劉燕妮 毛芙蓉 范慧冬 鄭士金 侯柏森
摘要:以番茄細菌性潰瘍病病菌的特異性基因cytC為檢測靶標,以番茄潰瘍病病菌等8種病原細菌為供試菌株。根據(jù)檢測靶標設計環(huán)介導等溫擴增(LAMP)引物并進行特異性和靈敏度檢測。結(jié)果顯示,引物cytC-170能特異性檢測出番茄潰瘍病病菌,檢測靈敏度高達5×105 copy/μL,環(huán)引物的加成將試驗進程縮短為33.06 min,使整個反應控制在50 min內(nèi)。研究建立的LAMP檢測方法操作簡單,結(jié)果可視,非常適用于番茄細菌性潰瘍病病菌的現(xiàn)場快速檢測。
關鍵詞:番茄潰瘍病病菌;LAMP;特異性;檢測;cytC基因;加環(huán)試驗
中圖分類號:S436.412.1+9?? 文獻標志碼: A
文章編號:1002-1302(2021)11-0072-04
收稿日期:2020-09-01
基金項目:吉林省重點科技攻關項目(20140204032NY)。
作者簡介:劉燕妮(1988—),女,山東青島人,碩士,助理研究員,研究方向為蔬菜病害綜合防治。E-mail:704870590@qq.com。
通信作者:毛芙蓉,碩士,副研究員,研究方向為蔬菜病蟲害綜合防治。E-mail:5155885@qq.com。
番茄細菌性潰瘍病病菌是我國禁止入境的檢疫性有害微生物,1954年我國首次報道該病害,之后便迅速蔓延,現(xiàn)在在黑龍江、吉林、山東、遼寧、河北、四川等地均有發(fā)生,每年給番茄帶來25%~75%的經(jīng)濟損失,嚴重制約著番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。番茄細菌性潰瘍病由密執(zhí)安棒狀桿菌密執(zhí)安亞種(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,以下簡稱為Cmm)引起,除侵染番茄外,還可侵染辣椒、裂葉茄、龍葵、煙草、天仙子等47種茄科植物[1-2]。這些植物的病殘體都可作為病害再次流行的初侵染源。有關報道表明,當番茄體內(nèi)的病菌濃度達到1×108~1×109 CFU/mL時,番茄就會表現(xiàn)出被害癥狀[3],當番茄種子的帶菌率達1%以上時,便可引起病害的快速流行[4-5]。因此進行番茄潰瘍病病菌的初期檢測并進行有效防治是預防該病發(fā)生的最有效手段。
目前,針對番茄細菌性潰瘍病病菌的檢測方法主要有半選擇性培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)[6]、菌株的致病性測定[7]、血清學檢測、DNA 探針[8]以及PCR[9]等方法,但這些檢測方法都存在操作復雜、準確率低以及技術要求高等各方面的限制。本研究使用建立的環(huán)介導等溫擴增(LAMP)檢測方法對技術要求低、靈敏度高、特異性強、操作簡便,更適用于番茄細菌性潰瘍病病菌的早期檢測。
1 材料與方法
1.1 供試菌株
本研究使用的菌株番茄細菌性潰瘍病病菌[Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.],由筆者所在實驗室自主分離和中國農(nóng)業(yè)大學種子病理中心提供;番茄青枯假單胞菌和茄青枯假單胞菌(Pseudomonas solanacearum E. F.Smith),均由廣東省微生物保存中心提供;黃瓜角斑病病菌[Pseudomonas syringae pv. lachrymans (Smith & Bryan) Yong,Dye & Wilkie]和西瓜果斑病病菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al.),均由吉林農(nóng)業(yè)大學植物病理實驗室提供;馬鈴薯環(huán)腐病病菌[Clavibacter michiganense subsp. sepedonicum (Spieckermann & Kotthoff) Davis,Gillaspie,Vidaver and Harris]和馬鈴薯瘡痂病病菌[Streptomyces scabies (Thaxte) Waks.et Henvici],均由筆者所在實驗室自主保存。
1.2 培養(yǎng)基
NA培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母粉3.0 g、瓊脂粉16~18 g,定容至1 000 mL,調(diào)pH值至7.0,121 ℃滅菌30 min。LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨 10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g,定容至1 000 mL,調(diào)pH值至7.0,121 ℃滅菌20 min。
1.3 LAMP反應體系的建立
試驗于2015年4—12月在吉林省蔬菜花卉科學研究院植物保護實驗室內(nèi)進行。
1.3.1 細菌基因組DNA的提取
將供試菌株在NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)至LB液體培養(yǎng)基中進行恒溫振蕩培養(yǎng)至菌液濃度為108 CFU/mL。培養(yǎng)好的菌株使用細菌基因組提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取菌體DNA,并用ND 1000分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 LAMP引物設計
根據(jù)PCR的試驗結(jié)果[10],針對特異性基因(cytC基因),使用Primer Premier 5.0設計LAMP反應內(nèi)外引物及環(huán)引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成及純化。
1.3.3 LAMP反應體系
利用設計的內(nèi)外引物及環(huán)引物(引物均稀釋到100 μmol/L),使用廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)的通用型恒溫實時熒光試劑盒進行LAMP反應。反應體系:2×LAMP reaction mixture 12.5 μL、熒光染料0.25 μL、Bst酶 0.5 μL、引物 1.0 μL (內(nèi)、外引物終濃度分別為1.6、0.2 μmol/L)、環(huán)引物 (100 μmol/L) 0.2 μL(終濃度為0.8 μmol/L)、DNA模板 2.0 μL,用水定容至25 μL。反應程序:63 ℃,70 min。
1.3.4 加環(huán)后反應體系
使用廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)的凍干通用型恒溫實時熒光試劑盒進行LAMP反應。反應體系:復溶液15 μL、引物1.0 μL(內(nèi)、外引物終濃度分別為1.6、0.2 μmol/L)、環(huán)引物(100 μmol/L) 0.2 μL (終濃度為0.8 μmol/L)、 DNA模板2.5 μL,用水定容至25 μL。反應程序:63 ℃,70 min。
1.3.5 LAMP 方法引物篩選
將設計好的內(nèi)外引物加到反應體系中進行等溫擴增,采用熒光定量PCR儀器進行LAMP反應,在每個循環(huán)結(jié)束時讀取熒光信號值,判斷引物擴增效果。
1.3.6 LAMP 方法特異性檢測
使用表1中所列的LAMP反應所需引物進行特異性檢測,以無菌水為空白對照,驗證LAMP檢測的特異性。結(jié)果通過3種不同的方法進行判斷:將LAMP產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測;采用熒光定量PCR儀器進行LAMP反應,在每個循環(huán)結(jié)束時讀取熒光信號值;將LAMP產(chǎn)物離心,使管蓋上的顯色物質(zhì)進入產(chǎn)物,觀察顯色情況。
1.3.7 LAMP 方法靈敏度檢測
利用篩選出的引物組,對番茄潰瘍病病菌進行擴增,檢測LAMP反應的靈敏度。提取番茄潰瘍病病菌的DNA,并進行不同濃度的稀釋使其終濃度分別為5、50、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106 copies/μL共7個濃度作為各個梯度的DNA 模板,以無菌水為空白對照進行LAMP反應的靈敏度檢測。結(jié)果判斷同“1.3.6”節(jié)。
2 結(jié)果與分析
2.1 LAMP引物篩選
使用設計引物cytC-170和cytC-49對Cmm進行特異性擴增,結(jié)果如圖1所示。引物cytC-170能擴增出目的片段,可以進行后續(xù)試驗,而引物cytC-49 擴增效果不理想,不能擴增目的片段。因此選擇引物cytC-170進行下一步試驗。
2.2 LAMP檢測加環(huán)試驗
對篩選出的cytC-170引物組進行環(huán)引物加成處理,將處理后的引物組重新進行LAMP反應,通過試驗結(jié)果(圖2)可以看出,加環(huán)后擴增時間從47.27 min縮減為33.06 min;反應時間約縮短1/3,擴增速度明顯加快,更有利于檢測的進行。
2.3 cytC基因LAMP特異性檢測
利用供試菌株對篩選優(yōu)化的cytC-170引物組進行特異性檢測,結(jié)果(圖3)顯示,3種檢測方法均證明cytC-170基因只能從Cmm樣品中獲得預期目標產(chǎn)物,而在番茄青枯假單胞菌、黃瓜角斑病病菌等病原細菌中均不能獲得目標片段,表明cytC-170基因能通過LAMP檢測的方法特異性檢測出番茄潰瘍病病菌。
2.4 cytC-170基因LAMP靈敏度性檢測
對篩選出的cytC-170引物組進行靈敏度檢測,結(jié)果(圖4)顯示:3種檢測方法均證明,當病菌的濃度達到5×105 copies/μL時,cytC-170基因能很好地擴增出目的片段,可用于檢測Cmm。
3 討論與結(jié)論
番茄潰瘍病是一種系統(tǒng)性維管束病害,植株發(fā)病后病情可以隨流水、農(nóng)事操作等迅速蔓延,可能給番茄生產(chǎn)帶來毀滅性打擊。進行番茄潰瘍病病菌的早期檢測預防能夠有效減少該病帶來的損失。有關報道表明,只有當番茄植物體內(nèi)的Cmm濃度達到1×108~1×109 CFU/mL時,番茄才會表現(xiàn)出被害狀[3],本研究建立的以cytC基因為檢測靶標的LAMP檢測方法,檢測靈敏度為5×105 copies/μL,遠低于發(fā)病濃度,能夠達到早期檢測的要求。
針對番茄潰瘍病病菌的檢測廣大學者也進行了廣泛研究,但是選擇培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)[6]及接種紫茉莉葉片引起過敏性壞死反應[7]存在耗時長的缺點;血清學檢測及DNA探針、PCR等方法有效縮短了檢測時間。但是血清學檢測存在檢測靈敏度低;DNA探針不能區(qū)分致病與非致病菌株;PCR檢測存在耗時長,對操作人員技術要求高等缺點,不適用于檢測的推廣。本研究選取了與致病性相關的cytC基因,而非高保守性的16S rRNA序列以及高變異性的ITS序列,有效避免了假陽性。建立的LAMP檢測方法操作簡單簡便,只需要1臺恒溫水浴鍋便可完成;耗時短,反應時間為33.06 min,整個檢測過程可控制在50 min內(nèi),比常規(guī)PCR和實時熒光 PCR檢測能更早得到反應結(jié)果。雖然PCR檢測的靈敏度要高于LAMP檢測,但是PCR檢測相對要求比較高,而LAMP檢測更快速、便捷,只需一個恒等溫的環(huán)境即可,更適用于生產(chǎn)應用。
參考文獻:
[1]Gleason M L,Gitaitis R D,Ricker M D. Recent progress in understanding and controlling bacterial canker of tomato in Eastern North Amercica[J]. Plant Disease,1993,77(11):1069-1076.
[2]張慶萍,李玉民,席先梅. 番茄潰瘍病的發(fā)生與防治[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2012(6):71-72.
[3]Gitaitis R D,Beaver R W,Voloudakis A E. Detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in symptomles tomato transplants[J]. Plant Disease,1991,75:834-838.
[4]張滿良. 番茄潰瘍病的識別與綜合防治[J]. 西北園藝,2009(9):41.
[5]李煥玲,石延霞,謝學文,等. 李寶聚博士診病手記(四十二)番茄潰瘍病的發(fā)生規(guī)律與防治技術[J]. 中國蔬菜,2011,1(23):24-27.
[6]Ftayeh R M,von Tiedemann A,Rudolph KW E. A new selective medium for isolation of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis from tomato plants and seed[J]. Phytopathology,2011,101(11):1355-64.
[7]Gitaitis R D. Induction of a hypersensitive like reaction in four-oclock by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis[J]. Plant Disease,1990,74(1):58-60.
[8]Dreier J,Meletzus D,Eichenlaub R. Characterization of the plasmid encoded virulence region pat-1 of phytopathogenic Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions,1997,10(2):195-206.
[9]毛芙蓉,李飛武,劉燕妮,等. 番茄細菌性潰瘍病菌的定性PCR檢測方法[J]. 北方園藝,2015(5):128-131.