周俐宏，石 慧，楊迎東，崔玥晗，楊盼盼，徐雷鋒，明 軍*

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，沈陽 110161；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，沈陽 110866）

百合（Liliumspp.）是世界上重要觀賞花卉之一，在世界切花市場上占有重要地位。棉蚜（Aphis gossypiiGlover）是危害百合害蟲之一，危害百合植株健康和觀賞性，作為傳播媒介更是百合病毒病主要誘因。目前，防治蚜蟲多采用化學(xué)防治，但長期采用化學(xué)藥劑，致使蚜蟲逐漸產(chǎn)生群體抗藥性，防治效果降低，迫使加大用藥量和噴灑頻率，增加生態(tài)環(huán)境風(fēng)險[1]。培育抗蚜蟲品種是有效解決蚜蟲脅迫重要途徑之一，獲得抗蚜種質(zhì)是實現(xiàn)抗蟲育種目標(biāo)前提和基礎(chǔ)。因此，對百合種質(zhì)資源開展抗蚜性評價，分析其遺傳關(guān)系，可更有針對性選育抗蚜新品種，為抗蟲材料綜合應(yīng)用和抗蟲遺傳研究提供參考。

目前植物抗蚜性鑒定已在馬鈴薯[2]、苜蓿[3]、蕓薹屬[4]、小麥[5]、菊屬[6]、西瓜[7]、黃瓜[8]等作物上廣泛應(yīng)用。百合抗蚜研究比較薄弱[9]，亟待開展。SSR標(biāo)記具有共顯性、高度多態(tài)性、全基因組覆蓋、重復(fù)性好等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。近年，隨著百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得，百合中SSR標(biāo)記開發(fā)迅速發(fā)展[10]，500余條百合SSR引物已得到驗證，在百合中表現(xiàn)高度多態(tài)性[11-12]。國內(nèi)外學(xué)者已應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)尤其是SSR標(biāo)記技術(shù)對百合種間和種內(nèi)遺傳多樣性以及依據(jù)遺傳關(guān)系推測選擇親本開展相關(guān)研究[13-14]。但對不同抗蚜能力類群百合種質(zhì)資源間遺傳關(guān)系研究未見報道。

根據(jù)原產(chǎn)地和親本來源不同，國際百合協(xié)會將百合分為9個種系[15]，本研究選用60份百合資源涵蓋其中5個種系，對其開展抗蚜蟲評價，選用嚴格篩選后的6對SSR引物作熒光標(biāo)記，利用全自動基因分析儀檢測多態(tài)性位點，分析不同抗蚜級別百合資源遺傳多樣性，以期為百合抗蚜育種親本選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗蚜性鑒定從2017～2019年執(zhí)行3個年度重復(fù)測試。每年5月初將60份百合資源，包括11份野生種、49份栽培品種定植于冷棚中，每年7月初鑒定抗蚜性。試驗材料定植于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所西地試驗地。

1.2 方法

1.2.1 百合資源抗棉蚜性鑒定

1.2.1.1 人工蚜蟲接種

上午10點左右，用毛筆小心將棉蚜2齡若蟲接種到蕾期植株頂部嫩葉上，每株接種5頭，3次重復(fù)。接種10 d（蚜蟲繁殖2代）時，調(diào)查供試植株上蚜蟲數(shù)量。蚜蟲接種和數(shù)量統(tǒng)計參照Deng等方法[16]。

1.2.1.2 抗蚜蟲性評價

抗性評價采用蚜量比值法，蚜量比值=某材料蚜量/全部觀察材料平均蚜量。根據(jù)百合蚜量比值不同，可將抗蚜性分為5級：高抗：0～0.25；抗蟲：0.26～0.50；中抗：0.51～0.75；感蟲：0.76～1.25；高感：1.25以上[16]。

1.2.2 抗感棉蚜資源遺傳多樣性分析

1.2.2.1 DNA提取與檢測

每份材料選取幼嫩葉片1 g，MP Fastprep-24設(shè)備研磨，植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.2.2.2 PCR擴增與標(biāo)記檢測

根據(jù)Du等發(fā)表引物信息[12]，共選取50對SSR引物合成。對篩選出6對SSR標(biāo)記（見表1）正向引物5'末端用FAM、HEX、TAMRA 3種熒光染料中一種作標(biāo)記。引物合成和標(biāo)記由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

PCR擴增體系包含20μL反應(yīng)體積，其中Taq聚合酶0.4μL、10×PCR buffer 2μL、正向引物和反向引物各0.5μL、dNTPs 1μL、基因組DNA 2μL和ddH2O 13.6μL。PCR反應(yīng)程序為94℃5 min；94℃30 s，58℃45 s，72℃45 s，35個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將電泳條帶顯示清晰PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司作毛細管電泳熒光檢測。

1.2.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

GenAIEx 6.51b2計算每對引物等位基因數(shù)（Allele number）、有效等位基因數(shù)（Effective allele number）、基因多樣性指數(shù)（Gene diversity index，H）；Popgen32計算SSR引物主要等位基因頻率（Major allele frequency）、Shannon信息指數(shù)（Shannon's Information index，I）；PIC_CALC計算多態(tài)性信息含量指數(shù)（Polymorphism information content，PIC）。在MEGA 6.06中構(gòu)建遺傳聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合資源抗蚜性等級鑒定

2017～2019年利用人工蚜蟲接種和蚜量比值法共鑒定72份百合資源，其中，60份資源抗蚜性能力表現(xiàn)穩(wěn)定。根據(jù)蚜量比值法可分為5級（見圖1、表2），31份資源為高抗材料，7份資源為抗蟲材料，4份資源為中抗材料，6份資源為感蟲材料，12份資源為高感材料。在31份高抗資源中，亞洲百合和麝香百合×亞洲百合雜交種占54.84%（見圖2a），而這兩個雜種系主要親本是抗蚜野生種細葉百合、有斑百合、朝鮮百合、大花卷丹等[17]，說明亞洲百合雜種系和麝香百合雜種系是百合抗蚜育種重點資源。在12份高感百合資源中，東方百合和東方百合×喇叭百合雜交種占50%，野生種資源占41.67%（見圖2b），東方百合和喇叭百合雜種系主要親本為湖北百合、毛百合[17]，鑒定結(jié)果表明為感蚜種，說明東方百合雜種系是相對易感蚜蟲百合資源。

圖2 高抗蚜（a）和高感蚜（b）等級中不同類型百合資源Fig.2 Different types of lily resources in high resistance(a)and high susceptible(b)groups

表2 60份百合資源抗蚜性等級鑒定結(jié)果Table 2 Grades of aphid resistance of 60 lily resources

圖1 百合資源5個抗蚜等級分級標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 Five aphid-resistance grading standard in lily

續(xù)表2

2.2 百合種質(zhì)資源SSR位點多樣性分析

利用6對引物（見圖3）在60份資源中共檢測出35個等位基因，平均每對SSR引物擴增出5.8個主要等位變異，其中LS34擴增出等位變異最多，為9個。主要等位基因頻率為0.1667～0.6250，平均0.3872。多態(tài)性信息含量（PIC）變幅介于0.5663～0.8940，平均0.7472，PIC最大標(biāo)記為LS34，最小標(biāo)記為LS15。6個位點PIC值均大于0.5，為高度多態(tài)性位點?；蚨鄻有灾笖?shù)（H）變化為0.491～0.848，平均0.647，其中LS41最低，LS34最高。Shannon多 樣 性 指 數(shù) 為1.3759～2.5319，平 均1.9231，最高為LS34，最低為LS15（見表3）?；蚨鄻有灾笖?shù)、多態(tài)性信息含量、Shannon信息指數(shù)呈正相關(guān)，可反映每對標(biāo)記鑒別能力。6個SSR位點多態(tài)性豐富，可檢測到不同百合資源間豐富的遺傳多樣性。

圖3 引物L(fēng)S08 HEX在‘Starlight Express’（a）和‘Navona’（b）測序峰值Fig.3 Sequencing peak of‘Starlight Express’and‘Navona’with primer LS08 HEX

表3 6對SSR標(biāo)記遺傳參數(shù)Table 3 Genetic parameters of the six SSR markers used in this study

2.3 百合種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

利用6對引物分析不同抗蚜組百合資源遺傳多樣性（見表4），不同抗蚜組百合基因多樣性指數(shù)、多態(tài)性信息含量、Shannon信息指數(shù)變化分別為0.538～0.852、0.795～0.908、0.861～1.883，平均值為0.722、0.876和1.346，其中高抗組百合遺傳參數(shù)最高。說明高抗組百合遺傳多樣性較豐富，可從中挖掘優(yōu)良基因用于品種改良。

表4 不同抗蚜組百合遺傳多樣性分析Table 4 Genetic diversity analysis of lily with different aphid resistance groups

利用Popgen 32計算不同抗性組百合種質(zhì)間遺傳相似性（見表5），結(jié)果表明，遺傳距離變化為0.1309～0.5403，平均0.3306，遺傳一致度變化為0.5826～0.8773，平均0.7267。其中，感蟲組和高感組遺傳距離最?。?.1309），遺傳一致度最大（0.8773），親緣關(guān)系較近?？瓜x組和中抗組遺傳距離最大（0.5403），遺傳一致度最?。?.5826），親緣關(guān)系較遠。

表5 不同抗性組百合資源遺傳一致度和遺傳距離Table 5 Genetic identity and genetic distance of lily with different aphid resistance groups

基于UPGMA對不同抗性組百合資源聚類（見圖4），將5個抗性組劃分為3個組群（組群Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）。

圖4 基于遺傳距離不同抗性組百合資源聚類結(jié)果Fig.4 Cluster result of lily with different resistance groups based on genetic distance

圖4 中組群Ⅰ將抗蟲組歸為一類。組群Ⅱ?qū)⒏呖菇M和中抗組歸為一類。組群Ⅲ將感蟲組和高感組歸為一類。聚類結(jié)果與遺傳相似性分析結(jié)果一致，也進一步表明百合對蚜蟲抗性與百合遺傳背景間存在密切聯(lián)系。

基于UPGMA對不同百合資源聚類（見圖5），高抗、中抗、高感資源在3個組群中均有分布，抗蟲資源主要分布在A組，感蟲資源主要分布在A和B組?；诟骺垢匈Y源間遺傳關(guān)系及距離，可為百合抗蚜育種提供更加詳細參考。

圖5 基于熒光SSR分子標(biāo)記的60份百合資源聚類結(jié)果Fig.5 Cluster result of 60 lily resources based on data from SSR markers

3 討論與結(jié)論

3.1 百合資源抗蚜性評價

本研究采用抗蚜性評價方法是蚜量比值法，在作物中具有通用性，可對不同作物間抗蚜水平開展橫向比較。何俊平等鑒定32份切花菊抗蚜蟲性，研究表明10個為高抗品種，占比31.25%，14個為不抗品種，占比43.75%[1]。王仕偉等鑒定222份玉米自交系蚜蟲抗性，篩選出15份高抗蚜蟲自交系，占比6.76%，35份高感蚜蟲自交系，占比15.77%[18]。Zhang等鑒定21份西瓜資源抗蚜性，獲得2份中抗資源，占比9.52%，3份高感資源，占比14.29%[19]。本研究鑒定72份百合資源抗蚜性，獲得高抗資源31份，占比43.06%，12份高感資源，占比16.67%?？煽闯觯俸峡寡列运礁哂谄渌魑?。蚜蟲脅迫受氣候環(huán)境影響較大，為更加準(zhǔn)確評價百合資源抗蚜性，需充分考慮不同年份對百合資源抗蚜差異的影響。周俐宏等對31份百合資源開展抗蚜性分級[9]，在隨后兩年重復(fù)評價中，有23份資源抗性水平表現(xiàn)穩(wěn)定，8份資源抗性水平表現(xiàn)不穩(wěn)定（已舍棄）。本研究開展連續(xù)3年重復(fù)評價，60份資源為抗性表現(xiàn)穩(wěn)定（野生）品種，增強研究結(jié)果可靠性。

優(yōu)異抗性資源是植物抗蟲育種基礎(chǔ)[20]。本研究中，細葉百合、有斑百合、條葉百合、岷江百合、朝鮮百合、大花卷丹為對蚜蟲有一定抗性的野生種。據(jù)文獻記載，細葉百合、朝鮮百合、大花卷丹、條葉百合均為亞洲百合雜種系親本材料[17,21-22]，直接證明抗蚜百合類型中亞洲百合占主導(dǎo)地位（見圖2）。而岷江百合作為喇叭型百合雜種系主要親本材料[17,23]，也增加部分OT類型百合抗蚜性（見圖2）。

3.2 百合SSR位點及抗蚜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

Lee等基于百合屬EST數(shù)據(jù)庫開發(fā)首批百合SSR標(biāo)記，利用19個標(biāo)記在84份材料中檢測到188個等位變異，平均每個標(biāo)記等位變異數(shù)為9.95個，平均PIC為0.76[24]。Yamamoto等利用8個SSR標(biāo)記檢測236份L.auratumvar.auratumLindl.和L.auratumvar.platyphyllumBaker百合在日本不同地區(qū)遺傳多樣性，平均每個位點檢測到2.80～4.86個等位變異，平均Nei氏遺傳多樣性為0.49～0.58[25]。本研究選用6對SSR引物分析60份不同抗蚜能力百合資源，多態(tài)性信息含量為0.5663～0.8940，平均0.7472，按照Botstein等提出衡量指標(biāo)[26]，當(dāng)PIC＞0.5時，該位點為高度多態(tài)位點，試驗所用6對SSR引物均為高度多態(tài)位點。本研究所用SSR標(biāo)記與前人研究結(jié)果相比表現(xiàn)較高遺傳多樣性，這與本試驗引物經(jīng)兩次篩選，引物多態(tài)性高和熒光SSR標(biāo)記檢測分辨率更高、準(zhǔn)確性更好有關(guān)，這些位點較好反映不同抗蚜級別百合資源遺傳多樣性。

劉冬云利用12對SSR引物分析25個細葉百合居群遺傳多樣性，結(jié)果表明，野生細葉百合居群在分子水平上表現(xiàn)豐富遺傳多樣性[27]。楊敏利用6對SSR引物分析長江中游地區(qū)野生百合種質(zhì)資源遺傳多樣性，結(jié)果表明，長江中游地區(qū)百合野生種遺傳分化程度較高[28]。葛亮等利用19對ESTSSR引物，將百合22個原生種和74個品種分為兩個類群[13]。Lee等利用SSR和IRAP標(biāo)記分析來自韓國、中國和日本二倍體和三倍體卷丹群體遺傳多樣性，結(jié)果表明，同源三倍體卷丹來源于小數(shù)量二倍體卷丹種[14]。國內(nèi)外開展百合遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析較多，本研究比較5個抗蚜等級百合資源遺傳多樣性，不同抗蚜等級百合資源蘊含比較豐富遺傳變異，顯示較高水平基因多樣性。不同抗蚜組百合資源間遺傳多樣性水平存在一定差異，高抗蚜組百合遺傳多樣性高于其他抗性組。聚類分析結(jié)果表明，高抗蚜組百合并不獨立成群，在各組群中分布一致，這也與百合高度雜合基因特性有關(guān)。高抗蚜百合具有更高遺傳多樣性，可為百合抗蚜新品種選育過程中挖掘優(yōu)良基因和拓寬遺傳基礎(chǔ)提供重要價值。

3.3 百合抗蚜育種親本選擇推測

利用百合資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系，可為從百合種質(zhì)資源中高效發(fā)掘有利基因/QTL提供參考，達到育成有效抵御各種生物、非生物脅迫等新品種的目的。對觀賞百合抗蚜育種來說，親本選配標(biāo)準(zhǔn)不僅要考慮親緣關(guān)系遠近，還綜合考慮親本抗蚜能力及觀賞性?？寡劣^賞百合育種親本選配的依據(jù)是選用綜合性狀優(yōu)的抗蚜百合和生態(tài)型相近或相同，但無親緣關(guān)系廣泛應(yīng)用的商業(yè)品種雜交，可獲得良好效果。本研究分析百合資源抗蚜性鑒定和遺傳關(guān)系結(jié)果可為百合抗蚜育種提供參考。例如，可選擇綜合性狀較優(yōu)的抗蚜百合‘Prato’‘White Heaven’‘Fangio’等與觀賞價值較高的‘Navona’‘Corcovado’‘Cocossa’雜交培育抗蚜切花百合；可選擇綜合性狀較優(yōu)的盆花抗蚜百合‘After Eight’與觀賞價值較高的‘Pink Palace’雜交培育抗蚜盆花百合。此外，作為中國傳統(tǒng)食用百合的蘭州百合和卷丹均為高感蚜百合種，急需改造。結(jié)合百合資源間遺傳關(guān)系（見圖4），可用高抗細葉百合改造蘭州百合，抗蚜條葉百合和朝鮮百合改造卷丹。