郭雅琪，姚 振，陳中義

組培條件下空心蓮子草匍匐莖段根系發(fā)育的研究

郭雅琪，姚 振，陳中義*

（長(zhǎng)江大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025）

【目的】空心蓮子草是一種世界范圍的惡性入侵雜草，其貯藏根的形成在其入侵中具有重要作用，對(duì)其不定根的發(fā)生及其膨大情況進(jìn)行研究有助于人們有針對(duì)性的進(jìn)行防控?！痉椒ā坷媒M織培養(yǎng)體系，對(duì)空心蓮子草匍匐莖段進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件主要考慮培養(yǎng)基凝固劑的類型、外植體是否帶節(jié)、外植體節(jié)下莖段長(zhǎng)度、外植體扦插方式和扦插深度?！窘Y(jié)果】空心蓮子草莖段比較理想的組培條件為：帶1節(jié)長(zhǎng)度為4 cm的去葉空心蓮子草莖段，使用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡1 min，0.1%升汞浸泡6 min消毒，在MS培養(yǎng)基中連續(xù)繼代培養(yǎng)，采用第3代無(wú)菌苗的莖段作為外植體，在含有普通瓊脂的MS培養(yǎng)基（鉀離子濃度降至標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基60%）條件下，節(jié)下部長(zhǎng)度為1.5 cm帶節(jié)外植體正向扦插深度為1.4 cm的時(shí)候，可以獲得生長(zhǎng)良好的空心蓮子草植株。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外植體的下部截口上方的莖段能夠不經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)直接生長(zhǎng)出不定根，即出現(xiàn)節(jié)間生根現(xiàn)象。外植體培養(yǎng)70 d時(shí)，發(fā)現(xiàn)有部分不定根出現(xiàn)膨大趨勢(shì)。繼續(xù)培養(yǎng)80 d后，筆者觀察到空心蓮子草不定根出現(xiàn)明顯膨大?！窘Y(jié)論】研究成功構(gòu)建了空心蓮子草莖段不定根膨大的組織培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步在組培條件下開展空心蓮子草貯藏根的形成機(jī)理研究提供依據(jù)。

空心蓮子草；匍匐莖；不定根；組織培養(yǎng)。

【研究意義】空心蓮子草［（Mart.）Griseb.］是一種惡性外來(lái)入侵植物，其主要入侵地有河流、沼澤、池塘、菜地和農(nóng)田等水生和陸地環(huán)境，對(duì)入侵地的生態(tài)系統(tǒng)具有嚴(yán)重的負(fù)面影響[1-2]?？招纳徸硬葜饕ㄟ^(guò)地上部的匍匐莖和地下莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，具有超強(qiáng)的無(wú)性繁殖能力[3-4]。在水體中漂浮生長(zhǎng)的時(shí)候，其匍匐莖節(jié)部可產(chǎn)生大量不定根，然而，當(dāng)空心蓮子草匍匐莖的不定根有機(jī)會(huì)接觸到土壤后，其不定根在土壤中可進(jìn)行不同程度的膨大生長(zhǎng)，形成貯藏根[5]，這種貯藏根是陸生型空心蓮子草越冬、繁殖和種群擴(kuò)散的重要保障[6-7]?？梢娍招纳徸硬莸母禈?gòu)型隨環(huán)境條件的變化而變化，研究空心蓮子草根系生長(zhǎng)發(fā)育，尤其是貯藏根的發(fā)育，對(duì)于揭示空心蓮子草成功入侵的機(jī)制具有重要作用[8-9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)對(duì)空心蓮子草根系的研究，主要采用莖段扦插盆栽育苗的方法，例如對(duì)根系生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的研究[6]、環(huán)境條件尤其是水分狀況對(duì)根系發(fā)生的影響[8]、外源激素施用對(duì)貯藏根生長(zhǎng)的研究[10]等，莖段扦插盆栽育苗能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得相對(duì)均勻一致的空心蓮子草幼苗，為開展系列控制實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】莖段扦插試驗(yàn)存在局限性，例如，難以直接觀察植物根系生長(zhǎng)情況，在試驗(yàn)中可能受到病蟲害和邊緣效應(yīng)的影響等?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】Shekhawat等[11]使用組織培養(yǎng)方法研究了空心蓮子草大規(guī)模繁殖技術(shù)，主要為開展藥用化學(xué)物質(zhì)提取做準(zhǔn)備，但其操作復(fù)雜，成本較高。本文試圖利用組織培養(yǎng)體系，尋求一種操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)有效的空心蓮子草莖段組織培養(yǎng)方法，對(duì)其根系發(fā)育情況進(jìn)行研究，為揭示空心蓮子草的入侵機(jī)制和開展入侵防控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2019年12月23號(hào)，在荊州市西郊田間溝渠采集長(zhǎng)約4 cm生長(zhǎng)健壯的空心蓮子草的帶節(jié)莖段，去葉，清洗干凈用流水沖洗30 min后，使用體積分?jǐn)?shù)75%酒精震蕩沖洗1 min，再用0.1%升汞進(jìn)行震蕩沖洗6 min消毒，最后用無(wú)菌水沖洗5遍，每次沖洗1 min，使用MS培養(yǎng)基進(jìn)行接種。待外植體萌出1~2 cm的新枝后，將帶節(jié)新枝切下并接入MS培養(yǎng)基，此為第1代無(wú)菌苗；待無(wú)菌苗長(zhǎng)出3節(jié)以上后，切成帶一節(jié)的含葉莖段接入培養(yǎng)基，此帶一節(jié)的莖段長(zhǎng)成的無(wú)菌苗為第2代，依次進(jìn)行，本試驗(yàn)使用第3代無(wú)菌苗作為組培試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮了多種因素，按單因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。首先降低MS培養(yǎng)基中鉀離子濃度（降至標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基60%，含硝酸銨1 971 mg/L，硝酸鉀1 090 mg/L），培養(yǎng)基的凝固劑分別使用卡拉膠3 g/L和普通瓊脂8 g/L；外植體莖段分帶節(jié)和不帶節(jié)處理，不帶節(jié)處理中外植體長(zhǎng)為2 cm，接種深度為0.9 cm左右；帶節(jié)外植體的節(jié)下部分設(shè)置3種長(zhǎng)度，為1.5，0.5，0.1 cm，接入培養(yǎng)基的深度分別為1.4，0.4，0.1 cm；外植體莖段分別進(jìn)行芽朝上或芽朝下（正插和倒插）方式進(jìn)行接種；節(jié)下部分長(zhǎng)度為1.5 cm的外植體接入培養(yǎng)基的深度設(shè)置3種處理，為0.4，0.9，1.4 cm。實(shí)驗(yàn)所用的器皿為試管(長(zhǎng)23 cm，直徑為3 cm，容積100 mL)，每支試管均含培養(yǎng)基約60 mL左右，外植體的節(jié)上部分長(zhǎng)度均為1 cm，節(jié)間直徑為0.15 cm左右，去掉葉片后保持垂直或略帶傾斜接入培養(yǎng)基，每支試管接入外植體（扦插）一個(gè)，培養(yǎng)溫度為（26±1）℃，光照時(shí)長(zhǎng)14 h，外植體的地上部分的光照強(qiáng)度為1 600~1 800 lx，地下部分（根系生長(zhǎng)部分用泡沫紙板進(jìn)行遮光）的光照強(qiáng)度為270 lx左右。實(shí)驗(yàn)共9個(gè)處理，每個(gè)處理共10個(gè)重復(fù)，共培養(yǎng)9×10=90個(gè)植株。

1.3 測(cè)量方法與數(shù)據(jù)分析

1.3.1 根系形態(tài)分析 在空心蓮子草的外植體生長(zhǎng)70 d進(jìn)行取樣，根據(jù)外植體的成活情況，每個(gè)處理取樣數(shù)為5株，其余外植體繼續(xù)培養(yǎng)觀察。每株空心蓮子草從試管中取出并洗凈后，統(tǒng)計(jì)空心蓮子草節(jié)間和節(jié)處的生根情況（總生根數(shù)和直徑≥0.15 mm的根數(shù)）和葉片數(shù)（葉片長(zhǎng)度≥0.5 cm的片數(shù)），使用游標(biāo)卡尺（精度0.01 mm）測(cè)量直徑≥0.15 mm不定根最大橫徑處的直徑、莖段的直徑（側(cè)莖由下向上第4至第5節(jié)處節(jié)間的橫徑）和長(zhǎng)度。使用萬(wàn)深LA-S根系分析獨(dú)立版植物根系分析儀對(duì)根系進(jìn)行掃描，測(cè)量的指標(biāo)包括節(jié)處不定根系的總長(zhǎng)度、總體積和總表面積，節(jié)間處的不定根的總長(zhǎng)度、總體積和總表面積。最后，將每株植株分成莖葉和根分別放入GZX-9140烘箱中，80 ℃下烘干至恒質(zhì)量（48 h），用電子天平（METTLER TOLEDO PL303-IC（精度0.001））分別稱量地上莖葉干質(zhì)量、根系干質(zhì)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用WPS和SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析，利用單因素分析法（one-way ANOVA）法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

表1 9個(gè)處理的處理方法

2 結(jié)果與分析

2.1 空心蓮子草匍匐莖段萌發(fā)情況

絕大多數(shù)的外植體的萌動(dòng)順序?yàn)閭?cè)芽萌發(fā)、節(jié)間處產(chǎn)生不定根、節(jié)處產(chǎn)生不定根，少許外植體側(cè)芽萌動(dòng)后，先節(jié)處產(chǎn)生不定根后節(jié)間處產(chǎn)生不定根。除A4處理外，其他處理的空心蓮子草莖段（外植體）的節(jié)部均能產(chǎn)生不定根；除A3和A6處理外，其它處理的外植體節(jié)下部的節(jié)間處（以下統(tǒng)稱節(jié)間）均可生長(zhǎng)出不定根（圖1），但生長(zhǎng)20~25 d后，觀察到許多不定根尖端變黑，并停止伸長(zhǎng)。外植體節(jié)部、節(jié)間及截口處均沒有產(chǎn)生愈傷組織，絕大多數(shù)的外植體節(jié)上部逐漸枯萎?？梢?，在組培條件下，空心蓮子草匍匐莖段能夠成功萌發(fā)植株。

A、B為生長(zhǎng)的第14天的A1處理，外植體截口上部（節(jié)間處）產(chǎn)生不定根；C為A4處理，外植體不帶節(jié)，能生長(zhǎng)出不定根，但沒有產(chǎn)生芽；D為A2處理中，外植體生長(zhǎng)產(chǎn)生的空心蓮子草；可見外植體節(jié)部和節(jié)間處均有不定根產(chǎn)生

2.2 不同凝固劑對(duì)空心蓮子草生長(zhǎng)情況的影響

用瓊脂作為凝固劑，空心蓮子草的不定根總數(shù)、節(jié)部不定根數(shù)、節(jié)間處的不定根數(shù)顯著高于卡拉膠凝固劑處理（0.05），而根冠比則顯著降低（<0.05）。瓊脂凝固劑處理中空心蓮子草地上葉片數(shù)、莖段長(zhǎng)度、地上干質(zhì)量高于卡拉膠處理，但差異不顯著（>0.05）（表2）。瓊脂處理中節(jié)間處的不定根有膨大現(xiàn)象發(fā)生。這表明，瓊脂凝固劑有利于空心蓮子草不定根發(fā)生，并且有利于誘導(dǎo)不定根的膨大。

表2 不同凝固劑中空心蓮子草的生長(zhǎng)情況（70 d）

表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±誤差，同列后的不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（<0.05）

2.3 外植體的接種方向?qū)招纳徸硬萆L(zhǎng)情況的影響

空心蓮子草莖段無(wú)論正插還是倒插在培養(yǎng)基上，莖段均能生出側(cè)芽和不定根。倒插方式的外植體節(jié)間處沒有不定根發(fā)生，僅節(jié)處能產(chǎn)生不定根，其根系干質(zhì)量平均為（0.004 7±0.001 6）g/株，顯著低于正插的空心蓮子草根系干質(zhì)量（0.006 6±0.000 4）g/株（0.05）。2種接種方式對(duì)實(shí)驗(yàn)中其余指標(biāo)沒有顯著差異（>0.05）。這表明在組培體系中空心蓮子草莖段萌發(fā)對(duì)極性不存在依賴性。

2.4 外植體節(jié)下部分莖段的長(zhǎng)度對(duì)空心蓮子草生長(zhǎng)的影響

外植體節(jié)下長(zhǎng)1.5 cm處理（A7）的不定根總數(shù)、節(jié)部不定根總長(zhǎng)度和總表面積、節(jié)間處不定根的總體積、根系干質(zhì)量、葉片數(shù)、莖葉干質(zhì)量、匍匐莖直徑和長(zhǎng)度都顯著高于其他處理（0.05），這些指標(biāo)隨著外植體節(jié)下部分莖段長(zhǎng)度的增加呈現(xiàn)出遞增的趨勢(shì)。外植體節(jié)下部莖段長(zhǎng)0.1 cm時(shí)，節(jié)間處不發(fā)生不定根；外植體節(jié)下部莖段長(zhǎng)0.5，1，1.5 cm處理中，節(jié)間處不定根的總體積存在顯著差異（0.05），但在數(shù)量上沒有顯著差異（>0.05）（表3)，節(jié)間處不定根沒有發(fā)現(xiàn)膨大現(xiàn)象。由此可見，空心蓮子草節(jié)下部分長(zhǎng)度對(duì)其根系和莖葉部分生長(zhǎng)具有重要影響。

2.5 外植體節(jié)下部分的扦插深度對(duì)空心蓮子草的生長(zhǎng)影響

節(jié)下部長(zhǎng)度為1.5 cm的外植體，當(dāng)接入培養(yǎng)基的深度為1.4 cm的時(shí)候（A7），節(jié)部不定根總長(zhǎng)度和總表面積、根系干質(zhì)量、葉片數(shù)、莖葉干質(zhì)量、匍匐莖的直徑和長(zhǎng)度顯著高于接種深度為0.5 cm處理（A9）（0.05），而根冠比則顯著降低（0.05）（表4）。這說(shuō)明，空心蓮子草外植體扦插深度較深時(shí)，有利于其根系和地上部分生長(zhǎng)。

表3 空心蓮子草外植體節(jié)下部分莖段的長(zhǎng)度對(duì)其生長(zhǎng)的影響（70 d）

表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±誤差，同行后的不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（<0.05）

表4 空心蓮子草外植體節(jié)下部分的接種深度對(duì)其生長(zhǎng)的影響（70 d）

表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±誤差，同列后的不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（<0.05）

當(dāng)外植體繼續(xù)生長(zhǎng)的80 d后，即實(shí)驗(yàn)處理150 d后觀察，發(fā)現(xiàn)外植體生出的側(cè)枝上的節(jié)間也會(huì)產(chǎn)生不定根，不定根出現(xiàn)明顯的膨大現(xiàn)象（圖2A），在接種深度為0.5 cm的處理中（A9），外植體節(jié)部和節(jié)間處產(chǎn)生的不定根均具有明顯的膨大現(xiàn)象（圖2B）。

A為A8處理生長(zhǎng)150 d后根系生長(zhǎng)情況，節(jié)間處不定根明顯膨大；B為A9處理生長(zhǎng)150 d后根系生長(zhǎng)情況，節(jié)處和節(jié)間處不定根均存在明顯的膨大現(xiàn)象

3 討論與結(jié)論

綜上所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，空心蓮子草莖段比較理想的組培條件為：帶1節(jié)長(zhǎng)度為4 cm的去葉空心蓮子草莖段，使用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡1 min，0.1%升汞浸泡6 min消毒，在MS培養(yǎng)基中連續(xù)繼代培養(yǎng)，采用第3代無(wú)菌苗的莖段作為外植體，在含有普通瓊脂的MS培養(yǎng)基（鉀離子濃度降至標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基60%，含硝酸銨1 971 mg/L，硝酸鉀1 090 mg/L）條件下，節(jié)下部長(zhǎng)度為1.5 cm帶節(jié)外植體正向扦插深度為1.4 cm時(shí)，可以獲得生長(zhǎng)良好的空心蓮子草植株。

已有文獻(xiàn)[6,12-13]認(rèn)為，空心蓮子草莖段不定根是從節(jié)部發(fā)出，實(shí)驗(yàn)中，除外植體的節(jié)下部莖段長(zhǎng)度為0.1 cm和培養(yǎng)基中外植體接種方向?yàn)榈共逄幚硗?，其他處理中均發(fā)現(xiàn)外植體的下部截口上方的莖段能夠不經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)直接生長(zhǎng)出不定根，即出現(xiàn)節(jié)間生根現(xiàn)象，節(jié)間生根一般早于節(jié)部生根。這表明空心蓮子草莖段在組培條件下，具有較強(qiáng)的生根能力，不定根發(fā)生部位比較廣泛。

外植體培養(yǎng)70 d，發(fā)現(xiàn)有部分不定根出現(xiàn)膨大趨勢(shì)。繼續(xù)培養(yǎng)80 d（共150 d），筆者觀察到空心蓮子草不定根出現(xiàn)明顯膨大。這說(shuō)明組培條件下，空心蓮子草具有膨大形成貯藏根的能力。因此，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了研究空心蓮子草莖段不定根膨大的組織培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步在組培條件下開展空心蓮子草貯藏根的形成機(jī)理提供依據(jù)。

植物的根系生長(zhǎng)會(huì)受到內(nèi)源激素的影響。內(nèi)源激素主要由植物的根尖、莖尖和種子等組織進(jìn)行合成，存在從頂部向基部的極性運(yùn)輸情況[14]，有研究[15]表明植物的莖段中也存在內(nèi)源激素。在實(shí)驗(yàn)中，筆者觀察到外植體的側(cè)芽先伸出，然后再產(chǎn)生不定根；倒插時(shí)節(jié)間發(fā)生不定根，不帶節(jié)外植體的節(jié)間處也能生出不定根。這些現(xiàn)象可能與內(nèi)源激素存在一定關(guān)系?？招纳徸硬萦浊o的莖尖能夠合成內(nèi)源激素并將其進(jìn)行極性運(yùn)輸促使外植體節(jié)下部莖段生出不定根，除此之外，空心蓮子草的不帶節(jié)莖段中可能也含有內(nèi)源激素，從而誘導(dǎo)空心蓮子草的節(jié)間和節(jié)處能夠發(fā)生不定根。

在盆栽育苗實(shí)驗(yàn)中，Dong等[16-17]認(rèn)為空心蓮子草節(jié)間長(zhǎng)度的增加顯著提高了植株的存活率且有利于地上部分的生長(zhǎng)（生物量、莖長(zhǎng)和葉片數(shù)）。組培條件下，也發(fā)現(xiàn)外植體節(jié)下部長(zhǎng)度能顯著影響幼苗的生長(zhǎng)。一定范圍內(nèi)，節(jié)下部越長(zhǎng)，越有利于空心蓮子草幼苗的生長(zhǎng)。其原因可能是空心蓮子草莖段也是一個(gè)重要的貯藏器官[17-18]，可以儲(chǔ)存可溶性碳水化合物和蛋白質(zhì)[19-20]等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于幼苗的生長(zhǎng)。

空心蓮子草在組培實(shí)驗(yàn)上的成功有助于進(jìn)一步對(duì)其從生理方向進(jìn)行研究。筆者發(fā)現(xiàn)節(jié)間處生根現(xiàn)象在空心蓮子草中較為普遍，這一發(fā)現(xiàn)有助于揭曉空心蓮子草的入侵機(jī)理，在日后的防治中能夠更加精準(zhǔn)地對(duì)其進(jìn)行防控。

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Root Development of Stolon Segment ofin Tissue Culture

GUO Yaqi, YAO Zhen, CHEN Zhongyi*

(College of Horticulture and Gardening, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China)

Alternanthera philoxeroides is a worldwide malignant invasive weed. The formation of storage roots plays an important role in its invasion. It is helpful to study the occurrence and expansion of adventitious roots for prevention and control.In this paper, a tissue culture system was used to conduct aseptic culture of the stolon segments of.The culture conditions mainly considered the type of medium coagulant, whether the explants had nodes or not, the length of stem segments under explants nodes, the cutting method and cutting depth of explants.The ideal tissue culture conditions for the stem segments ofwere as follows: with a 4 cm long stem segment and have one node, soaked in 75% alcohol for 1 min, soaked in 0.1% HgCl for 6 min for disinfection, continuously subcultured in MS medium, and the stem segments of the third generation aseptic seedlings were used as explants, in the condition of MS medium containing common agar (potassium ion concentration reduced to 60% of the standard medium), when the length of the lower part of the node was 1.5cm and the forward cutting depth of the explant with node was 1.4cm, the good growth ofcould be obtained.It was found that adventitious roots could grow directly from the stem segment above the lower section of explants without callus induction, that is, the phenomenon of internode rooting appeared. When the explants were cultured for 70 days, it was found that some adventitious roots expanded. After cultured for 80 days, the adventitious roots of Alternanthera philoxeroides were obviously expanded.In this study, the tissue culture system of adventitious root expansion of stem segments of Alternanthera philoxeroides was successfully constructed, which laid a foundation for further research on the formation mechanism of storage roots of Alternanthera philoxeroides under the condition of tissue culture.

Alternanthera philoxeroides; stolon; adventitious roots; tissue culture

S451

A

2095-3704（2021）02-0212-07

2021-05-03

2021-05-25

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013CFB391）和濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放基金項(xiàng)目（KFT201907）

郭雅琪（1997—），女，碩士生，主要從事植物入侵生態(tài)學(xué)研究，1207410179@qq.com；*通信作者：陳中義，教授，博士，czy@yangtzeu.edu.cn。

郭雅琪, 姚振, 陳中義. 組培條件下空心蓮子草匍匐莖段根系發(fā)育的研究[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2021, 44(2): 212-218.