彭巍，黃榮，舒適，徐尚榮,張君

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科院，西寧 810016)

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原農(nóng)牧民生產(chǎn)生活的主要生產(chǎn)資料，是農(nóng)牧民必須的肉、乳、絨的主要來(lái)源。牦牛群主要分布在海拔3000m～6000m的低溫缺氧地區(qū)，惡劣的自然環(huán)境條件為牦牛的生長(zhǎng)和繁殖帶來(lái)了很多不利因素，目前主要運(yùn)用體外成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精、體細(xì)胞核移植等胚胎生物技術(shù)來(lái)改善繁殖率。在正常的體內(nèi)發(fā)育過(guò)程中，卵母細(xì)胞處于缺氧環(huán)境中，卵泡液中含有自由基清除劑和抗氧化酶，保護(hù)卵母細(xì)胞免受氧化損傷[1，2]，但體外培養(yǎng)過(guò)程中，卵母細(xì)胞、精子和胚胎暴露在高氧環(huán)境下[3]，輸卵管和子宮內(nèi)環(huán)境保護(hù)的缺失降低了抗氧化劑的產(chǎn)生，并導(dǎo)致氧化還原失衡[4]。因此，為了提供體外或體內(nèi)胚胎發(fā)育更好的條件，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡是很重要的[5]。

褪黑素(Melatonin，MT)是由哺乳動(dòng)物松果體合成并分泌的一種吲哚類(lèi)激素，松果腺以外的組織中都可產(chǎn)生，包括卵巢、睪丸、子宮、胎盤(pán)、皮膚、骨髓、腸道和晶狀體。褪黑激素是一種多功能分子，參與生理過(guò)程，如晝夜節(jié)律、生殖、清除自由基、抗炎癥和抗凋亡[6，7]。作為一種有效的自由基清除劑和廣譜抗氧化劑，褪黑素及其代謝物可直接清除ROS并減少細(xì)胞氧化損傷[8]。最近的研究表明，牛[9]和豬[10]的卵泡液中存在褪黑激素，在卵母細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)充褪黑激素可以提高受精能力和牛、人、豬的卵母細(xì)胞發(fā)育[11，12]。然而體外成熟期間補(bǔ)充褪黑素改善卵母細(xì)胞質(zhì)量的潛在機(jī)制尚未完全明確。

該項(xiàng)研究探討不同濃度的褪黑素添加到卵母細(xì)胞體外成熟液中對(duì)體外牦牛卵母細(xì)胞成熟的影響。分析褪黑素對(duì)牦牛卵母細(xì)胞成熟后的卵裂率和囊胚率、線粒體分布、GSH水平的影響，從而進(jìn)一步闡明褪黑素對(duì)牦牛卵母細(xì)胞質(zhì)量和隨后IVF胚胎發(fā)育的影響，旨在提高牦牛IVF胚胎的發(fā)育能力，提升牦牛育種及良種推廣途徑，以加快青藏高原牦牛良種推廣力度和覆蓋面。

1 材料與方法

1.1 主要試劑配制

卵母細(xì)胞體外成熟液(IVM液)：TCM-199+25mM Hepes+10%FCS+0.2mM丙酮酸鈉+0.2U/ml FSH+1μg/ml+100U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素+0.26mM NaHCO3。G1.5/ G2.5 購(gòu)買(mǎi)于vitrolife公司，瑞典。BO工作液(Bracket and Oliphant’ s medium)：先配制Stock A和Stock B。Stock A配制方法，稱(chēng)取NaCl 6.55g，KCl 0.3g，NaH2PO4·H2O 0.113g，CaCl2·2H2O 0.33g，MgCl2·6H2O 0.106g，加入去離子水，定容至100mL。Stock B配制方法，稱(chēng)取NaHCO3 1.3g，加入去離子水，定容至100mL。取Stock A10mL，Stock B 23.87mL，Na-pyruvate 13.75mg，Gentamicin stock 100μL，Glucose 250mg，加入去離子水，定容至100mL，過(guò)濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。制作精子微滴的BO液為含6mg/mL BSA和4.5mg/mL Theophylline的BO工作液。

1.2 牦牛卵母細(xì)胞收集和體外成熟

牦牛卵巢采集自西寧市裕泰屠宰場(chǎng)。離體的卵巢迅速保存于16 °C～25 °C的含有青霉素、鏈霉素生理鹽溶液中，放置保溫桶內(nèi)并于4h內(nèi)帶回試驗(yàn)室；使用12號(hào)10mL注射器從直徑3mm～8mm的竇卵泡腔中吸取卵泡液，并在體視顯微鏡下將胞質(zhì)完整均勻、具有完整卵丘細(xì)胞的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-Oocyte Complex，COCs)檢出。將COCs在成熟液中清洗后，移入含有不同濃度的褪黑素(0、10-7、10-9和10-11M)的4mL卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，在38.5℃，5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。24h后統(tǒng)計(jì)第一極體排出率，卵母細(xì)胞的成熟率計(jì)算以第一極體排出的比率作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 牦牛卵母細(xì)胞的體外受精和體外胚胎培養(yǎng)

牦牛卵母細(xì)胞在體外成熟24h后，使用移液槍對(duì)卵母細(xì)胞輕微吹打，去除其周?chē)念w粒細(xì)胞，選取胞質(zhì)均勻且排出第一極體的卵母細(xì)胞移入提前12h平衡的BO液微滴中，并用石蠟油覆蓋，每滴20～25個(gè)卵母細(xì)胞。38℃～42℃的溫水中迅速解凍精子，用自制精子針迅速將精液移入含2mLBO液的圓管底部，45度傾斜精子上浮1h，完成精子獲能。吸取液面部分精液，1500 r/min離心5min 后，棄上清，剩余液體與精子混勻后加入到上述含有成熟卵母細(xì)胞的微滴中；受精24h后，在含有0.1%牛睪丸透明質(zhì)酸酶的PBS中剝離卵丘細(xì)胞和多余的精子，然后在含有5% CO2的95%濕潤(rùn)空氣中于38.5℃下在G1.5培養(yǎng)液中培養(yǎng)；3d后換液，轉(zhuǎn)入G2.5液中繼續(xù)培養(yǎng)， 培養(yǎng)至7d收集囊胚，并統(tǒng)計(jì)卵裂率、桑椹胚率以及囊胚率。所采用的精液取自青海省家畜改良中心，精液為含野牦牛1/2血的大通牦牛凍精。

1.4 牦牛卵母細(xì)胞內(nèi)GSH的測(cè)定

收集體外成熟24h后的對(duì)照組和褪黑素(10-9M)組的卵母細(xì)胞，挑出胞質(zhì)均勻且有第一極體的卵母細(xì)胞。ThiolTracker TM Violet(T10096，Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，USA)用于分析牦牛卵母細(xì)胞還原型GSH的水平，對(duì)牦牛成熟卵母細(xì)胞操作方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。使用熒光顯微鏡(Nikon，Tokyo，Japan)捕獲卵母細(xì)胞，使用Image-Pro Plus軟件分析GSH的熒光強(qiáng)度。

1.5 牦牛卵母細(xì)胞內(nèi)DNA 損傷的測(cè)定

將體外成熟的牦牛卵母細(xì)胞在PBS-PVA溶液中沖洗3次，5min/次。將卵母細(xì)胞至免疫染色固定液(Beyotime)中固定，室溫下孵育1h；固定后卵母細(xì)胞再移至含0.2% Triton X-100的PBS溶液中透化，孵育30 min；通透后的卵母細(xì)胞在PBS-PVA溶液中吹洗3次，5min/次；沖洗后的卵母細(xì)胞移至免疫染色封閉液(Beyotime)中封閉，4℃條件下孵育12h。封閉后的牦牛卵母細(xì)胞與DNA損傷抗體(1：500；Abcam，UK)孵育；洗滌3次后，將卵母細(xì)胞與二抗室溫避光孵育2h。卵母細(xì)胞用用熒光顯微鏡捕獲，使用Image-Pro Plus軟件分析DNA損傷水平。

1.6 牦牛卵母細(xì)胞凋亡水平的測(cè)定

Annexin V-FITC凋亡分析試劑盒(Beyotime)用于評(píng)估卵母細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸外化的早期凋亡卵母細(xì)胞。將195μL膜聯(lián)蛋白V-FITC結(jié)合溶液，5μL膜聯(lián)蛋白V-FITC和10μL碘化丙啶輕輕混合。將樣品在室溫下在混合物中處理15min。在清洗溶液中洗滌三次后，使用高速共聚焦顯微鏡測(cè)量熒光信號(hào)。

1.7 牦牛卵母細(xì)胞線粒體膜電位的測(cè)定

用Mito-Tracker Green(Beyotime)測(cè)定牦牛在不同褪黑素濃度(0，10-9M)體外成熟后卵母細(xì)胞中線粒體的活性。MII卵母細(xì)胞經(jīng)兩次洗滌后，將MII期的卵母細(xì)胞與200nM 預(yù)溫育的Mito-Tracker Green染色液，在37℃條件下一起孵育30min。除去染色液，滴加37℃條件下預(yù)溫育M199培養(yǎng)液。將卵母細(xì)胞在新鮮的M199培養(yǎng)液中在38.5℃下洗滌15min。置于蓋玻片上，通過(guò)熒光顯微鏡捕獲卵母細(xì)胞圖像，采用Image-Pro Plus軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

采用單因素方差(One-ANOVA)和鄧肯多重比較試驗(yàn)(Duncan multiple comparison test)分析，并采用SPSS 21.0軟件(SPSS Inc.)進(jìn)行分析。相關(guān)試驗(yàn)至少重復(fù)三次，測(cè)定數(shù)據(jù)代表所有重復(fù)試驗(yàn)的平均值。采用t檢驗(yàn)方法對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的進(jìn)行了驗(yàn)證分析，P<0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟液中添加不同濃度的褪黑素對(duì)牦牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響

各組卵母細(xì)胞體外成熟率見(jiàn)表1：與對(duì)照組與IVM+10-7組相比，IVM+10-9組(10-9M)和IVM+10-11組(10-11M)卵母細(xì)胞的成熟率顯著提高，差異顯著(P<0.05)；當(dāng)濃度為10-9M時(shí)，卵母細(xì)胞的極體排出率達(dá)到最高。

2.2 成熟液中添加不同濃度褪黑素對(duì)牦牛卵母細(xì)胞后續(xù)胚胎發(fā)育能力的影響

各濃度處理組中卵裂率和囊胚率見(jiàn)表1：與對(duì)照組相比，IVM+10-9組和IVM+10-11組卵裂率和囊胚形成率顯著升高，差異顯著(P<0.05)；對(duì)照組與IVM+10-7組相比，卵母細(xì)胞的卵裂率及囊胚率不顯著(P>0.05)，研究結(jié)果表明，卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加10-9M濃度的褪黑素，有助于提高卵母細(xì)胞的成熟率、胚胎卵裂率及囊胚率。

表1 體外成熟中添加不同濃度的褪黑激素對(duì)體外胚胎發(fā)育和質(zhì)量的影響

2.3 褪黑素對(duì)牦牛卵母細(xì)胞體外成熟后氧化應(yīng)激的影響

體外成熟后卵母細(xì)胞中GSH的水平如圖1所示，與對(duì)照組對(duì)比，補(bǔ)充褪黑素組(10-9M)顯著提高牦牛卵母細(xì)胞中GSH的相對(duì)水平(P<0.05)；體外成熟后卵母細(xì)胞中DNA損傷程度如圖2所示，與對(duì)照組對(duì)比，補(bǔ)充褪黑素組(10-9M)顯著減少牦牛卵母細(xì)胞中DNA損傷程度(P<0.05)?？偟膩?lái)說(shuō)，添加10-9M濃度的褪黑素有助于提高卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中GSH的水平，降低DNA損傷程度，從而降低氧化應(yīng)激水平，提高卵母細(xì)胞的體外成熟率。

2.4 褪黑素抑制牦牛卵母細(xì)胞早期凋亡

如圖3所示，在對(duì)照組中，IVM卵母細(xì)胞中清楚地檢測(cè)到熒光信號(hào)，但在補(bǔ)充褪黑素組(10-9M)中很少觀察到熒光信號(hào)。結(jié)果表明，褪黑素顯著降低體外成熟過(guò)程中牦牛卵母細(xì)胞的早期凋亡水平(P<0.05)，提高卵母細(xì)胞體外成熟率。

2.5 褪黑素處理對(duì)牦牛卵母細(xì)胞IVM過(guò)程中線粒體恢復(fù)的影響

如圖4所示，過(guò)量的ROS產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致線粒體蛋白質(zhì)和DNA的損傷。試驗(yàn)研究了IVM牦牛卵母細(xì)胞中的線粒體活性和分布。熒光強(qiáng)度的定量顯示，與對(duì)照組卵母細(xì)胞相比，褪黑素處理的卵母細(xì)胞中線粒體的信號(hào)顯著增加，褪黑素組線粒體正常分布率高于對(duì)照組(P<0.05)。研究結(jié)果表明，10-9M濃度的褪黑素降低卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中線粒體蛋白質(zhì)和DNA的損傷程度。

3 討論

在卵母細(xì)胞體外成熟的過(guò)程中，由于培養(yǎng)環(huán)境中氧含量存在差異，體外成熟的卵母細(xì)胞會(huì)承受更高的氧壓，從而導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過(guò)量。當(dāng) ROS 的產(chǎn)生速度超過(guò)其清除速度時(shí)會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，破壞生物大分子的正常結(jié)構(gòu)，從而對(duì)體外成熟效率產(chǎn)生影響[13]。褪黑素作為一種有效的抗氧化劑和自由基清除劑，能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，清除自由基，改善卵母細(xì)胞的體外成熟與胚胎的體外發(fā)育歷程[14]，進(jìn)而保護(hù)合子和胚胎。近年來(lái)，褪黑素在提高體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育方面得到了越來(lái)越多的證實(shí)，但其對(duì)牦牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響機(jī)制還尚未明確。

本研究測(cè)定了在不同培養(yǎng)條件下添加不同濃度的褪黑素對(duì)牦牛體外成熟過(guò)程是否會(huì)改善卵母細(xì)胞的質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，添加10-9M褪黑素的體外培養(yǎng)液可顯著提高牦牛卵母細(xì)胞的體外成熟率，進(jìn)而改善后續(xù)的胚胎發(fā)育能力。除此之外，與對(duì)照組相比，當(dāng)添加10-7M濃度的褪黑素時(shí)，卵母細(xì)胞的體外成熟并沒(méi)有受到顯著的影響。盡管褪黑素在體外卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育方面有所改善，但褪黑素的有益作用似乎在綿羊[15]、兔[16]、豬[17]和小鼠[18]等動(dòng)物上具有特異性和濃度依賴(lài)性，特別是在抗氧化保護(hù)[19]，增強(qiáng)免疫功能，睡眠和繁殖等方面[20]。

褪黑素作為抗氧化劑和自由基清除劑，通過(guò)清除自由基，直接消除ROS，通過(guò)該系統(tǒng)起作用，增加編碼抗氧化酶如SOD和GSH的基因的表達(dá)，并且抑制促氧化酶的作用以減少細(xì)胞氧化應(yīng)激[21，22]。已有研究表明，在牛的體外成熟培養(yǎng)基中添加一定濃度的褪黑素，可以促進(jìn)細(xì)胞器的正常分布、GSH 和ATP含量增加、抗氧化基因表達(dá)水平的提高，進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞受精和發(fā)育能力[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)液中添10-9M濃度褪黑素組的成熟卵母細(xì)胞內(nèi)GSH的含量更高，凋亡率降低，表明添加10-9M濃度的褪黑素在所述條件下的卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程直接影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量，進(jìn)而提高牦牛體外受精胚胎的囊胚率。

線粒體是正常卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵，并且是卵母細(xì)胞和早期胚胎中ATP生產(chǎn)的主要來(lái)源[23]。線粒體功能障礙與染色體分離障礙、受精失敗、卵母細(xì)胞破碎和線粒體引起的細(xì)胞凋亡的減少密切相關(guān)[24]。有研究報(bào)道，卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中過(guò)量產(chǎn)生的ROS會(huì)導(dǎo)致線粒體蛋白質(zhì)和DNA的損傷[25，26]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中用褪黑素處理可以有效緩解氧化應(yīng)激，并且恢復(fù)線粒體的活性。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素以10-9M的濃度添加到成熟液中可有效提高牦牛卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量以及體外胚胎培養(yǎng)過(guò)程中囊胚的產(chǎn)生，證實(shí)了褪黑素在卵母細(xì)胞體外成熟階段對(duì)減少細(xì)胞氧化應(yīng)激和保護(hù)細(xì)胞免受凋亡引起的細(xì)胞死亡中起重要作用。這些數(shù)據(jù)為胚胎的冷凍保存，以及在冷凍保存的胚胎解凍后將褪黑素添加到培養(yǎng)液中的研究提供了理論依據(jù)。