韓富慶，史芳芳

快速鑒定草莓枯萎病的LAMP檢測技術(shù)

韓富慶，史芳芳*

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830063）

【目的】建立草莓枯萎病的鐮刀菌快速檢測方法?！痉椒ā坷铆h(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）針對鐮刀菌保守區(qū)域ITS設(shè)計一套LAMP擴增引物，利用Bst DNA聚合酶完成LAMP擴增反應(yīng)，對7種常見病原菌進行檢測，分析LAMP引物的特異性；比較LAMP與傳統(tǒng)PCR方法的敏感性?！窘Y(jié)果】建立的LAMP法能夠特異性的檢測尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌，并且檢測靈敏度為1.0×10-4ng/μL，是普通PCR檢測靈敏度的1 000倍。【意義】試驗所建立的草莓枯萎病快速LAMP檢測方法，具有靈敏度高、快速及簡便的優(yōu)點，可以向基層單位推廣使用。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增；鐮刀菌；炭疽菌

【研究意義】草莓(Duch.)屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，果肉鮮美多汁，堪稱“水果皇后”。近年來，草莓種植面積逐年增大，品種不斷更新，頻繁地調(diào)種、引種以及連作，導(dǎo)致草莓病害發(fā)生較為普遍。目前，影響草莓生產(chǎn)的主要病害是草莓枯萎病[1-2]，鑒定和檢測草莓病害的主要方法是形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)PCR擴增法，這兩種方法中，形態(tài)學(xué)鑒定方法耗時長，需要具備專業(yè)知識，且有時對于不常見病原菌會判定不準(zhǔn)確，而分子生物學(xué)檢測方法需要昂貴的儀器設(shè)備，且對檢測產(chǎn)物需要測序才能判定為是何種病原菌感染[3]，因此，亟需一種能夠在發(fā)病初期或者土壤中進行早期快速檢測的技術(shù)，以便及時采用有針對性的有效防治措施來控制病害的發(fā)生和傳播。【前人研究進展】LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)）作為一種新的核酸擴增方法，具有檢測速度快、操作簡單和靈敏度高等優(yōu)點[4]。該項技術(shù)是在60～65 ℃恒溫下擴增，只要恒溫水浴鍋即可，無需特殊儀器，所以操作方便，對設(shè)備要求低；且可用肉眼即可觀察實驗結(jié)果，檢測周期非常短，適合于基層農(nóng)業(yè)單位對田間草莓病害進行快速鑒定。目前，國內(nèi)僅有對草莓炭疽病鑒定的LAMP檢測技術(shù)的研究[5]?！颈狙芯壳腥朦c】傳統(tǒng)的病原菌檢測技術(shù)、免疫學(xué)檢測技術(shù)已經(jīng)很難明確地鑒定病原菌且耗時長、靈敏度低，而目前大多數(shù)分子生物學(xué)檢測技術(shù)費時、費力、準(zhǔn)確性低，且不能在病害潛伏期和初期作出診斷，很難對病害發(fā)生進行及時的監(jiān)測和有效控制[6-7]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文首次對鐮刀菌引起的草莓枯萎病病害進行LAMP快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試菌株 本研究供試菌株為茶樹炭疽、膠孢炭疽、草莓?；图怄哏牭毒?、馬鈴薯鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、惡疫霉菌。種名、來源及數(shù)量見表1。

表1 試驗所用菌株及來源

1.1.2 儀器與試劑 Bst DNA聚合酶、DNA提取試劑盒和恒溫水浴鍋均購自上海生工生物公司；SYBR熒光顯色劑購自索萊寶生物公司；PCR擴增儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂儀器；電泳儀購自北京市六一儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌基因組DNA的提取 挑取平板培養(yǎng)的適量病原菌菌絲，采用DNA-EA Reagents V ALL-DNA-FAST-Out裂解液（上海生工生物）提取病原真菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 土壤基因組DNA 提取采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)病原真菌，在搖床上震蕩5 d后產(chǎn)生孢子，利用血球計數(shù)板進行計數(shù)，使其達(dá)到1×107個分生孢子后與2 g左右滅菌營養(yǎng)土充分混合，采用土壤真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物）提取含病原菌分生孢子的土壤基因組DNA，未接真菌病原菌孢子的滅菌營養(yǎng)土提取的DNA作為空白對照。

1.2.3 患病草莓植株組織DNA的提取 將消毒后質(zhì)量約1 g左右的草莓病株根莖部，置于液氮預(yù)冷的研缽中，將其迅速研磨成粉末狀后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的滅菌離心管中，用（上海生工生物）植物基因組DNA提取試劑盒提取患病植株真菌基因組DNA，同時提取健康草莓植株組織DNA作為空白對照，以接種膠孢炭疽菌和茶樹炭疽菌引起的炭疽病草莓病株作為陰性對照。

1.2.4 鐮刀菌屬特異性LAMP引物設(shè)計及擴增 在GenBank中將鐮刀菌ITS區(qū)域與炭疽菌進行比對，選擇具有特異性的區(qū)域，采用在線的PrimerExplorer V5 LAMP引物專用設(shè)計軟件，針對鐮刀菌ITS基因片段設(shè)計一套特異性LAMP引物，如表2所示。

1.2.5 LAMP擴增反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化 LAMP反應(yīng)體系（25 μL）包括：內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3、環(huán)引物L(fēng)oop、dNTPs、MgSO4、Betain、10×Buffer緩沖液、DNA聚合酶、DNA模板、滅菌水補足體系。選擇對LAMP體系中的關(guān)鍵因素進行優(yōu)化，包括鎂離子濃度（4，6，8，10 mmol/L）、dNTP濃度（1.0，1.2，1.4，1.6 mmol/L）、環(huán)引物濃度比（0.4，0.8，1.2，1.6 μmol/L）、甜菜堿濃度（0.4，0.8，1.2，1.6 mol/L）、Bst DNA聚合酶（4，6，8，12 U/μL），根據(jù)反應(yīng)后的條帶有無和染料顏色變化選擇最合適的條件，建立最佳的LAMP反應(yīng)擴增體系。

表2 鐮刀菌ITS基因LAMP引物序列

建立最佳LAMP擴增反應(yīng)體系后，將該體系分別在60～68 ℃條件下進行梯度PCR擴增反應(yīng)，確定其最適反應(yīng)溫度，并在篩選出的最適反應(yīng)溫度下，進行 LAMP擴增反應(yīng)，擴增時間分別為15，30，45，60 min 4個時間，反應(yīng)完后加入SYBR熒光染料，觀察顏色變化，同時用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，確定LAMP反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.2.6 LAMP檢測鐮刀菌屬特異性 按照1.2中不同真菌DNA提取方法，提取待測菌株的DNA，分別作為LAMP等溫擴增反應(yīng)的模板，篩選出最佳DNA模板的濃度，將其擴增產(chǎn)物加入熒光染料進行顯色反應(yīng)，顯色完后進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察其實驗結(jié)果。

1.2.7 LAMP及PCR擴增方法檢測鐮刀菌靈敏度的比較 將病原菌DNA進行10倍梯度逐級稀釋，分別獲得DNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同濃度稀釋液作為模板，利用所建立的LAMP反應(yīng)體系和條件進行PCR擴增和LAMP擴增靈敏度對比。分別取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察實驗結(jié)果。

建立PCR法檢測鐮刀菌的反應(yīng)體系為25 μL：PCR Master混合物12.5 μL，上下游引物（ITS1/ITS4引物）各1 μL，1.0 μL模板DNA，用滅菌水補足體系至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物，在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增條帶大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓植株枯萎病患病癥狀

枯萎病在草莓植株上的主要表現(xiàn)癥狀為：早期草莓側(cè)枝及老葉呈現(xiàn)萎焉狀態(tài)，中心葉片無變化，根及根莖維管束內(nèi)部為褐色；而地上部分明顯呈現(xiàn)矮化萎縮狀，并出現(xiàn)大小葉不對稱，有的葉柄變紅色，葉片邊緣變的焦黃或萎焉，逐漸發(fā)展到后期整個植株倒在栽培壟上，最終整株萎焉而枯死。

2.2 LAMP反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

不同方法提取的DNA均可以作為反應(yīng)模板，通過優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，確立了最終LAMP反應(yīng)體系為：F3及B3的濃度分別為0.2 μmol/L，F(xiàn)IP和BIP的濃度分別為1.6 μmol/L，環(huán)引物L(fēng)oop的濃度為0.8 μmol/L，MgSO4的濃度為8 mmol/L，dNTPs的濃度為1.4 mmol/L，Betain的濃度為0.8 mol/L，DNA聚合酶（8U）的濃度為1.0 μL，10×Buffer的濃度為2.5 μL及1 μL的DNA模板。最優(yōu)反應(yīng)條件為：在65 ℃恒溫水浴條件下,采用優(yōu)化的LAMP體系擴增45 min。

采用上述最優(yōu)反應(yīng)體系進行最適反應(yīng)溫度的篩選，其結(jié)果表明，在68.0，67.6，67.0，66.1，65.5，65.0，64.1和63.0 ℃ 8個不同的反應(yīng)溫度下進行擴增，當(dāng)加入熒光染色劑SYBR后反應(yīng)液由橙色變?yōu)闊晒饩G色，且產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，只有在65 ℃條件下可見瀑布狀梯形條帶，故確定LAMP反應(yīng)溫度為65 ℃（圖1）。在上述最優(yōu)反應(yīng)體系下，進行最適擴增時間的篩選，結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)45 min時，產(chǎn)物溶液呈現(xiàn)明顯的熒光綠色，對應(yīng)的凝膠電泳條帶呈現(xiàn)瀑布狀條帶，故確定LAMP反應(yīng)時間為45 min（圖2）。

A：基于SYBR Green I 顯色的不同溫度LAMP產(chǎn)物檢測；B：LAMP產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳1～8：68.0 ℃，67.6 ℃，67.0 ℃，66.1℃，65.5℃，65.0 ℃，64.1 ℃，63.0 ℃

A：基于SYBR Green I顯色的LAMP產(chǎn)物檢測；B：LAMP產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳1：15 min；2：30 min；3：45 min；4：60 min

2.3 LAMP檢測鐮刀菌的特異性

尖孢鐮刀菌、草莓專化型尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌為模板的待測病原菌呈現(xiàn)出LAMP產(chǎn)物所特有的熒光綠色（圖3）和梯型條帶（圖4），以滅菌水為模板的空白組以及其它病原菌陰性組，則未出現(xiàn)梯型條帶且顏色反應(yīng)呈橙黃色。

1～8分別為鏈格孢菌、惡疫霉菌、草莓?；图怄哏牭毒⒓怄哏牭毒?、茶樹炭疽菌、腐皮鐮刀菌、膠孢炭疽菌、空白對照顯色結(jié)果

2.4 LAMP及PCR法檢測鐮刀菌靈敏度的比較

將DNA原液（10 ng/μL）、不同DNA濃度稀釋液進行PCR和LAMP擴增反應(yīng)后，其中DNA原液，10-1和10-2稀釋液3個濃度進行PCR反應(yīng)后，可以檢測到清晰的目的條帶，10-3和10-4稀釋液PCR產(chǎn)物為非特異性條帶，10-5和10-6則沒有擴增出條帶（圖5A）。DNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5稀釋液6個濃度作為LAMP反應(yīng)模板時，均可以看到明顯的熒光綠色，只有10-6稀釋液作為DNA模板的LAMP產(chǎn)物的顯色反應(yīng)呈現(xiàn)橙色（圖5B）。因此，LAMP檢測草莓樣本中鐮刀菌靈敏度可以達(dá)到皮克（pg）級以上，非常有利于草莓枯萎病的快速檢測應(yīng)用。

M：DNA marker；1～7分別為鏈格孢菌、惡疫霉菌、草莓專化型尖孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、茶樹炭疽菌、腐皮鐮刀菌、膠孢炭疽菌LAMP擴增結(jié)果

A：M，DNA marker；1～7，原液稀釋液106、105、104、103、102、101、DNA原液；B：1～7，原液稀釋液106、105、104、103、102、101、DNA原液

3 討 論

3.1 LAMP檢測靈敏度高

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（LAMP）[8-12]所需DNA模板濃度比普通PCR方法所需DNA模板濃度還要低，相比PCR擴增方法，本研究對于培養(yǎng)病原菌基因組DNA采用5 min快速提取法，獲得的DNA濃度低于10 ng/uL，微量分光光度計對于濃度低于10 ng/uL的DNA不能檢測出其濃度，但利用該方法提取的DNA稀釋至10×10-5ng/μL濃度（即達(dá)到0.1 pg級）進行LAMP技術(shù)擴增，其產(chǎn)物在凝膠電泳中呈現(xiàn)清晰的梯狀條帶；但是普通PCR最低檢測濃度為10×10-2ng/μL。近幾年有關(guān)于實時熒光LAMP技術(shù)檢測病原菌的報道，該技術(shù)是對LAMP技術(shù)的改良，通過實時熒光檢測系統(tǒng)記錄熒光信號，監(jiān)測整個反應(yīng)進度，進而分析反應(yīng)結(jié)果。但是該技術(shù)需要昂貴的科研儀器和試劑，不適用于基層單位開展科研工作，其優(yōu)勢只在于可以定量實時監(jiān)測整個反應(yīng)過程，且靈敏度只是普通LAMP技術(shù)的10倍，靈敏度上的優(yōu)勢不明顯。本研究中添加熒光染料，實現(xiàn)了觀測結(jié)果的可視化，便于基層人員對結(jié)果進行判讀，操作簡單方便[13]。

3.2 檢測模板范圍廣

有研究顯示，利用3種模板，即發(fā)病植株組織、分離培養(yǎng)物菌絲、含有病原菌土壤分別提取DNA進行LAMP擴增，均獲得良好效果[14]。不同科研單位可根據(jù)條件選擇不同模板進行擴增，基層單位的實驗條件有限，可以直接從發(fā)病植株根際土壤和發(fā)病植株中提取的病原菌DNA進行LAMP擴增鑒定，對于草莓病原菌實時監(jiān)測和前期預(yù)警具有重要作用。本研究直接鑒定草莓植株不同部位的鐮刀菌，鑒定周期不超過1 h，非專業(yè)人員均可操作，鑒定方法適應(yīng)性強；其中DNA快速檢測試劑盒價格低廉、方法簡單，平均提取單個樣品DNA大約需要花費2元左右，適合向基層推廣。

3.3 首次利用LAMP技術(shù)檢測草莓枯萎病菌

傳統(tǒng)病原菌形態(tài)學(xué)鑒定耗時費力，近年來的分子生物學(xué)技術(shù)為病原菌檢測和鑒定提供了新的方法，但是需要專業(yè)技術(shù)人員和昂貴的科研儀器。目前在檢測草莓病害和病毒方面采用的大多數(shù)是分子生物學(xué)PCR擴增法，用到LAMP擴增技術(shù)的較少[5,7,15]，尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌是草莓種植過程中常見導(dǎo)致枯萎病的病原菌，本研究利用基于ITS基因設(shè)計的LAMP引物，可快速、特異檢測鐮刀菌屬病原真菌在草莓植株體內(nèi)是否存在，含有鐮刀菌的菌株呈現(xiàn)可視化的綠色熒光，屬內(nèi)其他菌則顯示橘黃色。本文首次利用LAMP技術(shù)檢測草莓枯萎病，可為草莓病害檢測領(lǐng)域的科研工作者和基層技術(shù)人員提供簡便、快速的檢測方法。已有研究報道尖孢鐮刀菌的LAMP檢測技術(shù)，但均為其它作物的專化型尖孢鐮刀菌檢測，引起枯萎病的不只有尖孢鐮刀菌，還有鐮刀菌屬的其它鐮刀菌種，因此，本文的研究擴大了檢測范圍。

4 結(jié) 論

本研究以SYBR GreenⅠ為指示劑，根據(jù)草莓鐮刀菌特異的ITS序列設(shè)計了1組LAMP引物，并對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行了優(yōu)化；特異性實驗證實該體系僅對鐮刀菌呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，靈敏度實驗顯示最低檢測限為10×10-5ng/uL。本研究所建立的草莓枯萎病LAMP可視化快速檢測方法，具有特異性強、耗時短、靈敏度高的特點，為在生產(chǎn)上早期快速診斷草莓枯萎病提供技術(shù)支持。

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Rapid Identification ofWilt in Strawberries Using LAMP Detection Technique

HAN Fuqing, SHI Fangfang*

(The Institute of Agricultural Sciences of the 12th Division, Xinjiang Production and Construction Corps, Urumchi 830063, China)

A rapid detection method forwilt in strawberries was established.A set of LAMP amplification primers were designed for the conserved region of ITS inspp. to detect seven common pathogens by using loop-mediated isothermal amplification (LAMP), and LAMP amplification reaction was completed by using Bst DNA polymerase. Also, the specificity of LAMP primer was analyzed, and the sensitivity between LAMP and PCR was compared.The results showed that LAMP method could detectand, with the detection sensitivity of 1.0×10-4ng/μL, which was 1 000 times that of conventional PCR.The rapid detection method LAMP forwilt in strawberries developed in this experiment had the advantages of high sensitivity, rapidity and simplicity, and could be popularized to grass-root units.

loop-mediated isothermal amplification;;

S668.4

A

2095-3704（2021）02-0153-06

2021-04-27

2021-06-03

兵團中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才計劃項目（2018CB030)

韓富慶（1974—），男，農(nóng)藝師，主要從事植物栽培研究；*通信作者：史芳芳，高級農(nóng)藝師，451784039@qq.com。

韓富慶, 史芳芳. 快速鑒定草莓枯萎病的LAMP檢測技術(shù)[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2021, 44(2): 153-158.