分化程度低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.001)，見表1。

表1 HAGLR與患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3HAGLR與患者預(yù)后的關(guān)系 至隨訪截止日期共失訪18例(8.4%)，其中高表達(dá)組10例(7.8)，低表達(dá)組8例(9.2%)，隨訪時(shí)間12.0～28.5個(gè)月，中位隨訪時(shí)間15.2個(gè)月，全隊(duì)列總生存率為81.7%，總生存時(shí)間為(23.4±2.7)個(gè)月(95%CI：20.5～26.3個(gè)月)，其中低表達(dá)組為89.8%；高表達(dá)組總生存率為73.7%，低表達(dá)組總生存時(shí)間為(25.0±2.5)個(gè)月(95%CI：22.4～28.7個(gè)月)，高于高表達(dá)組的(22.6±3.4)個(gè)月(95%CI：18.9～25.3個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；無(wú)復(fù)發(fā)生存率為70.1%，無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間為(22.1±1.9)個(gè)月(95%CI：20.6～24.3個(gè)月)，其中低表達(dá)組無(wú)復(fù)發(fā)生存率為83.7%，高表達(dá)組為56.6%；低表達(dá)組無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間為(24.7±2.2)個(gè)月(95%CI：22.1～26.7個(gè)月)，高于高表達(dá)組的(20.3±2.1)個(gè)月(95%CI：17.5～23.9個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)。

3 討 論

近年來(lái)多種長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子被發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌的病理特征及預(yù)后相關(guān)，有助于彌補(bǔ)過(guò)去CEA診斷敏感性及預(yù)后預(yù)測(cè)效能較差的缺陷〔8～10〕。本研究結(jié)果顯示腫瘤患者組織中HAGLR的表達(dá)量及術(shù)前CEA水平均升高，進(jìn)一步診斷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CEA對(duì)結(jié)直腸癌診斷的特異度較高而靈敏度欠佳，與既往研究結(jié)論相符，Peng等〔11〕研究中CEA診斷結(jié)直腸癌的特異度和敏感度分別為93.6%和45.6%，略低于本研究，其原因可能在于Peng等〔11〕的研究對(duì)象年齡范圍為27～97歲，本研究?jī)H納入了60歲以上的老年患者。HAGLR在與CEA診斷特異度相當(dāng)?shù)幕A(chǔ)上表現(xiàn)出更高的靈敏度，診斷效能高于CEA。

以往細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了HAGLR可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化〔4〕，也有研究報(bào)道HAGLR在肺腺癌細(xì)胞中表現(xiàn)為抑癌表型，提示HAGLR可能在不同腫瘤類型中發(fā)揮著不同的功能，有待進(jìn)一步深入探討〔12〕，而其與腫瘤浸潤(rùn)深度及腫瘤部位并未見顯著關(guān)聯(lián)，說(shuō)明HAGLR可能更傾向于影響腫瘤的分化及轉(zhuǎn)移而不是其增殖能力。本研究還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組男性比例更高，其機(jī)制尚不明確，推測(cè)這可能與其編碼基因所在染色體與Y染色體之間的連鎖有關(guān)。

本研究存在以下幾點(diǎn)不足：①由于結(jié)直腸癌術(shù)后輔助治療方案取決于患者基因多態(tài)性且情況復(fù)雜，因此本研究未納入術(shù)后輔助放化療情況，后續(xù)研究有必要將其納入亞組分析〔13〕；②本研究使用組織樣本而不是外周血檢測(cè)HAGLR的表達(dá)，這主要在于目前技術(shù)水平的不足限制了外周血長(zhǎng)鏈非編碼RNA的檢出率，有賴于未來(lái)基礎(chǔ)科研的進(jìn)步提高HAGLR臨床應(yīng)用價(jià)值〔14，15〕。