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        蘇淮仔豬腹瀉細(xì)菌性病原的分離鑒定與耐藥性分析

        2021-07-26 02:06:06王禮偉周剛柏傳茂楊生明郭永久唐炎汪國蓮
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年11期
        關(guān)鍵詞:大腸桿菌腹瀉沙門氏菌

        王禮偉 周剛 柏傳茂 楊生明 郭永久 唐炎 汪國蓮

        摘要:為了解淮安地區(qū)蘇淮豬仔豬出現(xiàn)細(xì)菌性腹瀉的病因并提供治療方案,采集腹瀉仔豬的肛拭子樣品共95份,對采集的樣品進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定、動物致病性鑒定及耐藥性分析。結(jié)果顯示,本次試驗共分離鑒定到78株大腸桿菌,92株沙門氏菌;動物致病性試驗顯示,大腸桿菌致小鼠死亡率為65.38%,沙門氏菌致小鼠死亡率為95.84%;藥敏試驗結(jié)果顯示,大腸桿菌耐藥率高于沙門氏菌,且均對青霉素類和林可霉素類高度耐藥,對氟喹諾酮類耐藥率最低。多重耐藥結(jié)果顯示,所有分離菌株均為多重耐藥菌株,大腸桿菌主要表現(xiàn)8~10耐,沙門氏菌主要表現(xiàn)在6~8耐。

        關(guān)鍵詞:仔豬;腹瀉;大腸桿菌;沙門氏菌;耐藥性

        中圖分類號: S855.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號:1002-1302(2021)11-0127-05

        收稿日期:2020-09-08

        基金項目:蘇北科技專項科技幫扶項目(編號:SZ-HA2019032);淮安市農(nóng)科院科研發(fā)展基金項目(編號:HNY202025)。

        作者簡介:王禮偉(1989—),男,江蘇淮安人,碩士,助理研究員,主要從事動物傳染病防控及農(nóng)業(yè)科技服務(wù)。E-mail:wlw58@sian.cn。

        通信作者:汪國蓮,碩士,研究員,主要從事農(nóng)業(yè)科技服務(wù)。E-mail:2567327519@qq.com。

        仔豬腹瀉伴有不同程度的腹瀉、脫水、自身免疫力下降,是仔豬死亡和繼發(fā)其他疾病的重要原因,影響?zhàn)B豬生產(chǎn)效率和盈利情況,給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失,主要體現(xiàn)在發(fā)病率高、降低日增質(zhì)量、延長出欄時間、飼料轉(zhuǎn)化率下降、飼料成本增加等 [1-2]。仔豬腹瀉是病原體、腸道環(huán)境和管理之間相互作用的結(jié)果,其中病原體的感染是導(dǎo)致仔豬發(fā)生腹瀉的主要原因,根據(jù)病原體的不同,細(xì)菌引發(fā)的可分為埃希氏大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等;病毒引發(fā)的如流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、非洲豬瘟病毒等;寄生蟲引發(fā)的如剛地弓形蟲、艾美耳球蟲等 [3]。鑒于細(xì)菌性腹瀉在規(guī)模化養(yǎng)豬場患病中的普遍性和重要性,為進(jìn)一步了解淮安地區(qū)蘇淮仔豬腹瀉細(xì)菌性病原流行病學(xué)和抗生素耐藥情況,本試驗采集腹瀉仔豬的肛拭子樣本進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定、致病力試驗及耐藥性分析,旨在為疾病防控、減抗禁抗、食品安全提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 樣品來源 2020年1月至4月采集來自淮安地區(qū)3個蘇淮豬養(yǎng)殖場出現(xiàn)腹瀉癥狀的仔豬肛拭子95份。發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)為精神不振、食欲不佳、被毛聳亂、拉黃白色稀軟或水樣糞便等。以滅菌棉拭子采集發(fā)病仔豬肛拭樣品置于滅菌EP中,保存于-20 ℃冰箱待用。

        1.1.2 試驗材料 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、MH液體培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司;無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基的制備參考文獻(xiàn) [4];獸醫(yī)臨床常用藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司,包括紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、頭孢唑啉、青霉素、利福平、氧氟沙星。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)菌的富集、分離與純化 將采集的肛拭子接種于5 mL MH液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。然后用接種環(huán)按照常規(guī)細(xì)菌分離方法分別接種(“Z”字形)于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)18~24 h。挑取典型單個菌落接種于5 mL MH液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h,劃線接種到無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)18~24 h,觀察菌株溶血情況,同時接種到MH液體培養(yǎng)基中備用。

        1.2.2 革蘭氏染色鏡檢 將無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基中單個菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、顯微鏡油鏡下觀察菌體的形狀及染色特性。

        1.2.3 細(xì)菌生化鑒定試驗 將待檢菌落按照伯杰氏生化鑒定手冊進(jìn)行生化鑒定。

        1.2.4 動物致病性試驗 將小鼠分成A、B、C 3組。A、B組小鼠分別依據(jù)體質(zhì)量按0.02 mL/g腹腔注射經(jīng)鑒定純化的大腸埃希氏菌和沙門氏菌菌液,每種菌注射2只,C組小鼠分別依據(jù)體質(zhì)量按0.02 mL/g 腹腔注射無菌生理鹽水。接種后觀察并剖檢發(fā)病和死亡的小鼠,統(tǒng)計致病率。

        1.2.5 藥敏試驗 吸取致死小鼠菌液100 μL置于MH瓊脂培養(yǎng)基上,涂布涂勻,3~5 min后,待菌液干燥后,均勻貼上4片不同的藥敏紙片(d=6 mm),參照文獻(xiàn) [4]的方法,放置恒溫箱培養(yǎng)18~24 h后測量抑菌環(huán)的直徑,根據(jù)抑菌圈的大小,根據(jù)《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》 [5]判定結(jié)果。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

        對腹瀉仔豬肛拭子樣本進(jìn)行選擇分離鑒定,由圖1~圖6可知,疑似大腸桿菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上長出粉紅色、光滑、濕潤、邊緣整齊、直徑1.0~2.5 mm的菌落,其中12株在血瓊脂培養(yǎng)基上生成透明溶血環(huán);挑取典型單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢,疑似大腸桿菌為兩端鈍圓、散在或成對、紅色、革蘭氏陰性短桿菌。疑似沙門氏菌在SS瓊脂上長出乳白色、圓形、邊緣整齊、光滑、表面有隆起、中間有針狀黑點的小菌落,其中12株在血瓊脂培養(yǎng)基上生成透明溶血環(huán);挑取典型單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢,疑似沙門氏菌為無莢膜、無芽孢、散在的革蘭氏陰性直桿菌。

        2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

        分離的疑似大腸桿菌最終有78株能夠發(fā)酵乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇,吲哚反應(yīng)陽性,MR反應(yīng)陽性,V.P.反應(yīng)陰性,檸檬酸鹽反應(yīng)陰性,三糖鐵斜面底部產(chǎn)酸及產(chǎn)氣、不生成硫化氫,符合大腸桿菌的生化特性;分離的疑似沙門氏菌最終有92株發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇,吲哚反應(yīng)陰性,MR反應(yīng)陽性,V.P.反應(yīng)陰性,檸檬酸鹽反應(yīng)陽性,三糖鐵斜面產(chǎn)堿、底部產(chǎn)酸及產(chǎn)氣產(chǎn)硫化氫,符合沙門氏菌的生化特性。最終,分離鑒定得到78株大腸桿菌,分離率為82.10%(78/95);分離到92株沙門氏菌,分離率為96.84%(92/95)。

        2.3 細(xì)菌致病性試驗結(jié)果

        將分離鑒定的78株大腸桿菌菌液腹腔注射小鼠24 h后,小鼠被毛粗亂、喜臥少動、精神沉郁、厭食、排松軟糞便等癥狀;48 h后開始死亡,剖檢發(fā)現(xiàn)腹腔充滿黏性黃色滲出物,肝臟、腎臟、脾臟腫大,腸道膨脹充氣,劃線培養(yǎng)后均能分離鑒定到大腸桿菌,大腸桿菌致小鼠死亡率為65.38%(51/78,溶血性菌株注射小鼠全部死亡)。將分離鑒定的92株沙門氏菌菌液腹腔注射小鼠24 h后,小鼠精神萎靡、戰(zhàn)栗、被毛蓬松,少數(shù)出現(xiàn)便血、水樣糞便等癥狀;48 h后開始死亡,剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠腸道充血、腹腔積水、肝臟和脾臟均有壞死點,劃線培養(yǎng)后均能分離到沙門氏菌,沙門氏菌致小鼠死亡率為94.57%(87/92,溶血性菌株注射小鼠全部死亡);對照組小鼠均正常。

        2.4 細(xì)菌耐藥性試驗結(jié)果

        對致死小鼠的51株大腸桿菌和87株沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗,由表1可知,分離鑒定的51株大腸桿菌對林可霉素(100.00%)、青霉素(98.04%)、克林霉素(96.08%)、紅霉素(94.12%)、阿奇霉素(90.20%)高度耐藥,其余抗菌藥物的耐藥率分別為:利福平(84.31%)、鏈霉素(82.35%)、頭孢唑啉(74.51%)等;分離鑒定的87株沙門氏菌對青霉素(94.25%)、林可霉素(90.80%)、克林霉素(87.36%)、多西環(huán)素(82.76%)高度耐藥,其余抗菌藥物的耐藥率分別為:紅霉素(59.77%)、阿奇霉素(55.17%)等。

        2.5 細(xì)菌多重耐藥結(jié)果

        由圖7可知,分離菌株多重耐藥結(jié)果,51株大腸桿菌中分離株中8~10重耐藥的占比最大,累計比例為72.55%(37/51),其中,最高為9重,耐藥比例為29.41%(15/51),1~4重耐藥菌株數(shù)為0%(0/51)。87株沙門氏菌分離株中6~8重耐藥的占比最大,累計比例為68.96%(60/87),其中,最高為7重,耐藥比例為28.74%(25/87),1~3重和11~12重耐藥的菌株數(shù)為0%(0/87)。

        3 討論

        根據(jù)國家統(tǒng)計局發(fā)布數(shù)據(jù),受非洲豬瘟疫情的影響,2019年我國生豬存欄31 041萬頭,同比下跌27.5%;生豬出欄54 419萬頭,同比下跌21.6%,而仔豬作為育肥豬的種苗,提高仔豬存活率至關(guān)重要 [6]。腹瀉是豬場常見傳染病之一,然而腹瀉的流行病學(xué)原因卻十分復(fù)雜,自身生理因素、飼料營養(yǎng)缺乏、環(huán)境應(yīng)激和飼養(yǎng)管理不當(dāng)及其他病原體感染等因素,均可能會導(dǎo)致仔豬腸道生態(tài)內(nèi)環(huán)境改變,使得變形菌門中的大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等條件致病菌在內(nèi)的多種菌群失調(diào),最終導(dǎo)致仔豬細(xì)菌性腹瀉等癥狀 [7-8],Hermann-Bank等發(fā)現(xiàn),腸桿菌屬、腸球菌屬增加了新生仔豬腹瀉的風(fēng)險且與腸道微生物變異密切相關(guān),且使用疫苗接種或抗生素治療效果有限 [9]。本試驗對當(dāng)?shù)靥K淮豬仔豬腹瀉的細(xì)菌性病原進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定,95份樣本共分離出170 株病菌,大腸桿菌陽性率82.10%(78/95),沙門氏菌陽性率96.84%(92/95),混合感染率為73.68%(70/95)。黃美州等對甘肅地區(qū)新生仔豬腹瀉細(xì)菌性病原調(diào)查后發(fā)現(xiàn)大腸桿菌與沙門氏菌混合感染最終導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重腹瀉 [10];李晨等從貴州地區(qū)7個養(yǎng)殖場128份仔豬腸道樣本中分離到大腸桿菌的陽性率為60.94%(78/128),沙門氏菌的陽性率為16.41%(21/128) [11];李淑紅等在湘西北地區(qū)豬場檢測到沙門氏菌分離率為55.56%(10/18),大腸桿菌分離率為44.44%(8/18) [12];曲歌等在吉林地區(qū)21家規(guī)?;i場117份仔豬腹瀉糞便樣本中進(jìn)行PCR檢測,分離出大腸桿菌104份,其中49份具有致病性,占樣本總數(shù)的42.88%;分離出沙門氏菌19份,其中15份具有致病性,占樣本總數(shù)的12.82% [13],這進(jìn)一步說明大腸桿菌在感染仔豬的普遍性,而沙門氏菌分離率差異性可能是由于地域差異、動物健康程度及養(yǎng)豬場用藥情況不同所致。

        另動物感染試驗結(jié)果顯示,大腸桿菌和沙門氏菌的致死率分別為65.38%(51/78)和94.56%(87/92),其中,溶血性菌株的致死率為100%,表明淮安地區(qū)分離菌株具有較強的毒力因子,與福建泉州地區(qū)大腸桿菌高致死率71.43%(30/42) [14]具有一致性。徐引弟等通過對致病性大腸桿菌開展藥敏紙片試驗并對24個耐藥基因進(jìn)行擴增分析,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌耐藥決定區(qū)基因發(fā)生變異是引起細(xì)菌耐藥性的主要原因,進(jìn)而從分子手段揭示了耐藥細(xì)菌株的基因型和表型具有一定關(guān)聯(lián)性,細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性的機制具有較高的復(fù)雜性 [15]。因此,對于蘇淮豬可以參考從抗腹瀉基因MUC13、FUT1進(jìn)行定向選育,利用分子育種方案從源頭上進(jìn)行腹瀉的防控 [16]。

        近年來,養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)大力開始提倡減抗禁抗行動,但在疾病的預(yù)防治療、自配飼料的使用上,依然存在抗生素的濫用問題,致使細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重 [17-18]。本研究對分離獲得的致死小鼠大腸桿菌和沙門氏菌進(jìn)行了12種抗菌藥的耐藥性分析,結(jié)果表明,大腸桿菌和沙門氏菌對林可霉素類和青霉素類高度耐藥,耐藥率均超過90%,除喹諾酮類外,其他抗菌藥均呈現(xiàn)不同程度的耐藥率。張青嫻等對分離的1株豬源產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌同樣對青霉素類、頭孢類、四環(huán)素類、喹諾酮類抗生素耐藥,而對氨基糖苷類抗生素敏感,并通過4種常見的ESBLs耐藥基因擴增分析,提出加強產(chǎn)酶耐藥菌的監(jiān)測及保守地使用現(xiàn)有抗生素的觀點 [19]。而李佳瑞等從25株耐藥大腸桿菌攜帶的主動外排基因進(jìn)行研究,acrA、acrB這2種主動外排基因和調(diào)控基因mar A和sox S的相對表達(dá)量和多重耐藥的耐藥譜數(shù)呈正相關(guān),調(diào)控基因acrR的相對表達(dá)量和多重耐藥的耐藥譜數(shù)呈負(fù)相關(guān) [20]。Xu等對我國北京等10個省份的動物、人的非典型致病性大腸桿菌(aEPEC)進(jìn)行藥敏紙片試驗,結(jié)果顯示,267株菌株中,128株(47.9%)檢出多重耐藥,40株耐藥菌株對10種以上抗菌藥物耐藥,有47株(17.6%)菌株被鑒定為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL),而從多重耐藥情況看,致死小鼠大腸桿菌和沙門氏菌多重耐藥情況嚴(yán)重,4耐及4耐以上菌株高達(dá)100% [21],這一結(jié)果與Li等 [22]、田瑞 [23]研究基本一致,其中,Li等研究發(fā)現(xiàn)高達(dá)71.25%(57/80)的沙門氏菌菌株呈現(xiàn)多種藥物耐藥,對頭孢菌素類及氨基糖苷類抗生素敏感 [22];田瑞等研究的大腸桿菌分離率為86.31%(580/672),累計產(chǎn)生23種多重耐藥型 [23]。

        4 結(jié)論

        本研究從細(xì)菌性病原的角度對致蘇淮仔豬腹瀉的病因進(jìn)行初步分析,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、沙門氏菌是主要致病菌,藥敏紙片試驗顯示2種致病菌均呈現(xiàn)4重及以上多重耐藥性,均對喹諾酮類藥物高度敏感,試驗結(jié)果可為蘇淮豬細(xì)菌性腹瀉癥的病因和臨床治療提供參考依據(jù)。

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