王志，李彥卿，莊偉，陳震，劉金樂，柳東，趙安琪，呂永坤，熊文龍，許敬亮，應(yīng)漢杰

（1 鄭州大學(xué)化工學(xué)院，河南鄭州450001； 2 鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450001； 3 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211816； 4 信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南信陽464000； 5 鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450001）

引 言

微量元素如鉻、鈷、銅、碘、鐵、錳、鉬、硒和鋅等，對動(dòng)物的正常生命活動(dòng)起著尤為重要的作用，它們是細(xì)胞代謝、免疫調(diào)節(jié)、骨骼形成、酸堿平衡調(diào)節(jié)等生理活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)，也是很多激素和酶的必需成分或輔助成分[1-3]。雖然動(dòng)物對這些微量元素的需求量很少，但它們無法被其他營養(yǎng)物質(zhì)取代，微量元素?cái)z入過量或不足都會(huì)引起各種相關(guān)疾病的發(fā)生，甚至形成致命危害[4-5]。

對動(dòng)物而言，微量元素可分為兩大類，即無機(jī)微量元素和有機(jī)微量元素。無機(jī)來源是常見的硫酸鹽、氧化物、氯化物、碳酸鹽金屬元素，它們可能與胃腸道中的纖維、植酸、單寧、草酸、硅酸鹽或其他礦物質(zhì)相互作用，從而干擾其吸收[6]。另一類有機(jī)微量元素通常被稱為“螯合物”或“絡(luò)合物”，美國飼料管理官員協(xié)會(huì)（Association of American Feed Control Officials，AAFCO）于2001年制定出有機(jī)微量元素的定義，即微量元素與蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、小肽、多糖及其衍生物等有機(jī)分子通過共價(jià)鍵或離子鍵結(jié)合形成的絡(luò)合物或螯合物[7],有機(jī)微量元素分類見表1。與無機(jī)微量元素相比，有機(jī)微量元素有著無須配體、穩(wěn)定性好、吸收率高、滿足動(dòng)物高峰需求時(shí)速補(bǔ)、環(huán)境污染小等顯著優(yōu)勢[14-16]。

多糖作為一種天然高分子化合物，因其獨(dú)特的生物功能在抗氧化、抗腫瘤、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等方面具有很大的研究和應(yīng)用價(jià)值，已經(jīng)在食品、醫(yī)療、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[17–20]。多糖分子大多含有羥基、氨基和負(fù)氧基等活性基團(tuán)易與多種金屬離子通過化學(xué)和物理吸附形成復(fù)合物，發(fā)揮更優(yōu)異的生物學(xué)效果[21]。特別是自2020 年7 月1日“禁抗令”的頒布起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料。意味著抗生素將禁止使用，這將會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的生長生產(chǎn)周期增加、染病率上升等問題，而綠色、安全的多糖微量元素絡(luò)合物，可提高動(dòng)物免疫力，是替代抗生素使用的綠色動(dòng)物飼料添加劑[22-23]。近年來，糖生物學(xué)的研究快速發(fā)展，多糖微量元素絡(luò)合物的研究也進(jìn)入迅速發(fā)展階段。至今已有一些關(guān)于多糖微量元素絡(luò)合物方面的綜述報(bào)告，但多局限于局部方面的研究[21,24]。本文從多糖微量元素絡(luò)合物的制備工藝、結(jié)構(gòu)及在養(yǎng)殖業(yè)中的用途等方面系統(tǒng)綜述了多糖微量元素絡(luò)合物的最新研究進(jìn)展。

1 多糖微量元素物絡(luò)合物的合成

自然界中存在一些天然多糖微量元素復(fù)合物，研究者們已經(jīng)從植物中提取這些復(fù)合物，其中，富硒多糖因其抗腫瘤功能備受關(guān)注[25–29]，但這些復(fù)合物中微量元素含量很少，并且植物生長時(shí)間也相對較長[30]，因此，高效、高微量元素含量的人工合成多糖微量元素絡(luò)合物引起了廣泛關(guān)注。多糖含有多種活性基團(tuán)(如羥基、羧基和醛基等)，其復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)使這些活性基團(tuán)能與金屬鹽化合物反應(yīng)，得到相應(yīng)的多糖微量元素絡(luò)合物產(chǎn)品[31]。鋅、銅、硒、鐵和錳是動(dòng)物飼料中通常添加的關(guān)鍵微量元素[32]，它們都能夠通過對應(yīng)可溶性金屬鹽與多糖發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的方式與多糖結(jié)合，其中硒元素較為特殊，一般采用亞硒酸鈉（Na2SeO3）或者亞硒酸（H2SeO3）與多糖絡(luò)合。生物法合成多糖微量元素絡(luò)合物能夠?qū)o機(jī)微量元素轉(zhuǎn)化為有機(jī)微量元素，并且反應(yīng)過程溫和，具有良好的生物功能和安全性[21]，過程一般包括：（1）多糖的分離純化；（2）多糖與可溶性金屬鹽溶液（FeCl3、ZnSO4和CuCl2等）的絡(luò)合反應(yīng)，絡(luò)合物的合成工藝條件則需要根據(jù)多糖分子類型選擇；（3）多糖微量元素絡(luò)合物的純化[圖1（a）]。另外，產(chǎn)胞外多糖微生物在富含微量元素的人工培養(yǎng)基中生長，可快速合成多糖微量元素復(fù)合物[圖1（b）]，與植物多糖富集微量元素相比具有生產(chǎn)效率高、成本低的特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

表1 有機(jī)微量元素分類Table 1 Classification of organic trace elements

圖1 多糖微量元素絡(luò)合物的制備Fig.1 Preparation of polysaccharide trace element complexes

已報(bào)道的用于絡(luò)合微量元素的多糖根據(jù)來源可分為植物多糖、藻類多糖、微生物多糖及節(jié)肢動(dòng)物的殼聚糖，其中殼聚糖因其來源豐富和成本低廉，近年來已被廣泛報(bào)道和總結(jié)用于制備殼聚糖微量元素絡(luò)合物[24,33–35]，本研究主要總結(jié)植物多糖、藻類多糖和微生物多糖與微量元素絡(luò)合物的人工合成。

1.1 植物多糖與微量元素的絡(luò)合

多糖是植物細(xì)胞壁的主要組分，按照其功能不同可分為膳食多糖和中草藥多糖。前者主要包括淀粉、纖維素和果膠等多聚糖；后者一般特指從黃芪、當(dāng)歸、人參等中草藥中提取的一類活性多糖，因具有抑菌、抗病毒和促進(jìn)免疫等作用，在動(dòng)物飼料方面已經(jīng)得到應(yīng)用[36-39]，也是絡(luò)合微量元素的主要多糖類型（表2）。

根據(jù)絡(luò)合物的配位理論，多糖可通過羥基提供的孤對電子基團(tuán)與金屬元素發(fā)生配位反應(yīng)，釋放出H+，形成多糖微量元素絡(luò)合物。因此，溶液的酸堿度是影響絡(luò)合物微量元素含量的主要因素之一，可以決定多糖表面電荷和金屬離子形態(tài)。多糖絡(luò)合微量元素的反應(yīng)一般選擇pH 為8～10，因?yàn)閴A性條件下OH-濃度增加，會(huì)中和多糖表面H+，使多糖表面負(fù)電荷和活性位點(diǎn)數(shù)增加，有利于絡(luò)合。但是當(dāng)溶液為強(qiáng)堿性環(huán)境時(shí)，金屬離子可能會(huì)形成沉淀，因而阻止絡(luò)合物的形成[13]。硒元素的絡(luò)合一般選擇SeO2-3，因此絡(luò)合反應(yīng)的最佳pH 通常為弱酸性或者中性。此外，Wang 等[45]發(fā)現(xiàn)在白沙蒿多糖與硒的絡(luò)合反應(yīng)中，氯化鋇中的鋇離子會(huì)與羥基結(jié)合，提高其親核性，增強(qiáng)絡(luò)合反應(yīng)的效率，顯著提高硒的含量（圖2）。

1.2 海藻多糖與微量元素的絡(luò)合

圖2 硒與多糖絡(luò)合反應(yīng)機(jī)理示意圖Fig.2 Reaction mechanism of the synthesis of Se and polysaccharide comples

與高等植物類似，多糖也是藻類細(xì)胞壁的主要組分，可占細(xì)胞干重的4%～76%，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要單體有半乳糖、鼠李糖、木糖、精糖、糖醛酸等。藻類多糖，如瓊脂、褐藻酸鹽和卡拉膠，因親水性強(qiáng)和穩(wěn)定性好在動(dòng)物飼料中被用作穩(wěn)定劑和凝固劑[50-51]。此外，海藻多糖被證明具有多種生物功能，包括抗凝血、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗炎功能[52–54]。Chotigeat 等[55]將提取自褐藻的硫酸化巖藻多糖添加在飼料中喂養(yǎng)受病毒感染的對蝦，對蝦的存活率得到有效改善，最高可達(dá)93%。藻類多糖多數(shù)屬硫酸多糖，硫酸多糖因其具有強(qiáng)陰離子性，在中性條件下，對金屬反離子便具有很強(qiáng)的親和力。但是，多糖大分子的結(jié)構(gòu)特征與體系的流變性能有較大關(guān)系，因此需要不同的溫度來制備強(qiáng)絡(luò)合物。通過優(yōu)化絡(luò)合工藝條件，滸苔（Enteromorpha prolifera）多糖與硒和銅絡(luò)合的最佳溫度分別是80℃和70℃[56-57]，石莼（Inonotus obliquus）多糖與鐵絡(luò)合的最佳溫度是60℃[58]，而總狀蕨藻（Caulerpa racemosa）多糖在室溫下就可與硒形成強(qiáng)絡(luò)合物[59]，但幾種海藻多糖分子結(jié)構(gòu)差異如何影響配位反應(yīng)過程仍有待進(jìn)一步研究。

1.3 微生物多糖與微量元素的絡(luò)合

微生物多糖主要指微生物代謝過程產(chǎn)生的胞外多糖和莢膜多糖，特別是那些被認(rèn)為安全（generally recognised as safe，GRAS）的微生物或者益生菌生產(chǎn)的多糖應(yīng)用于微量元素絡(luò)合，很容易被審批用作飼料添加劑。我國農(nóng)業(yè)部允許在飼料中添加的微生物（包括乳酸菌22 種、丙酸桿菌1 種、芽孢桿菌7 種、酵母菌2 種、曲霉菌2 種、光合細(xì)菌1 種等）生產(chǎn)的多糖則可直接用于飼料添加劑。

微生物-多糖復(fù)合物既可通過在培養(yǎng)基中直接添加無機(jī)金屬鹽，通過微生物代謝體內(nèi)合成；也可以先通過微生物合成多糖，在體外進(jìn)行多糖與微量元素的絡(luò)合（表3），兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。Malinowska 等[64]報(bào)道真菌如蘑菇能夠高效富集土壤或營養(yǎng)介質(zhì)中的微量元素包括硒，Jin 等[69]和Zhang等[70]發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌能有效吸收無機(jī)硒并轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒-多糖復(fù)合物。這種方法可選擇對動(dòng)物生長有益的細(xì)菌來合成，不需要復(fù)雜的多糖純化步驟，可直接飼喂。但并不是所有微生物都可以有效代謝無機(jī)金屬鹽，體外多糖與微量元素的絡(luò)合則具有負(fù)載量可控和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的優(yōu)勢。異型微生物多糖，由單體糖葡萄糖、甘露糖、葡糖酸、鼠李糖、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸和半乳糖等構(gòu)成，明確其結(jié)構(gòu)組成對于多糖微量元素絡(luò)合物制備工藝的建立極其重要。微生物多糖與植物多糖和藻類多糖相比，其生產(chǎn)受自然災(zāi)害、氣候和地理環(huán)境影響較小，且可用農(nóng)業(yè)廢棄物為原料進(jìn)行發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)資源循環(huán)利用的同時(shí)降低成本[71-72]，因此是制備多糖微量元素絡(luò)合物的理想選擇。特別是隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建能同時(shí)代謝微量元素和高產(chǎn)多糖的工程菌，將為多糖微量元素絡(luò)合物的規(guī)模化生產(chǎn)提供可能。

2 多糖微量元素絡(luò)合物的生物功能

2.1 提升免疫力

多糖微量元素絡(luò)合物對動(dòng)物的免疫力提高多體現(xiàn)在其對淋巴細(xì)胞的增殖作用。大多數(shù)研究表明，細(xì)菌的胞外多糖微量元素絡(luò)合物比其胞外多糖具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能[60-61]。小鼠口服從陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacaeZ0206）發(fā)酵液中分離出的一種含硒胞外多糖后，免疫器官指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖和血清溶血素濃度明顯增加。這些結(jié)果表明該含硒胞外多糖可作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑來增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[73]。分離自Caulerpa racemosa的多糖硒化后對小鼠外周T 淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)以及從小鼠脾臟分離的自然殺傷細(xì)胞(NK 細(xì)胞)的免疫調(diào)節(jié)作用具有顯著提高的效果，被認(rèn)為是一種理想的天然免疫調(diào)節(jié)劑[59]。植物多糖微量元素絡(luò)合物也在免疫調(diào)節(jié)方面具有增益的效果。Xu 等[74]制備的灰樹花多糖鐵復(fù)合物能夠促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖，并且具有一定的抗氧化性。Qin 等[47]比較當(dāng)歸多糖和硒化修飾后的當(dāng)歸多糖對雞外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)，硒化修飾后的當(dāng)歸多糖能顯著增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)功能。

2.2 抗腫瘤功能

分離自夏枯草的多糖與鋅絡(luò)合等得到的絡(luò)合物能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖（500μg/ml抑制率達(dá)到98.4%），是人類肝細(xì)胞癌治療和預(yù)防的有效候選物[48]。從富硒靈芝菌絲體中提取的含硒多糖可以誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡，與天然多糖相比，其中6種癌細(xì)胞系增殖顯示出約10 倍的抑制作用[75]。來自根瘤菌的含硒多糖能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長，并且能夠顯著增加荷瘤小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)，可以作為一種理想的抗腫瘤劑[61]。

表2 植物多糖與微量元素的絡(luò)合Table 2 Summary of the plant polysaccharide and trace element complexes

2.3 抗氧化功能

飼料中的主要成分會(huì)受外界影響而產(chǎn)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致飼料變質(zhì)，影響畜禽健康[76]。大量研究表明多糖本身具有清除多種活性氧（reactive oxygen species，ROS）的抗氧化作用，多糖金屬元素絡(luò)合物則可抑制ROS 的生成，表現(xiàn)出更好的抗氧化功能。Wang 等[45-46]通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含硒多糖作為一種新的硒源與天然多糖相比，其抗氧化功能顯著增強(qiáng)。Pan等[43]通過體外抗氧化檢測發(fā)現(xiàn)，米糠多糖金屬復(fù)合物，包括米糠多糖-鐵、米糠多糖-銅和米糠多糖-鋅，均能在體外表現(xiàn)出安全的抗氧化功能。鐵多糖絡(luò)合物具有良好的生物利用度和體外抗氧化功能，能夠提高動(dòng)物對鐵元素的吸收率，因此，鐵多糖絡(luò)合物是良好的補(bǔ)鐵劑候選物[13,40-41]。仔豬飼料中添加殼聚糖鋅后，仔豬體內(nèi)的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性均顯著提高，說明多糖微量元素在飼料抗氧化方面具有較好的應(yīng)用潛力[77]。

表3 微生物多糖與微量元素的絡(luò)合Table 3 Summary of the microbial polysaccharide and trace element complexes

2.4 其他生物功能

滑菇多糖與鋅的絡(luò)合物具有降血脂、抗氧化和保肝作用，可作為一種新的高脂血癥功能性食品原料[65]。Zhang 等[49]制備出的苦瓜多糖鉻絡(luò)合物在對患有糖尿病小鼠治療四周后，小鼠表現(xiàn)出明顯較低的空腹血糖水平，并且胰島素水平和抗氧化酶活性均高于糖尿病組。滸苔多糖具有良好的生物功能，但其較高的分子質(zhì)量導(dǎo)致其生物功能受到影響，對細(xì)菌和植物病原真菌的抑制作用較小。亞硒酸鈉和滸苔多糖在硝酸的作用下能夠合成降解硒多糖，合成的硒多糖絡(luò)合物則對大腸桿菌和植物病原真菌具有很強(qiáng)的抑制作用[56]。

3 多糖微量元素飼料化應(yīng)用現(xiàn)狀及存在的問題

動(dòng)物飼料中的第一代微量元素添加劑，如亞硒酸鈉、硫酸銅、硫酸鋅等無機(jī)鹽，因其價(jià)格低廉而備受養(yǎng)殖者的青睞[15]；第二代主要包括乳酸鎂、檸檬酸亞鐵等有機(jī)酸鹽，能夠更好地維持動(dòng)物腸胃內(nèi)穩(wěn)定的消化環(huán)境，從而促進(jìn)動(dòng)物對微量元素的吸收[78-79]。但兩代產(chǎn)品均存在適口性差、吸收率低、環(huán)境污染等問題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，有機(jī)微量元素已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，并且作為動(dòng)物飼料中第三代微量元素添加劑也越來越被養(yǎng)殖業(yè)接受[80–83]。多糖微量元素絡(luò)合物中多糖本身具有豐富的生物功能，多糖復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)也賦予了它與微量元素結(jié)合的能力，因此，具有廣闊的飼料化應(yīng)用前景[31]。

目前，多糖微量元素絡(luò)合物添加劑已經(jīng)在動(dòng)物飼料中得到應(yīng)用，對動(dòng)物的生長性能、生產(chǎn)以及發(fā)育有顯著的改善效果。在肉雞飼糧中添加600 mg/kg 的果膠低聚糖螯合鋅能夠顯著提高肉雞的平均日增重（average daily gain，ADG）和平均日飼料攝入量（average daily feed intake，ADFI）[84]。 Williams等[85-86]研究表明在仔豬出生后7 天內(nèi)注射一次200 mg 的Gleptoferron 補(bǔ)鐵劑（葡庚糖酐鐵）能夠優(yōu)化仔豬斷奶前后的生長發(fā)育，提高仔豬重量。Ma 等[77]發(fā)現(xiàn)殼聚糖鋅能夠提高仔豬體內(nèi)的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，從而間接促進(jìn)仔豬生長。在飼料中添加甘露寡糖微量元素（Cu，Mn，Se和Zn）能夠改善妊娠期母牛的生產(chǎn)性能以及新生牛犢的健康狀況[16]。

雖然多糖微量元素的優(yōu)異功效正逐漸得到養(yǎng)殖業(yè)的認(rèn)可，但其飼料化應(yīng)用目前還存在一些問題。與無機(jī)鹽類微量元素添加劑相比，在同一添加水平下多糖微量元素的成本較高。由于不同來源多糖的結(jié)構(gòu)差異較大，多糖微量元素絡(luò)合物的生產(chǎn)工藝也有所不同，工業(yè)化生產(chǎn)尚不成熟。多糖微量元素的生物學(xué)效價(jià)取決于多糖與微量元素的絡(luò)合率及絡(luò)合強(qiáng)度，因此對產(chǎn)品絡(luò)合率及絡(luò)合強(qiáng)度做出正確評價(jià)顯得至關(guān)重要。因此，建立統(tǒng)一的質(zhì)量評價(jià)方法，并對不同種類的多糖微量元素生物學(xué)利用率進(jìn)行評價(jià)，對多糖微量元素的推廣與應(yīng)用具有重要意義。

4 總結(jié)與展望

多糖與微量元素的絡(luò)合既能發(fā)揮多糖的生物學(xué)功能，又能克服無機(jī)微量元素生物利用率低的缺點(diǎn)，降低動(dòng)物飼料產(chǎn)品中微量元素的添加，有利于提高動(dòng)物飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)效益和動(dòng)物的生長性能，同時(shí)減少微量元素添加劑造成的環(huán)境污染。多糖微量元素絡(luò)合物的合成工藝往往由多糖結(jié)構(gòu)決定，同時(shí)不同種類的多糖結(jié)構(gòu)，也賦予絡(luò)合物不同的生物功能，包括抗腫瘤、抗氧化和提升免疫力。目前，多糖微量元素因其優(yōu)異功效已被添加至飼料中，但在飼料工業(yè)中大力推廣多糖微量元素絡(luò)合物，亟需根據(jù)多糖分子結(jié)構(gòu)，建立統(tǒng)一的絡(luò)合工藝條件和標(biāo)準(zhǔn)的微量元素絡(luò)合率和絡(luò)合強(qiáng)度檢測方法，以適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)，降低成本。

此外，通過微生物發(fā)酵利用廢棄生物質(zhì)資源合成胞外多糖，或者從木質(zhì)纖維中提取木聚糖等益生元，可有效降低多糖生產(chǎn)成本，促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展，制造綠色畜牧產(chǎn)品；根據(jù)微量元素的協(xié)同或者拮抗作用，開發(fā)多糖絡(luò)合兩種及以上微量元素的絡(luò)合物，并根據(jù)其生物功能和利用率對產(chǎn)品進(jìn)行仔細(xì)分類，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品功能多元化和精確飼養(yǎng)。微量元素的形態(tài)和含量都會(huì)影響動(dòng)物對其吸收，不同絡(luò)合強(qiáng)度的多糖微量元素絡(luò)合物的吸收利用效率、相對生物學(xué)效價(jià)、環(huán)保等方面還具有很大的發(fā)展空間。