李紅微，王志奇，張 菊，郭 鑫

糖尿病腎病作為臨床上十分常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥之一，是終末期腎病發(fā)生的重要誘因，以腎臟纖維化為主要病理變化[1]。腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化和膠原合成是腎臟纖維化發(fā)生的機(jī)制之一，受到細(xì)胞內(nèi)多種基因和信號(hào)的共同調(diào)控作用[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是公認(rèn)的促進(jìn)腎臟纖維化發(fā)生的誘導(dǎo)因子，能夠誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，這也是其誘導(dǎo)腎組織纖維化的重要途徑之一[3-4]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子1(glioma associate oncogene homolog 1, Gli1)是廣泛存在于人類組織和器官中的調(diào)控因子，在細(xì)胞分化、間質(zhì)轉(zhuǎn)分化和運(yùn)動(dòng)等過(guò)程中具有關(guān)鍵作用[5]。有研究顯示，Gli1參與部分疾病的發(fā)生和發(fā)展，在心肌纖維化和腎組織纖維化等纖維化疾病中發(fā)現(xiàn)Gli1過(guò)度表達(dá)，并且Gli1表達(dá)水平還與組織纖維化程度密切相關(guān)[6-7]。本研究探討Gli1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化和膠原合成的影響，以期為腎小管纖維化機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 qRT-PCR試劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；Gli1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam；纖維連接蛋白(fibronectin, FN)和Ⅰ型膠原酶(collagen type Ⅰ, Col Ⅰ)含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海瑞齊生物科技有限公司；α-SMA抗體和Ras相關(guān)C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech；慢病毒介導(dǎo)的Gli1干擾載體(Gli1 shRNA)及其陰性對(duì)照(shRNA)由上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司合成；腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E購(gòu)于美國(guó)ATCC，細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM中。

1.2TGF-β1誘導(dǎo)后腎小管上皮細(xì)胞中Gli1表達(dá)水平檢測(cè) 腎小管上皮細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)0 h時(shí)用0 μg/L的TGF-β1細(xì)胞培養(yǎng)液和5 μg/L的TGF-β1細(xì)胞培養(yǎng)液處理，分別記為Control組和TGF-β1組，培養(yǎng)24 h以后，采用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)細(xì)胞中Gli1表達(dá)水平。

qRT-PCR檢測(cè)：取Control組和TGF-β1組細(xì)胞，利用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。RNA濃度和純度測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)。配制逆轉(zhuǎn)錄體系，包含4 μl的5×Prime Script Buffer，1 μl的Prime Script RT Enzyme Mix，1 μl的Oligo dT primer，1 μl的Random 6 mers，1 μg的總RNA，12 μl的RNase Free dH2O，逆轉(zhuǎn)錄條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存在-20℃。PCR體系包含12.5 μl的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，1 μl的上下游引物，2 μl的cDNA，8.5 μl的dH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃反應(yīng)30 s，95℃反應(yīng)5 s，60℃反應(yīng)30 s，共循環(huán)40次。待測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列為Gli1上游引物為5'-CTGGACCTGCAGACGGTTATC-3'，下游引物為5'-AGCCCTCCTGGAGATGTGCAT-3'。GAPDH上游引物為5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'，下游引物為5'-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。

Western blot檢測(cè)：分別取Control和TGF-β1組細(xì)胞，在細(xì)胞中添加蛋白裂解液，提取細(xì)胞中的總蛋白。根據(jù)說(shuō)明書用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)蛋白樣品的濃度。SDS-PAGE凝膠按照每個(gè)泳道50 μg蛋白樣品進(jìn)行上樣，Marker添加3 μl。首先設(shè)置80 V的電壓進(jìn)行電泳，直到溴酚藍(lán)馬上要進(jìn)入分離膠以后，把電壓調(diào)整到100 V，觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入到玻璃板的底端以后，把電源關(guān)閉。取出凝膠，在250 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜1 h。將電轉(zhuǎn)之后的NC膜置于提前配制好的封閉液(5%牛血清白蛋白)中，置于室溫條件下結(jié)合2 h；再將NC膜置于已經(jīng)配制好的一抗溶液內(nèi)，置于4℃密封過(guò)夜；取出NC膜，放在二抗反應(yīng)液中，室溫孵育1 h。添加電化學(xué)發(fā)光試劑，凝膠成像儀拍照以后，根據(jù)Quantity One分析目的條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值，對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.3慢病毒感染 將腎小管上皮細(xì)胞接種到12孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到30%～40%，在細(xì)胞內(nèi)加入慢病毒溶液，感染復(fù)數(shù)為30，培養(yǎng)12 h以后，把孔內(nèi)的溶液倒掉，然后加入新的培養(yǎng)液，72 h以后，分別觀察細(xì)胞的熒光情況，干擾效率高于85%。以5 μg/L的TGF-β1細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)感染慢病毒介導(dǎo)的Gli1 shRNA及shRNA細(xì)胞，分別記為sh-Gli1+TGF-β1和sh-NC+TGF-β1組。取TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1組細(xì)胞，采用1.2中qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)Gli1水平以確定干擾效果。

1.4ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中FN和ColⅠ水平 取Control、TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1組細(xì)胞，分別培養(yǎng)24 h以后，吸取培養(yǎng)液上清，用ELISA試劑盒檢測(cè)FN和ColⅠ水平，操作步驟均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5Western blot檢測(cè)細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和Rac1蛋白表達(dá)水平 取Control、TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1組細(xì)胞，分別培養(yǎng)24 h以后，采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中α-SMA和Rac1蛋白表達(dá)水平，步驟同1.2。

2 結(jié)果

2.1TGF-β1誘導(dǎo)后腎小管上皮細(xì)胞中Gli1表達(dá) TGF-β1組腎小管上皮細(xì)胞中Gli1 mRNA和蛋白表達(dá)量均高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1和表1。

圖1 TGF-β1誘導(dǎo)后腎小管上皮細(xì)胞中Gli1蛋白表達(dá)

表1 Control組和TGF-β1組腎小管上皮細(xì)胞中Gli1 mRNA和蛋白表達(dá)

2.2Gli1 shRNA下調(diào)TGF-β1條件下腎小管上皮細(xì)胞中Gli1表達(dá) 腎小管上皮細(xì)胞中Gli1 mRNA和蛋白表達(dá)量，TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1 3組總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；TGF-β1組與sh-NC+TGF-β1組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TGF-β1和sh-NC+TGF-β1組均高于sh-Gli1+TGF-β1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2和表2。

表2 采用不同處理方式3組腎小管上皮細(xì)胞中Gli1 mRNA和蛋白表達(dá)

圖2 Gli1 shRNA下調(diào)TGF-β1條件下腎小管上皮細(xì)胞中Gli1蛋白表達(dá)

2.3下調(diào)Gli1減弱TGF-β1條件下腎小管上皮細(xì)胞中FN和ColⅠ水平 FN和ColⅠ水平，Control、TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1 4組總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Control組均低于TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1組，TGF-β1和sh-NC+TGF-β1組均高于sh-Gli1+TGF-β1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 采用不同處理方式4組腎小管上皮細(xì)胞中FN和ColⅠ水平

2.4下調(diào)Gli1減弱TGF-β1條件下腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA和Rac1蛋白表達(dá) α-SMA和Rac1蛋白表達(dá)，Control、TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1 4組總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Control組均低于TGF-β1、sh-NC+TGF-β1和sh-Gli1+TGF-β1組，TGF-β1和sh-NC+TGF-β1組均高于sh-Gli1+TGF-β1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3和表4。

圖3 下調(diào)Gli1減弱TGF-β1條件下腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA和Rac1蛋白表達(dá)

表4 采用不同處理方式4組腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA和Rac1蛋白表達(dá)

3 討論

有研究報(bào)道，糖尿病腎病發(fā)病時(shí)，成纖維細(xì)胞在腎組織纖維化進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞是糖尿病腎病發(fā)生主要原因之一[8]。TGF-β1是最常見(jiàn)的一種腎組織纖維化發(fā)生誘導(dǎo)因子，在腎組織纖維化發(fā)生時(shí)表達(dá)上調(diào)，有促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化和膠原合成作用[9]。本研究結(jié)果顯示，腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)TGF-β1處理，細(xì)胞中的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和膠原水平升高，這與上述研究報(bào)道一致，說(shuō)明TGF-β1能夠促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞纖維化進(jìn)程。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的標(biāo)志，生理狀態(tài)下上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化對(duì)胚胎發(fā)育等有重要意義，病理狀態(tài)下上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化能誘導(dǎo)纖維化等疾病發(fā)生[10]。腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化發(fā)生與間質(zhì)特性出現(xiàn)有關(guān)，α-SMA是間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，在正常組織和器官中表達(dá)水平較低，而在組織或細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過(guò)程中表達(dá)上調(diào)[11-12]。有研究表明，α-SMA陽(yáng)性表達(dá)水平高低與組織纖維化程度呈正相關(guān)，細(xì)胞大量表達(dá)α-SMA是上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志[13]。Rac1有調(diào)控細(xì)胞動(dòng)力、周期及細(xì)胞黏附等作用，屬于小G蛋白家族成員之一，Rac1水平升高后能夠激活細(xì)胞游走，促進(jìn)上皮細(xì)胞去極性進(jìn)程，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化[14]。腎組織纖維化發(fā)生直接原因是細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量合成，腎小管上皮細(xì)胞在腎組織纖維化過(guò)程中能夠合成大量FN和ColⅠ，誘導(dǎo)纖維化發(fā)生[15]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)Gli1以后的腎小管上皮細(xì)胞合成FN和ColⅠ減少，α-SMA和Rac1表達(dá)水平降低，提示下調(diào)Gli1能夠抑制腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化和膠原合成。

本研究結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)后腎小管上皮細(xì)胞中Gli1表達(dá)上調(diào)，并且下調(diào)Gli1能夠減慢腎小管上皮細(xì)胞的纖維化進(jìn)程。Gli1是Hh信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，具有多種生物學(xué)功能，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其在組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和器官形成等過(guò)程中發(fā)揮作用[16]。Gli1參與炎癥和組織增生等病理學(xué)過(guò)程，在慢性瘙癢等疾病發(fā)生中扮演關(guān)鍵角色[17]。已有研究報(bào)道，腎組織纖維化進(jìn)程中Gli1高表達(dá)，Gli1可促進(jìn)腎組織纖維化[7]。本研究結(jié)果闡明了Gli1在腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)纖維化過(guò)程中的作用，為今后腎組織纖維化機(jī)制研究提供了參考。

總而言之，TGF-β1誘導(dǎo)后腎小管上皮細(xì)胞中Gli1表達(dá)上調(diào)，下調(diào)Gli1表達(dá)具有抗腎小管上皮細(xì)胞纖維化進(jìn)程的功能，Gli1可能具有誘導(dǎo)腎組織纖維化的作用，這為臨床研究Gli1調(diào)控腎組織纖維化進(jìn)程的具體機(jī)制提供了參考。