王禮偉 周剛 柏傳茂 楊生明 郭永久 唐炎 汪國蓮

摘要：為了解淮安地區(qū)蘇淮豬仔豬出現(xiàn)細(xì)菌性腹瀉的病因并提供治療方案，采集腹瀉仔豬的肛拭子樣品共95份，對采集的樣品進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定、動物致病性鑒定及耐藥性分析。結(jié)果顯示，本次試驗共分離鑒定到78株大腸桿菌，92株沙門氏菌;動物致病性試驗顯示，大腸桿菌致小鼠死亡率為65.38%，沙門氏菌致小鼠死亡率為95.84%;藥敏試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌耐藥率高于沙門氏菌，且均對青霉素類和林可霉素類高度耐藥，對氟喹諾酮類耐藥率最低。多重耐藥結(jié)果顯示，所有分離菌株均為多重耐藥菌株，大腸桿菌主要表現(xiàn)8～10耐，沙門氏菌主要表現(xiàn)在6～8耐。

關(guān)鍵詞：仔豬;腹瀉;大腸桿菌;沙門氏菌;耐藥性

中圖分類號： S855.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）11-0127-05

收稿日期：2020-09-08

基金項目：蘇北科技專項科技幫扶項目（編號：SZ-HA2019032）;淮安市農(nóng)科院科研發(fā)展基金項目（編號：HNY202025）。

作者簡介：王禮偉（1989—），男，江蘇淮安人，碩士，助理研究員，主要從事動物傳染病防控及農(nóng)業(yè)科技服務(wù)。E-mail：wlw58@sian.cn。

通信作者：汪國蓮，碩士，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)科技服務(wù)。E-mail：2567327519@qq.com。

仔豬腹瀉伴有不同程度的腹瀉、脫水、自身免疫力下降，是仔豬死亡和繼發(fā)其他疾病的重要原因，影響?zhàn)B豬生產(chǎn)效率和盈利情況，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，主要體現(xiàn)在發(fā)病率高、降低日增質(zhì)量、延長出欄時間、飼料轉(zhuǎn)化率下降、飼料成本增加等 [1-2]。仔豬腹瀉是病原體、腸道環(huán)境和管理之間相互作用的結(jié)果，其中病原體的感染是導(dǎo)致仔豬發(fā)生腹瀉的主要原因，根據(jù)病原體的不同，細(xì)菌引發(fā)的可分為埃希氏大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等;病毒引發(fā)的如流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、非洲豬瘟病毒等;寄生蟲引發(fā)的如剛地弓形蟲、艾美耳球蟲等 [3]。鑒于細(xì)菌性腹瀉在規(guī)模化養(yǎng)豬場患病中的普遍性和重要性，為進(jìn)一步了解淮安地區(qū)蘇淮仔豬腹瀉細(xì)菌性病原流行病學(xué)和抗生素耐藥情況，本試驗采集腹瀉仔豬的肛拭子樣本進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定、致病力試驗及耐藥性分析，旨在為疾病防控、減抗禁抗、食品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2020年1月至4月采集來自淮安地區(qū)3個蘇淮豬養(yǎng)殖場出現(xiàn)腹瀉癥狀的仔豬肛拭子95份。發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)為精神不振、食欲不佳、被毛聳亂、拉黃白色稀軟或水樣糞便等。以滅菌棉拭子采集發(fā)病仔豬肛拭樣品置于滅菌EP中，保存于-20 ℃冰箱待用。

1.1.2 試驗材料 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、MH液體培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司;無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基的制備參考文獻(xiàn) [4];獸醫(yī)臨床常用藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司，包括紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、頭孢唑啉、青霉素、利福平、氧氟沙星。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的富集、分離與純化 將采集的肛拭子接種于5 mL MH液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。然后用接種環(huán)按照常規(guī)細(xì)菌分離方法分別接種（“Z”字形）于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。挑取典型單個菌落接種于5 mL MH液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，劃線接種到無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察菌株溶血情況，同時接種到MH液體培養(yǎng)基中備用。

1.2.2 革蘭氏染色鏡檢 將無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基中單個菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、顯微鏡油鏡下觀察菌體的形狀及染色特性。

1.2.3 細(xì)菌生化鑒定試驗 將待檢菌落按照伯杰氏生化鑒定手冊進(jìn)行生化鑒定。

1.2.4 動物致病性試驗 將小鼠分成A、B、C 3組。A、B組小鼠分別依據(jù)體質(zhì)量按0.02 mL/g腹腔注射經(jīng)鑒定純化的大腸埃希氏菌和沙門氏菌菌液，每種菌注射2只，C組小鼠分別依據(jù)體質(zhì)量按0.02 mL/g 腹腔注射無菌生理鹽水。接種后觀察并剖檢發(fā)病和死亡的小鼠，統(tǒng)計致病率。

1.2.5 藥敏試驗 吸取致死小鼠菌液100 μL置于MH瓊脂培養(yǎng)基上，涂布涂勻，3～5 min后，待菌液干燥后，均勻貼上4片不同的藥敏紙片（d=6 mm），參照文獻(xiàn) [4]的方法，放置恒溫箱培養(yǎng)18～24 h后測量抑菌環(huán)的直徑，根據(jù)抑菌圈的大小，根據(jù)《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》 [5]判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

對腹瀉仔豬肛拭子樣本進(jìn)行選擇分離鑒定，由圖1～圖6可知，疑似大腸桿菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上長出粉紅色、光滑、濕潤、邊緣整齊、直徑1.0～2.5 mm的菌落，其中12株在血瓊脂培養(yǎng)基上生成透明溶血環(huán);挑取典型單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，疑似大腸桿菌為兩端鈍圓、散在或成對、紅色、革蘭氏陰性短桿菌。疑似沙門氏菌在SS瓊脂上長出乳白色、圓形、邊緣整齊、光滑、表面有隆起、中間有針狀黑點的小菌落，其中12株在血瓊脂培養(yǎng)基上生成透明溶血環(huán);挑取典型單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，疑似沙門氏菌為無莢膜、無芽孢、散在的革蘭氏陰性直桿菌。

2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

分離的疑似大腸桿菌最終有78株能夠發(fā)酵乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇，吲哚反應(yīng)陽性，MR反應(yīng)陽性，V.P.反應(yīng)陰性，檸檬酸鹽反應(yīng)陰性，三糖鐵斜面底部產(chǎn)酸及產(chǎn)氣、不生成硫化氫，符合大腸桿菌的生化特性;分離的疑似沙門氏菌最終有92株發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇，吲哚反應(yīng)陰性，MR反應(yīng)陽性，V.P.反應(yīng)陰性，檸檬酸鹽反應(yīng)陽性，三糖鐵斜面產(chǎn)堿、底部產(chǎn)酸及產(chǎn)氣產(chǎn)硫化氫，符合沙門氏菌的生化特性。最終，分離鑒定得到78株大腸桿菌，分離率為82.10%（78/95）;分離到92株沙門氏菌，分離率為96.84%（92/95）。

2.3 細(xì)菌致病性試驗結(jié)果

將分離鑒定的78株大腸桿菌菌液腹腔注射小鼠24 h后，小鼠被毛粗亂、喜臥少動、精神沉郁、厭食、排松軟糞便等癥狀;48 h后開始死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)腹腔充滿黏性黃色滲出物，肝臟、腎臟、脾臟腫大，腸道膨脹充氣，劃線培養(yǎng)后均能分離鑒定到大腸桿菌，大腸桿菌致小鼠死亡率為65.38%（51/78，溶血性菌株注射小鼠全部死亡）。將分離鑒定的92株沙門氏菌菌液腹腔注射小鼠24 h后，小鼠精神萎靡、戰(zhàn)栗、被毛蓬松，少數(shù)出現(xiàn)便血、水樣糞便等癥狀;48 h后開始死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠腸道充血、腹腔積水、肝臟和脾臟均有壞死點，劃線培養(yǎng)后均能分離到沙門氏菌，沙門氏菌致小鼠死亡率為94.57%（87/92，溶血性菌株注射小鼠全部死亡）;對照組小鼠均正常。

2.4 細(xì)菌耐藥性試驗結(jié)果

對致死小鼠的51株大腸桿菌和87株沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗，由表1可知，分離鑒定的51株大腸桿菌對林可霉素（100.00%）、青霉素（98.04%）、克林霉素（96.08%）、紅霉素（94.12%）、阿奇霉素（90.20%）高度耐藥，其余抗菌藥物的耐藥率分別為：利福平（84.31%）、鏈霉素（82.35%）、頭孢唑啉（74.51%）等;分離鑒定的87株沙門氏菌對青霉素（94.25%）、林可霉素（90.80%）、克林霉素（87.36%）、多西環(huán)素（82.76%）高度耐藥，其余抗菌藥物的耐藥率分別為：紅霉素（59.77%）、阿奇霉素（55.17%）等。

2.5 細(xì)菌多重耐藥結(jié)果

由圖7可知，分離菌株多重耐藥結(jié)果，51株大腸桿菌中分離株中8～10重耐藥的占比最大，累計比例為72.55%（37/51），其中，最高為9重，耐藥比例為29.41%（15/51），1～4重耐藥菌株數(shù)為0%（0/51）。87株沙門氏菌分離株中6～8重耐藥的占比最大，累計比例為68.96%（60/87），其中，最高為7重，耐藥比例為28.74%（25/87），1～3重和11～12重耐藥的菌株數(shù)為0%（0/87）。

3 討論

根據(jù)國家統(tǒng)計局發(fā)布數(shù)據(jù)，受非洲豬瘟疫情的影響，2019年我國生豬存欄31 041萬頭，同比下跌27.5%;生豬出欄54 419萬頭，同比下跌21.6%，而仔豬作為育肥豬的種苗，提高仔豬存活率至關(guān)重要 [6]。腹瀉是豬場常見傳染病之一，然而腹瀉的流行病學(xué)原因卻十分復(fù)雜，自身生理因素、飼料營養(yǎng)缺乏、環(huán)境應(yīng)激和飼養(yǎng)管理不當(dāng)及其他病原體感染等因素，均可能會導(dǎo)致仔豬腸道生態(tài)內(nèi)環(huán)境改變，使得變形菌門中的大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等條件致病菌在內(nèi)的多種菌群失調(diào)，最終導(dǎo)致仔豬細(xì)菌性腹瀉等癥狀 [7-8]，Hermann-Bank等發(fā)現(xiàn)，腸桿菌屬、腸球菌屬增加了新生仔豬腹瀉的風(fēng)險且與腸道微生物變異密切相關(guān)，且使用疫苗接種或抗生素治療效果有限 [9]。本試驗對當(dāng)?shù)靥K淮豬仔豬腹瀉的細(xì)菌性病原進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定，95份樣本共分離出170 株病菌，大腸桿菌陽性率82.10%（78/95），沙門氏菌陽性率96.84%（92/95），混合感染率為73.68%（70/95）。黃美州等對甘肅地區(qū)新生仔豬腹瀉細(xì)菌性病原調(diào)查后發(fā)現(xiàn)大腸桿菌與沙門氏菌混合感染最終導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重腹瀉 [10];李晨等從貴州地區(qū)7個養(yǎng)殖場128份仔豬腸道樣本中分離到大腸桿菌的陽性率為60.94%（78/128），沙門氏菌的陽性率為16.41%（21/128） [11];李淑紅等在湘西北地區(qū)豬場檢測到沙門氏菌分離率為55.56%（10/18），大腸桿菌分離率為44.44%（8/18） [12];曲歌等在吉林地區(qū)21家規(guī)?；i場117份仔豬腹瀉糞便樣本中進(jìn)行PCR檢測，分離出大腸桿菌104份，其中49份具有致病性，占樣本總數(shù)的42.88%;分離出沙門氏菌19份，其中15份具有致病性，占樣本總數(shù)的12.82% [13]，這進(jìn)一步說明大腸桿菌在感染仔豬的普遍性，而沙門氏菌分離率差異性可能是由于地域差異、動物健康程度及養(yǎng)豬場用藥情況不同所致。

另動物感染試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌和沙門氏菌的致死率分別為65.38%（51/78）和94.56%（87/92），其中，溶血性菌株的致死率為100%，表明淮安地區(qū)分離菌株具有較強的毒力因子，與福建泉州地區(qū)大腸桿菌高致死率71.43%（30/42） [14]具有一致性。徐引弟等通過對致病性大腸桿菌開展藥敏紙片試驗并對24個耐藥基因進(jìn)行擴增分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌耐藥決定區(qū)基因發(fā)生變異是引起細(xì)菌耐藥性的主要原因，進(jìn)而從分子手段揭示了耐藥細(xì)菌株的基因型和表型具有一定關(guān)聯(lián)性，細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性的機制具有較高的復(fù)雜性 [15]。因此，對于蘇淮豬可以參考從抗腹瀉基因MUC13、FUT1進(jìn)行定向選育，利用分子育種方案從源頭上進(jìn)行腹瀉的防控 [16]。

近年來，養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)大力開始提倡減抗禁抗行動，但在疾病的預(yù)防治療、自配飼料的使用上，依然存在抗生素的濫用問題，致使細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重 [17-18]。本研究對分離獲得的致死小鼠大腸桿菌和沙門氏菌進(jìn)行了12種抗菌藥的耐藥性分析，結(jié)果表明，大腸桿菌和沙門氏菌對林可霉素類和青霉素類高度耐藥，耐藥率均超過90%，除喹諾酮類外，其他抗菌藥均呈現(xiàn)不同程度的耐藥率。張青嫻等對分離的1株豬源產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌同樣對青霉素類、頭孢類、四環(huán)素類、喹諾酮類抗生素耐藥，而對氨基糖苷類抗生素敏感，并通過4種常見的ESBLs耐藥基因擴增分析，提出加強產(chǎn)酶耐藥菌的監(jiān)測及保守地使用現(xiàn)有抗生素的觀點 [19]。而李佳瑞等從25株耐藥大腸桿菌攜帶的主動外排基因進(jìn)行研究，acrA、acrB這2種主動外排基因和調(diào)控基因mar A和sox S的相對表達(dá)量和多重耐藥的耐藥譜數(shù)呈正相關(guān)，調(diào)控基因acrR的相對表達(dá)量和多重耐藥的耐藥譜數(shù)呈負(fù)相關(guān) [20]。Xu等對我國北京等10個省份的動物、人的非典型致病性大腸桿菌（aEPEC）進(jìn)行藥敏紙片試驗，結(jié)果顯示，267株菌株中，128株（47.9%）檢出多重耐藥，40株耐藥菌株對10種以上抗菌藥物耐藥，有47株（17.6%）菌株被鑒定為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL），而從多重耐藥情況看，致死小鼠大腸桿菌和沙門氏菌多重耐藥情況嚴(yán)重，4耐及4耐以上菌株高達(dá)100% [21]，這一結(jié)果與Li等 [22]、田瑞 [23]研究基本一致，其中，Li等研究發(fā)現(xiàn)高達(dá)71.25%（57/80）的沙門氏菌菌株呈現(xiàn)多種藥物耐藥，對頭孢菌素類及氨基糖苷類抗生素敏感 [22];田瑞等研究的大腸桿菌分離率為86.31%（580/672），累計產(chǎn)生23種多重耐藥型 [23]。

4 結(jié)論

本研究從細(xì)菌性病原的角度對致蘇淮仔豬腹瀉的病因進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、沙門氏菌是主要致病菌，藥敏紙片試驗顯示2種致病菌均呈現(xiàn)4重及以上多重耐藥性，均對喹諾酮類藥物高度敏感，試驗結(jié)果可為蘇淮豬細(xì)菌性腹瀉癥的病因和臨床治療提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ho W S，Tan L K，Ooi P T，et al. Prevalence and characterization of verotoxigenic-Escherichia coli isolates from pigs in Malaysia [J]. BMC Veterinary Research，2013，9：109.

[2]Toledo A，Gómez D，Cruz C，et al. Prevalence of virulence genes in Escherichia coli strains isolated from piglets in the suckling and weaning period in Mexico [J]. Journal of Medical Microbiology，2012，61（1）：148-156.

[3]Barbara E S，Jeffrey J Z，Sylvie D A，et al. Swine diseases [M]. 9th ed. Beijing：China Agricultural University Press，2008：158-159.

[4]姚火春. 獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo) [M]. 2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：43-45.

[5]孫長貴，譯. 抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn) [S]. 第20版信息增刊，2010：25-30.

[6]張海峰. 2019年生豬市場主要特征及2020年趨勢 [J]. 中國豬業(yè)，2020，15（2）：13-19，25.

[7]Ruiz V L，Bersano J G，Carvalho A F，et al. Case-control study of pathogens involved in piglet diarrhea [J]. BMC Research Notes，2016，9（1）：22.

[8]汪 群，閆 鶴. 腹瀉仔豬與健康仔豬糞便菌群多樣性的比較 [J]. 中國畜牧雜志，2019，55（8）：106-110.

[9]Hermann-Bank M L，Skovgaard K，Stockmarr A，et al. Characterization of the bacterial gut microbiota of piglets suffering from new neonatal porcine diarrhoea [J]. BMC Veterinary Research，2015，11：139.

[10]黃美州，劉永明，王 慧，等. 甘肅地區(qū)新生仔豬腹瀉細(xì)菌性病原的分離鑒定及其耐藥性分析 [J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，24（12）：35-39.

[11]李 晨，張雙翔，周碧君，等. 腹瀉仔豬腸道致病性大腸埃希氏菌和沙門氏菌的分離鑒定與耐藥性研究 [J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2017，44（12）：3625-3633.

[12]李淑紅，張華清，王京仁，等. 湘西北某規(guī)模化豬場臨床病豬沙門氏菌及大腸桿菌混合感染的病原分離鑒定及耐藥性分析 [J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017，526（10）：100-102.

[13]曲 歌，沙萬里，高 雪，等. 吉林地區(qū)規(guī)?；i場大腸桿菌和沙門氏菌性仔豬腹瀉流行情況調(diào)查 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（3）：89-90，100.

[14]吳秋玉. 泉州地區(qū)豬源致病性大腸桿菌的分離鑒定血清型檢測與耐藥性分析 [J]. 中國獸醫(yī)雜志，2018，54（5）：97-99.

[15]徐引弟，張青嫻，王治方，等. 河南省規(guī)?；i場豬腸外致病性大腸桿菌的耐藥性分析 [J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2019，39（8）：1526-1532.

[16]方宇瑜，吳 艷，高 碩，等. 蘇淮豬群體抗腹瀉基因MUC13和FUT1多態(tài)性分析及其抗腹瀉選育方案研究 [J]. 畜牧與獸醫(yī)，2015，47（12）：12-17.

[17]Seitz M，Valentin-Weigand P，Willenborg J. Use of antibiotics and antimicrobial resistance in veterinary medicine as exemplified by the swine pathogen streptococcus suis [J]. Current Topics in Microbiology and Immunology，2016，398：103-121.

[18]劉偉杰，賀小娜，韓珊珊，等. 禽畜糞便中抗生素耐藥菌的分離與分子鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（1）：291-293.

[19]張青嫻，徐引弟，王治方，等. 一株豬源產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析 [J]. 養(yǎng)豬，2019（3）：101-104.

[20]李佳瑞，楊雨齊，李思鴻，等. AcrAB-TolC主動外排系統(tǒng)與豬源耐藥大腸桿菌多重耐藥的相關(guān)性 [J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2020，40（3）：595-601.

[21]Xu Y M，Sun H，Bai X N，et al. Occurrence of multidrug-resistant and ESBL-producing atypical enteropathogenic Escherichia coli in China [J]. Gut Pathogens，2018，10（1）：8.

[22]Li Q，Yin J，Li Z，et al. Serotype distribution，antimicrobial susceptibility，antimicrobial resistance genes and virulence genes of Salmonella isolated from a pig slaughterhouse in Yangzhou，China [J]. AMB Express，2019，9（1）：210.

[23]田 瑞. 河北省豬源E.coli分離鑒定及耐藥性研究 [D]. 秦皇島：河北科技師范學(xué)院，2018：26-30.