芮曉薇 鄭思慧 趙方敏 蔣佳怡 柯雅妮 張 璐 蔡利軍#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）是以反復(fù)發(fā)作的腹痛腹瀉為臨床特征的慢性功能性胃腸道疾病，常伴心理障礙。IBS-D發(fā)病可能與腦-腸軸功能紊亂、內(nèi)臟高敏感性、腸道動力異常及精神心理因素等有關(guān)[1-2]。而內(nèi)臟高敏感性、腸道動力異常與5-羥色胺（5-HT）、P物質(zhì)（SP）等腦腸肽及SCF/c-Kit信號系統(tǒng)密切相關(guān)[3]。痛瀉要方對于治療肝郁脾虛證IBS-D具有良好療效，然而其作用機(jī)制尚未完全明確，故本研究通過觀測大鼠血清5-HT和結(jié)腸組織SP、SCF和c-Kit mRNA表達(dá)量的變化，探討痛瀉要方對肝郁脾虛證IBS-D的作用機(jī)制，為疏肝健脾方藥在IBS-D中的運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量200±20g。飼養(yǎng)條件：室溫 20～24℃，相對濕度 40%～70%，噪音＜60dB，光照周期12h/12h。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：番瀉葉、痛瀉要方（炒白術(shù)30g，炒白芍20g，炒陳皮15g，防風(fēng)10g），中藥飲片由浙江省中醫(yī)院中藥房提供并進(jìn)行質(zhì)量鑒定。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：大鼠SP ELISA試劑盒；大鼠5-HT ELISA試劑盒；BCA蛋白法含量測試盒(ADS-FDB005)；RNA提取試劑盒（TaKaRa，AHF1991D）；RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，RR036A）；SYBR Green熒光定量PCR染料（TaKaRa，AK9301）。懸尾測試儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，YLS-18A）；大鼠曠場（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，63007）；熒光定量PCR儀（ABI）。

1.4 造模及干預(yù)方法：具體如下。

1.4.1 藥物制備：番瀉葉水煎劑：番瀉葉水浸泡5h，煎煮20min，過濾濃縮至含生藥0.45g/ml藥液備用。痛瀉要方水煎劑：炒白術(shù)、炒白芍、炒陳皮、防風(fēng)水浸泡30min，煎煮30min，過濾濃縮至含生藥1.35g/ml備用。

1.4.2 建立模型：除空白組外，各組均采用番瀉葉灌胃聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激法建立[4]肝郁脾虛證IBS-D動物模型：連續(xù)14d番瀉葉水煎劑［4.5g/(kg·d)］灌胃后疊加束縛，每日約2h。

1.4.3 藥物干預(yù)：造模成功后開始治療，給藥劑量按大鼠與人體體表面積折算的等效劑量計(jì)算：痛瀉要方組按生藥6.75g/(kg?d)；空白組、模型組分別給予等體積生理鹽水，灌胃量按0.50ml/100g計(jì)算，連續(xù)14d。

1.5 檢測指標(biāo)及方法：具體如下。

1.5.1 一般狀態(tài)觀察：造模與治療前后，觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、行為等，并記錄體質(zhì)量變化。

1.5.2 糞便性狀測定：第28、42d觀察并記錄4h（8：00-12：00Am）內(nèi)各組大鼠的糞便性狀和糞點(diǎn)數(shù)。采用Bris‐tol分級評分[5]評價(jià)大鼠的腹瀉情況。稀便率=大鼠所排稀便粒數(shù)/排便總粒數(shù)。采集大鼠糞便，稱量記錄糞便濕重，烘干后稱量記錄干重。計(jì)算公式：糞便含水量（%）＝（糞便濕重－糞便干重）/糞便濕重×100%[6]。

1.5.3 動物行為學(xué)評價(jià)：曠場實(shí)驗(yàn)[7]：于42d給藥結(jié)束后，在安靜無干擾、弱光照射、無參照物的環(huán)境下進(jìn)行。大鼠適應(yīng)環(huán)境1min后置于曠場箱中心格內(nèi)，用Smart v3.0記錄5min內(nèi)大鼠活動情況。懸尾實(shí)驗(yàn)[8]：于42d給藥結(jié)束后，將大鼠尾部固定于懸尾測試儀中成倒掛狀態(tài)，共懸掛6min，適應(yīng)2min，記錄大鼠后4min內(nèi)的靜止時(shí)間（放棄掙扎，整個(gè)身體相對不動）。

1.5.4 標(biāo)本采集：末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水24h，頜下靜脈取血，離心取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩２裳蟠笫蟀矘匪?，剖腹截取結(jié)腸組織-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.5 ELISA法測定結(jié)腸SP、血清5-HT水平：嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，測定計(jì)算各樣本的濃度。

1.5.6 qPCR法檢測SCF、c-Kit的表達(dá)：嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。引物序列見表1。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及其分析軟件進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算Ct值，通過公式2-△△CT計(jì)算mRNA表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5.7 相關(guān)性分析：用Peasron積差相關(guān)系數(shù)分析SCF、c-Kit的表達(dá)與SP、5-HT水平的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)：模型大鼠精神萎靡，進(jìn)食少，毛發(fā)松散光澤度低，糞便呈糊狀或水樣便。治療后大鼠精神狀態(tài)改善，進(jìn)食、活動增加，皮毛較前整齊，糞便轉(zhuǎn)為香腸狀。各組大鼠無死亡或脫落。體質(zhì)量比較見表2。

表2 給藥前后大鼠體質(zhì)量的比較（±s，g）

表2 給藥前后大鼠體質(zhì)量的比較（±s，g）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

給藥后體質(zhì)量356.69±22.70 311.75±25.71*355.46±13.14△組別空白組模型組痛瀉要方組n8 8 8給藥前體質(zhì)量320.48±18.05 297.38±20.28*292.16±13.30*

2.2 各組大鼠糞便含水量、Bristol積分及稀便率的比較：見表3。

表3 給藥前后各組大鼠糞便含水量、Bristol積分及稀便率變化（±s）

表3 給藥前后各組大鼠糞便含水量、Bristol積分及稀便率變化（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別空白組模型組痛瀉要方組給藥后2.50±4.63 35.76±14.56*14.21± 8.34△n 8 8 8糞便含水量（%）給藥前31.92±8.15 57.49±8.19*55.48±7.06*給藥后31.62±8.31 56.86±6.05*33.88±7.85△Bristol積分（分）給藥前3.00±0.76 6.00±0.76*6.13±0.84*給藥后3.25±0.71 6.25±0.71*3.38±0.92△稀便率（%）給藥前3.60±5.10 35.67±10.49*34.34±15.28*

2.3 動物行為學(xué)評價(jià)：各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比較見表4。

表4 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)及懸尾實(shí)驗(yàn)的比較（±s）

表4 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)及懸尾實(shí)驗(yàn)的比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別空白組模型組痛瀉要方組懸尾不動時(shí)間（s）95.38±13.98 124.00±13.41*102.63±16.19△n8 8 8總路程（cm）3827.60±379.47 1513.20±176.17*3475.43±458.72△運(yùn)動速度（cm/s）13.99±2.04 6.22±1.39*12.35±1.15△中央停留時(shí)間（s）45.91±8.17 20.30±3.26*39.35±8.39△跨格次數(shù)（次）109.88±17.80 57.75±14.94*97.38±12.68△

2.4 各組大鼠血清5-HT、結(jié)腸SP水平比較：見表5。

表5 痛瀉要方對大鼠血清5-HT、結(jié)腸SP水平的影響（±s）

表5 痛瀉要方對大鼠血清5-HT、結(jié)腸SP水平的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別空白組模型組痛瀉要方組SP（ng/mg）2.67±0.99 9.16±1.34*6.60±1.04△n 8 8 8 5-HT（ng/ml）6.03±4.06 30.00±3.78*14.23±2.63△

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織SCF、c-Kit mRNA表達(dá)比較：見表6。

表6 痛瀉要方對大鼠結(jié)腸組織SCF、c-Kit mRNA表達(dá)的影響（±s）

表6 痛瀉要方對大鼠結(jié)腸組織SCF、c-Kit mRNA表達(dá)的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別空白組模型組痛瀉要方組c-Kit/GAPDH 1.02±0.27 3.75±0.88*1.42±0.90△n8 8 8 SCF/GAPDH 1.01±0.11 3.94±0.70*1.25±0.46△

2.6 SCF、c-Kit mRNA表達(dá)與SP、5-HT水平的相關(guān)性分析：見表7。

表7 SCF、c-Kit mRNA表達(dá)與SP、5-HT水平的Pearson相關(guān)系數(shù)r

3 討論

IBS-D屬于中醫(yī)學(xué)“腹痛”“泄瀉”“郁證”范疇，本病病位在大腸，與肝、脾、腎密切相關(guān)，肝郁脾虛是導(dǎo)致IBS-D發(fā)生的重要病機(jī)。痛瀉要方以白術(shù)為君，苦甘而溫，燥濕補(bǔ)脾和中；白芍為臣，瀉肝火，斂逆氣，緩急止痛；陳皮為佐，辛苦而溫，理氣燥濕，醒脾和胃；再配伍少量防風(fēng)，與術(shù)、芍相伍，辛能散肝，香能舒脾，風(fēng)能勝濕以助止瀉之功，又為脾經(jīng)之引經(jīng)藥。四藥相合，脾健肝和，痛瀉自止。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)痛瀉要方治療后，IBS-D模型大鼠糞便含水量、Bristol積分及稀便率均下降，表明痛瀉要方可通過調(diào)節(jié)胃腸功能以改善大鼠腹瀉的癥狀，曠場和懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，痛瀉要方能有效改善肝郁脾虛型IBS-D大鼠的精神狀態(tài)。

SCF是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種多功能的酸性糖蛋白，c-Kit是由原癌基因c-Kit編碼的I型跨膜糖蛋白，是SCF的配體。SCF/c-Kit信號系統(tǒng)調(diào)控著多種細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化和凋亡，c-Kit與SCF結(jié)合后，啟動Ras/Erk等下游通路，作用于腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞（in‐terstitial cell of Cajal，ICC）、肥大細(xì)胞（mast cell，MC）等[3]與IBS-D發(fā)病相關(guān)的細(xì)胞。

國內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示[3，9]，IBS的發(fā)病可能與SCF/c-Kit信號系統(tǒng)過度表達(dá)有關(guān)。SCF通過c-Kit受體誘導(dǎo)腸道MC發(fā)育活化增加[10]，引起MC分泌5-HT、類胰蛋白酶等，作用于神經(jīng)末梢相應(yīng)受體，導(dǎo)致內(nèi)臟高敏及腸動力紊亂，類胰蛋白酶可激活腸神經(jīng)釋放SP[11]，SP、5-HT作用于ICC表面受體，將信號傳遞給平滑肌細(xì)胞，起到調(diào)節(jié)作用[12]。因此SCF/C-Kit信號系統(tǒng)過表達(dá)可能是IBS-D內(nèi)臟疼痛感知、胃腸動力紊亂的共同環(huán)節(jié)之一。

本研究中，模型組大鼠結(jié)腸中SCF、c-Kit表達(dá)升高，痛瀉要方灌胃后大鼠結(jié)腸組織SCF、c-Kit的mRNA表達(dá)明顯降低，提示痛瀉要方可明顯降低肝郁脾虛證IBS-D大鼠SCF/c-Kit系統(tǒng)的過表達(dá)。同時(shí)，大鼠結(jié)腸SCF、c-Kit的表達(dá)與5-HT、SP水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系，一定程度上驗(yàn)證了腦腸軸中SCF/c-Kit信號系統(tǒng)對5-HT、SP的調(diào)節(jié)在IBS-D的發(fā)生發(fā)展中的作用。痛瀉要方可能通過SCF/c-Kit信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)5-HT、SP水平，從而改善IBS-D腦腸軸功能異常來達(dá)到治療作用。但是SCF/c-Kit信號系統(tǒng)涉及Ras/Erk、JAK/STAT等多條下游通路[3]，痛瀉要方治療IBS-D的具體靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。