游佳欣，應(yīng)文俊，楊倩倩，廖紅，徐勇，張軍華,2*

(1. 南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,南京 210037； 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

楊樹是我國(guó)三大速生人工林樹種之一，常用于制漿造紙、家具、建材等。在楊木加工過程中，會(huì)產(chǎn)生約40%的楊木廢渣，將其制備成生物乙醇[1-2]或高值化學(xué)品[3]符合我國(guó)綠色經(jīng)濟(jì)的理念。益生菌是指對(duì)宿主的生理功能產(chǎn)生有益作用的活性微生物，常用于食品、醫(yī)藥和畜牧領(lǐng)域[4-5]?？莶菅挎邨U菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、無毒無害、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，其作為國(guó)家允許使用的飼料添加劑，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌能夠分泌纖維素酶、蛋白酶等多種酶、抗菌素等活性物質(zhì)，提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)消化，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力。如在生長(zhǎng)肥育豬日糧添加0.03%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌，可提高肥育豬的采食量和消化率[6]。

筆者以楊木酶水解液為原料，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，繪制了楊木酶水解液培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線，探討了枯草芽孢桿菌代謝不同單糖的規(guī)律和菌體生長(zhǎng)的規(guī)律。本研究以楊木纖維素酶水解液作為碳源發(fā)酵制備益生菌，為楊木廢棄物的高值化利用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 楊木酶水解液

楊木酶水解液由南京林業(yè)大學(xué)生物工程系生物化工研究所制得。以楊木屑為原料，經(jīng)乙酸預(yù)處理制備低聚木糖后，利用過氧化氫-乙酸預(yù)處理脫除木質(zhì)素，再經(jīng)纖維素酶水解得到。楊木酶水解液的化學(xué)組成為101.7 g/L葡萄糖、20.7 g/L木糖、8.6 g/L纖維二糖、3.6 g/L乙酸、0.7 g/L乙酰丙酸和0.4 g/L的5-羥甲基糠醛。

1.1.2 枯草芽孢桿菌

BacillussubtilisYS01，由南京林業(yè)大學(xué)生物工程系生物化工研究所保藏。

1.1.3 纖維素酶

纖維素酶CTec2購(gòu)自諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司，酶活為123 FPU/mL，酶蛋白含量為176.2 mg/mL。

1.1.4 主要設(shè)備

MAXQ4000型恒溫?fù)u床(美國(guó)賽默飛)、MLS-3020型高壓滅菌鍋(日本三洋)、1.6R型冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛)、MSC1.2型無菌操作臺(tái)(美國(guó)賽默飛)、752S型紫外可見光分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)、FE20型pH計(jì)(瑞士梅特勒-托利多)、PL303型電子天平(瑞士梅特勒-托利多)、Agi-lent 1260型高效液相色譜儀(德國(guó)安捷倫)。

1.1.5 培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌活化培養(yǎng)基：1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖，1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))魚粉蛋白胨，0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))酵母膏，1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl，pH為7.0。

瓊脂固體培養(yǎng)基(用于平板計(jì)數(shù)法計(jì)算枯草芽孢桿菌活菌數(shù))：0.50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))魚粉蛋白胨，0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))酵母膏，0.10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖，1.50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂，pH為7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：1.00%(體積分?jǐn)?shù))楊木酶水解液，1.00%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))魚粉蛋白胨，0.15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))K2HPO4，0.02%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))MgSO4，pH為7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 技術(shù)路線

楊木屑經(jīng)乙酸預(yù)處理[6.5%(體積分?jǐn)?shù))乙酸，172 ℃，27 min] 制備低聚木糖后，水洗至中性，自然風(fēng)干后，得到固體殘?jiān)?。以此固形物為原料，采?5%(體積分?jǐn)?shù))的過氧化氫-乙酸(體積比為1∶1)預(yù)處理(80 ℃，2 h)[7]，將預(yù)處理殘?jiān)M(jìn)一步酶水解后得到楊木酶水解液，酶水解液中含有豐富的單糖(葡萄糖和木糖)，將作為后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的碳源。

1.2.2 種子液的制備

吸取保藏于-18 ℃的甘油管中的菌液100 μL，接種于活化培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，作為種子液備用。

1.2.3 OD600值、活菌數(shù)的測(cè)定和生長(zhǎng)曲線的繪制

OD600值、活菌數(shù)的測(cè)定和生長(zhǎng)曲線的繪制方法參考Fan等[8]的方法。

1.2.4 糖含量的檢測(cè)

葡萄糖和木糖質(zhì)量濃度的測(cè)定采用高效液相色譜法。測(cè)試樣品先經(jīng)過10 000 r/min離心5 min，先稀釋相應(yīng)倍數(shù)，上清液經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后，在Agilent 1260型高效液相色譜儀上，色譜柱為Bio-Rad HPX-87H(300 mm×7.8 mm,長(zhǎng)×內(nèi)徑)，Bio-Rad MG Cartridges(30 mm×4.6 mm,長(zhǎng)×內(nèi)徑)，流動(dòng)相為0.005 mol/L硫酸，流速為0.6 mL/min，柱溫為55 ℃，在示差折光檢測(cè)器(RI)上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 單因素優(yōu)化培養(yǎng)基組分

按照初始發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，培養(yǎng)基中碳源固定為楊木酶水解液，分別研究氮源(硫酸銨、脲、牛肉膏、酵母浸膏、魚粉蛋白胨)、無機(jī)鹽(NaCl、KCl、Na2SO4、K2SO4、Na2HPO4、K2HPO4)、微量元素(MnSO4、MgSO4、ZnCl2、CaCl2)對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況的影響。確定最適氮源、無機(jī)鹽和微量元素后，分別研究楊木酶水解液添加量(0%～5.00%)、氮源添加量(0%～5.00%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、無機(jī)鹽添加量(0.010%～0.125%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))和微量元素添加量(0%～0.05%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響。

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接種，置于37 ℃、150 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，測(cè)定其OD600值和活菌數(shù)，分析比較后得到最佳培養(yǎng)基組分。

1.2.6 單因素優(yōu)化培養(yǎng)條件

按照單因素優(yōu)化的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別考察溫度(30，35，40，45和50 ℃)、pH(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0和9.0)、搖床轉(zhuǎn)速(110，130，150，170，190和210 r/min)、接種量(0.5%，1.0%，2.0%，5.0%和10.0%體積分?jǐn)?shù))和裝液量(5，10，15，20和25 mL，相對(duì)于50 mL體系)對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，測(cè)定其OD600值和活菌數(shù)，分析比較后得到最佳培養(yǎng)條件。

1.2.7 培養(yǎng)基組分的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成，選取楊木酶水解液添加量(2.00%～4.00%體積分?jǐn)?shù))、魚粉蛋白胨添加量(1.00%～3.00%質(zhì)量分?jǐn)?shù))、K2HPO4添加量(0.03%～0.07%質(zhì)量分?jǐn)?shù))3因素3水平，根據(jù)軟件Design-Expert 12設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方案，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，按照優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)24 h后記錄結(jié)果，并對(duì)優(yōu)化出的結(jié)果進(jìn)行5次重復(fù)，利用軟件Design-Expert 12進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

2.1.1 楊木酶水解液添加量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

以楊木酶水解液為碳源時(shí)，其添加量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況的影響如圖1a所示。當(dāng)培養(yǎng)基中不添加酶水解液時(shí)，培養(yǎng)基中的活菌數(shù)僅有1.86×108CFU/mL，隨著酶水解液的添加量增加至3.00%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，活菌數(shù)明顯增加，說明菌體生長(zhǎng)情況最好；隨著培養(yǎng)基中酶水解液添加量從3.00%增加至5.00%，活菌數(shù)并沒有隨之增加，反而出現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。因此選擇3.00%為培養(yǎng)基中最佳楊木酶水解液添加量。

圖1 碳源和氮源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況的影響

2.1.2 氮源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

氮源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響如圖1b所示，相比添加無機(jī)氮源，有機(jī)氮源富含蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更適合枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，魚粉蛋白胨作為氮源時(shí)，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況最佳，因此選擇魚粉蛋白胨作為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中的唯一氮源。此外，研究氮源添加量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況的影響，結(jié)果如圖1c所示。當(dāng)培養(yǎng)基中不添加氮源時(shí)，培養(yǎng)基中的活菌數(shù)僅有8.23×107CFU/mL。當(dāng)魚粉蛋白胨添加量由2.00%增加至5.00%，菌液中活菌數(shù)反而減少，說明魚粉蛋白胨添加過多反而不利于菌體的生長(zhǎng)代謝。當(dāng)魚粉蛋白胨添加量為2.00%時(shí)，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況最好，活菌數(shù)可達(dá)到3.62×108CFU/mL，因此選擇2.00% 添加量為最適魚粉蛋白胨添加量。

2.1.3 無機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

在微生物發(fā)酵過程中，無機(jī)鹽不僅可以維持培養(yǎng)基pH穩(wěn)定，而且提供了菌體核酸合成代謝所必需的元素[9]，是培養(yǎng)基重要組分之一。無機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響如圖2a所示。分別添加Na2HPO4和K2HPO4的枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于添加NaCl和KCl的培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況，其原因可能是Na2HPO4和K2HPO4不僅能提供枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)所需的Na、K元素。而且Na2HPO4和K2HPO4還能提供菌體生長(zhǎng)所需的P元素，而且氨基酸前體的活化及一些與代謝有關(guān)的酶的合成都與P元素有關(guān)。由于添加Na2HPO4和K2HPO4對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況影響差異不大，菌體生長(zhǎng)情況均達(dá)到較高水平，因此僅選擇K2HPO4作為培養(yǎng)基無機(jī)鹽組分進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。研究了K2HPO4添加量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況的影響，結(jié)果如圖2b所示。當(dāng)K2HPO4的添加量增加到0.05%，培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)最高可達(dá)3.68×108CFU/mL。因此，確定K2HPO4最優(yōu)添加量為0.05%。

2.1.4 微量元素對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

不同微量元素對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響如圖2c所示，CaCl2和MgSO4的添加均對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。而Mg2+在細(xì)胞中糖酵解和三羧酸循環(huán)等酶促反應(yīng)中作為輔助因子，是許多酶催化反應(yīng)的激活劑，選擇合適的Mg2+添加量有助于菌體生長(zhǎng)[10]。但在培養(yǎng)基中添加過多的金屬離子會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[11]。因此，選擇MgSO4作為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中的微量元素。MgSO4添加量對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖效果影響不顯著，當(dāng)添加量為0.04% 時(shí)，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量達(dá)到最高。因此，選擇培養(yǎng)基中MgSO4的添加量為0.04%。

圖2 無機(jī)鹽和微量元素對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況的影響

經(jīng)過單因素試驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為3.00%(體積分?jǐn)?shù))楊木酶水解液、2.00%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))魚粉蛋白胨、0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))K2HPO4、0.04%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))MgSO4，該培養(yǎng)基組成將用于后續(xù)培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)

溫度主要影響菌體中酶反應(yīng)速率，溫度適當(dāng)升高，加快菌體中酶促反應(yīng)速率，增強(qiáng)菌體代謝，但溫度過高將不利于菌體生長(zhǎng)，結(jié)果如圖3a所示。隨著溫度由30 ℃升高至50 ℃，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)先增加后降低，其中在35 ℃條件下生長(zhǎng)情況最佳，活菌數(shù)可達(dá)到3.62×108CFU/mL。培養(yǎng)溫度超過35 ℃后，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)能力逐漸降低。因此，選擇35 ℃為枯草芽孢桿菌最佳培養(yǎng)溫度。

pH對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響由圖3b所示，枯草芽孢桿菌在酸性和堿性環(huán)境下均具有一定耐受性[12]，當(dāng)pH為4.0或9.0時(shí)，枯草芽孢桿菌仍能生長(zhǎng)，但此種情況下并不利于其生長(zhǎng)。根據(jù)枯草芽孢桿菌在不同pH條件下的生長(zhǎng)情況可以看出，菌體在pH為7.0時(shí)生長(zhǎng)情況最佳。

搖床轉(zhuǎn)速的改變對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況的影響主要是影響通氣量，從而影響培養(yǎng)基中的溶氧。隨著搖床轉(zhuǎn)速增加至190 r/min，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況達(dá)到最佳(圖3c)，活菌數(shù)可達(dá)到3.62×108CFU/mL，因此選擇最佳搖床轉(zhuǎn)速為190 r/min。

裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響如圖3d所示，適當(dāng)調(diào)整裝液量有益于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，50 mL三角瓶的5 mL體系中，活菌數(shù)達(dá)到最高值6.88×108CFU/mL，裝液量為10 mL時(shí)，生長(zhǎng)情況次之，活菌數(shù)可達(dá)6.05×108CFU/mL。結(jié)合實(shí)際情況和培養(yǎng)效率，選擇裝液量為10 mL為最適裝液量。

圖3 培養(yǎng)條件對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)情況的影響

接種量對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖效果影響不顯著。當(dāng)接種量為2.0%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)，菌液中活菌數(shù)可達(dá)到最高，因此選擇的接種量為2.0%。綜上，根據(jù)培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，確定枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)條件為：溫度35 ℃、pH 7.0、轉(zhuǎn)速190 r/min、接種量2.0%、裝液量為10 mL(相對(duì)于50 mL)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基組分試驗(yàn)的分析

通過單因素試驗(yàn)確定了影響枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的3個(gè)主要因素(楊木酶水解液、魚粉蛋白胨、K2HPO4)，采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)(表1)，以最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分。對(duì)表1中結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸模型ANOVA分析和各因素的主效應(yīng)結(jié)果(圖4)，根據(jù)表1可得出模型的p值小于0.000 1，說明該模型顯著，而誤差項(xiàng)p值大于0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾小。擬合檢驗(yàn)顯著，說明建立的模型是有效的，與實(shí)際情況擬合較好，并且3種因素對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響是顯著的。

表1 響應(yīng)面法對(duì)菌液OD600的ANOVA分析

兩因素交互作用影響枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的響應(yīng)面分析由圖4所示。其中，等高線為橢圓形，說明交互作用顯著[13-14]。等高線的疏密可以看出楊木酶水解液和魚粉蛋白胨對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響>楊木酶水解液和K2HPO4對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響>魚粉蛋白胨和K2HPO4對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響。軟件預(yù)測(cè)出的3種培養(yǎng)基組分的最優(yōu)濃度為：3.20%(體積分?jǐn)?shù))楊木酶水解液、2.30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))魚粉蛋白胨、0.06%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))K2HPO4，最優(yōu)條件的預(yù)測(cè)值OD600為15.85，對(duì)應(yīng)活菌數(shù)為6.34×108CFU/mL。按預(yù)測(cè)得到的最優(yōu)培養(yǎng)基組成進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，培養(yǎng)24 h后得到的OD600值為15.98，對(duì)應(yīng)活菌數(shù)為6.39×108CFU/mL，與響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)所得預(yù)測(cè)值接近。這表明該模型較好地預(yù)測(cè)了試驗(yàn)結(jié)果，說明該模型和試驗(yàn)結(jié)果是可靠的。

圖4 兩因素交互作用影響枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的響應(yīng)面分析

2.4 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得出的最佳培養(yǎng)基組成以及單因素試驗(yàn)優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件，分別繪制了以含相同質(zhì)量濃度葡萄糖和木糖的混合單糖溶液作為對(duì)照碳源培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線(圖5a)和以楊木酶水解液作為碳源培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線(圖5b)。在0～3 h為枯草芽孢桿菌的遲緩期，3～24 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h時(shí)枯草芽孢桿菌進(jìn)入穩(wěn)定期。隨著枯草芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)基中的葡萄糖被枯草芽孢桿菌大量消耗用于生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)培養(yǎng)體系中的木糖含量也緩慢減少。培養(yǎng)24 h后，即枯草芽孢桿菌進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)培養(yǎng)基中的糖濃度都趨于0 g/L。另外楊木酶水解液中還含有纖維二糖，由圖5b可以看出枯草芽孢桿菌從第22 h開始利用纖維二糖，這說明枯草芽孢桿菌對(duì)酶水解液中糖的利用順序?yàn)槠咸烟恰⒛咎?、纖維二糖。對(duì)比圖5a與圖5b可以看出，枯草芽孢桿菌在單糖溶液配制的培養(yǎng)基中，消耗碳源的速度更快，生長(zhǎng)情況也較好。并且以相同質(zhì)量濃度的單糖溶液作為碳源培養(yǎng)枯草芽孢桿菌所得到的活菌數(shù)略高，可達(dá)到6.65×108CFU/mL，而以楊木酶水解液作為碳源時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到6.46×108CFU/mL。對(duì)比兩種發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵前后的pH可以發(fā)現(xiàn)，含酶水解液的培養(yǎng)基pH僅下降了0.84，而含單糖溶液的培養(yǎng)基pH發(fā)酵后下降了1.61，這是因?yàn)槊杆庖褐泻袡幟仕徕c，調(diào)節(jié)了培養(yǎng)體系中的離子平衡。

a)以單糖溶液(葡萄糖∶木糖=5∶1，質(zhì)量濃度比)為碳源；b)以楊木酶水解液為碳源。

由枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線可以看出，枯草芽孢桿菌能較好地利用酶水解液中的葡萄糖和木糖。同時(shí)也說明枯草芽孢桿菌以楊木酶水解液為碳源時(shí)，只需添加少量氮源以及無機(jī)鹽即能生長(zhǎng)良好。相較于傳統(tǒng)微生物發(fā)酵所用的葡萄糖、蔗糖等培養(yǎng)基組分，楊木屑不屬于糧食作物，且廉價(jià)易得，以楊木屑發(fā)酵所得的酶水解液作為碳源培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，拓寬了楊木廢棄物再利用的途徑。但與已有研究進(jìn)行對(duì)比，Yánez-Mendizábal等[15]利用大豆粉與糖蜜發(fā)酵枯草芽孢桿菌CPA-8，最大活菌數(shù)可達(dá)3.00×109CFU/mL，Zhang等[16]以玉米粉和黃豆粉培養(yǎng)芽孢桿菌Z-14，活菌數(shù)可達(dá)到1.85×109CFU/mL，活菌數(shù)略低，可能是因?yàn)闂钅久杆庖撼煞謴?fù)雜，其中所含的乙酸、乙酰丙酸等影響了枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)。因此后續(xù)可通過脫毒、提高供氧等措施進(jìn)一步提高菌體濃度。

3 結(jié) 論

1)以楊木酶水解液為碳源培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，采用單因素試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。最終確定，當(dāng)枯草芽孢桿菌以楊木酶水解液為碳源時(shí)，最適的氮源、無機(jī)鹽、微量元素分別為魚粉蛋白胨、K2HPO4、MgSO4。最佳培養(yǎng)條件為溫度35 ℃、pH 7.0、轉(zhuǎn)速190 r/min、初始接種量2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、裝液量10 mL(相對(duì)于50 mL)。

2)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定了3種最重要培養(yǎng)基組分的最佳濃度為：3.20%(體積分?jǐn)?shù))楊木酶水解液、2.30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))魚粉蛋白胨、0.06%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))K2HPO4。

3)在最優(yōu)條件下對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，活菌數(shù)最終可達(dá)到6.46×108CFU/mL，比優(yōu)化前的2.64×108CFU/mL有顯著提高，發(fā)酵結(jié)束后楊木水解液中的單糖消耗率可達(dá)98.7%。