張秀霞，王冬梅，李軍濤，張澤龍，冼健安,2

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，海南 ?？?571101）

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry,FCM）是20 世紀(jì)70 年代發(fā)展起來(lái)的快速測(cè)定細(xì)胞物理和化學(xué)性質(zhì)的技術(shù)。它以單個(gè)細(xì)胞為檢測(cè)單位，具有快速、靈敏、客觀、檢測(cè)量大并可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)等優(yōu)點(diǎn)，在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用十分普遍。貝類是重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要指示生物，F(xiàn)CM較早地引入到貝類研究中。血細(xì)胞在貝類的細(xì)胞免疫、體液免疫以及生理代謝中發(fā)揮重要作用，但一直以來(lái)，血細(xì)胞的研究主要依賴顯微觀察和生化方法，技術(shù)手段的缺乏和落后制約了研究的深度。引入FCM為貝類血細(xì)胞學(xué)研究提供了很好的檢測(cè)平臺(tái)，推動(dòng)了貝類血細(xì)胞學(xué)研究的發(fā)展。本文綜述近年來(lái)FCM在貝類血細(xì)胞研究中的應(yīng)用，可為FCM在貝類及其他水產(chǎn)動(dòng)物中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 FCM在貝類血細(xì)胞分類中的應(yīng)用

血細(xì)胞在貝類免疫中起至關(guān)重要的作用[1]，而血細(xì)胞的準(zhǔn)確分類是進(jìn)一步研究其功能的前提。前向角散射光（FSC）反映細(xì)胞大小，側(cè)向角散射光（SSC）反映細(xì)胞內(nèi)顆粒復(fù)雜程度，是流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分不同類群細(xì)胞的主要參數(shù)。傳統(tǒng)貝類血細(xì)胞分類方法主要是顯微觀察細(xì)胞的大小和內(nèi)含顆粒的狀況，因此，F(xiàn)CM 十分適用于貝類血細(xì)胞的分類研究。

早在1988 年就開(kāi)始嘗試用FCM 進(jìn)行貝類血細(xì)胞分類，但研究結(jié)果的差異較大[2,3]。2001 年開(kāi)始陸續(xù)有進(jìn)一步的應(yīng)用研究[4]，而我國(guó)則在2005 年才有文獻(xiàn)報(bào)道[5]，其應(yīng)用情況見(jiàn)表1。貝類血細(xì)胞的分類一直分歧很大，至今仍沒(méi)有統(tǒng)一。應(yīng)用FCM研究的結(jié)果也有一定差異，但總體看來(lái)，大部分雙殼貝類的血細(xì)胞可分為三類，部分研究結(jié)果只是命名不同；關(guān)于鮑類的研究較少，均認(rèn)為只區(qū)分為漿樣細(xì)胞和透明細(xì)胞兩類[6,7]，與顯微觀察的研究[8]以及對(duì)雜色鮑Haliotis diversicolor 血細(xì)胞的研究結(jié)果[9]差異較大，其原因可能是技術(shù)操作的把握程度以及數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性存在差異。

表1 流式細(xì)胞術(shù)在貝類血細(xì)胞分類中的應(yīng)用Tab.1 Application of flow cytometry in shellfish haemocyte classification

2 FCM 在貝類血細(xì)胞基礎(chǔ)功能研究中的應(yīng)用

不同類型的血細(xì)胞在貝類生理和免疫過(guò)程中的作用不同。FCM是細(xì)胞水平上的分析技術(shù)，應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)為研究不同類型血細(xì)胞的功能提供了方便。

2.1 血細(xì)胞組成比例與血細(xì)胞總數(shù)（Total haemocyte count,THC）

不同類型血細(xì)胞的功能不同，血細(xì)胞的組成比例可在一定程度上反映機(jī)體的生理和免疫狀態(tài)。許秀芹等[17]研究了酵母聚糖和甘氨酸鋅兩種飼料免疫添加劑對(duì)櫛孔扇貝Chlamys farreri 血細(xì)胞組成比例的影響。結(jié)果顯示，注射刺激后其透明細(xì)胞的比例增加，顆粒細(xì)胞的比例減少。櫛孔扇貝注射球狀病毒感染后，血細(xì)胞中透明細(xì)胞比例顯著上升，大顆粒細(xì)胞比例顯著下降[31]。

THC 是常用的免疫指標(biāo)，一般認(rèn)為THC 的下降反映了機(jī)體免疫力的下降。Lambert 等[32]比較了不同地域及不同家系太平洋牡蠣Crassostrea gigas的細(xì)胞免疫狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，夏季耐受力較強(qiáng)的牡蠣家系具有更高的THC，生長(zhǎng)地域也影響牡蠣的THC。本文認(rèn)為食物源和繁殖條件可能是主要影響因素。

2.2 活性氧含量與呼吸爆發(fā)活力

細(xì)胞在吞噬過(guò)程中，伴隨產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的過(guò)程稱為呼吸爆發(fā)。這些活性氧是細(xì)胞毒氧化劑，包括超氧陰離子（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥自由基[·OH]等，在殺滅和消化病原微生物的免疫防御中起十分重要的作用[33]。2',7'-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（DCFH-DA）是最為常用的一種熒光探針，但對(duì)于它的檢測(cè)對(duì)象，還具有一定的爭(zhēng)議。有的研究認(rèn)為，它主要被H2O2所氧化[11,14,34]，有的研究認(rèn)為所有種類的ROS 與之都有反應(yīng)。有的則認(rèn)為它反映的是ROS 和活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）的總量[7,32]。

Lambert 等[14]建立了應(yīng)用DCFH-DA 作為熒光探針測(cè)定太平洋牡蠣血細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力的FCM方法，并發(fā)現(xiàn)佛波酯（PMA）不影響血細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力；酵母聚糖可顯著誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，主要體現(xiàn)于顆粒細(xì)胞上；而抗凝劑會(huì)抑制ROS 的產(chǎn)生。Lambert 等研究發(fā)現(xiàn)，不同家系和地域的太平洋牡蠣的血細(xì)胞ROS 水平不同，夏季耐受力較強(qiáng)的牡蠣家系ROS 水平較低[32]。Goedken 等[1]發(fā)現(xiàn)：PMA 刺激可顯著提高美洲牡蠣C.virginica 顆粒細(xì)胞和中間型細(xì)胞的ROS 含量，而對(duì)透明細(xì)胞沒(méi)有顯著影響，即前兩種細(xì)胞具有較強(qiáng)的呼吸爆發(fā)活力。Wang等[24]以DCFH-DA 探針?lè)治隽唆浯滟O貝Perna viridis的ROS 含量，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞的ROS 含量顯著高于透明細(xì)胞；應(yīng)用DHR123 作為O2-特異性探針的測(cè)定顯示：顆粒細(xì)胞的O2-含量也顯著高于透明細(xì)胞。Donaghy 等[15]對(duì)近江牡蠣C.ariakensis 的研究結(jié)果顯示：顆粒細(xì)胞中非誘導(dǎo)性ROS 含量最高，透明細(xì)胞次之，漿樣細(xì)胞最少。

2.3 吞噬活性

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞的吞噬活性時(shí)，一般用表面結(jié)合了羧酸基團(tuán)的聚苯乙烯熒光微球（Carboxylate-modified fluorescent microspheres）作為被吞噬物，最常用的是直徑為1 μm 和2 μm 的黃綠色微球[7,35]。石芳芳等[36]篩選和比較了各種緩沖體系對(duì)扇貝血細(xì)胞吞噬活性的影響，結(jié)果顯示以過(guò)濾海水作為緩沖液時(shí)血細(xì)胞的吞噬活性最高。海灣扇貝Argopecten irradians[37]血細(xì)胞的吞噬率顯著高于櫛孔扇貝[36]。李進(jìn)壽等研究了不同含量熒光微球?qū)﹄s色鮑H.diversicolor 血細(xì)胞的吞噬率的影響，認(rèn)為當(dāng)熒光微球含量為血細(xì)胞含量的6.82 倍時(shí)較為合適。研究還發(fā)現(xiàn)，雜色鮑經(jīng)低鹽度脅迫后，血細(xì)胞的吞噬率顯著下降。翡翠貽貝顆粒細(xì)胞吞噬率為40.84%，顯著高于透明細(xì)胞的4.50%[24]。近江牡蠣Crassostrea ariakensis 顆粒細(xì)胞的吞噬率為41.2%，顯著高于透明細(xì)胞的22.6%[15]。美洲牡蠣C.virginica 血細(xì)胞中，顆粒細(xì)胞的吞噬活力最強(qiáng)，中間型細(xì)胞次之，透明細(xì)胞吞噬活力最低[11]。

2.4 溶酶體數(shù)量與非特異性酯酶活性

溶酶體是胞內(nèi)含有眾多水解酶的重要細(xì)胞器，為細(xì)胞內(nèi)的溶解或消化消化器官，可以殺死和降解病原體，起到免疫防御作用。翡翠貽貝顆粒細(xì)胞中溶酶體的數(shù)量多于透明細(xì)胞[24]。皺紋盤(pán)鮑Haliotis discus discus 血細(xì)胞的溶酶體數(shù)量較為均一；根據(jù)血細(xì)胞中溶酶體數(shù)量，角蠑螺Turbo cornutus 可區(qū)分三個(gè)亞群[7]。

酯酶是溶酶體酶類之一，是機(jī)體清除病原體、異物和壞死細(xì)胞的重要工具之一。以二乙酸熒光素（FDA）為探針測(cè)定酯酶活性。翡翠貽貝顆粒細(xì)胞的酯酶活性顯著高于透明細(xì)胞，這與溶酶體數(shù)量的結(jié)果相吻合[24]。除酯酶以外，通過(guò)相應(yīng)的試劑盒還可用FCM 測(cè)定胞內(nèi)的氨肽酶（aminopeptidase）和過(guò)氧化物酶（peroxidase）等的活性[35,38]。

3 FCM在貝類病理學(xué)研究中的應(yīng)用

血細(xì)胞免疫功能研究主要通過(guò)注射和離體刺激兩種方式進(jìn)行處理，再分析血細(xì)胞各項(xiàng)參數(shù)的變化，以探討血細(xì)胞在病原體防御過(guò)程中的作用。給太平洋牡蠣注射感染弧菌Vibrio aestuarianus 后，THC 先升高后恢復(fù)至對(duì)照組水平，這是機(jī)體對(duì)抗病原體感染的首要細(xì)胞響應(yīng)。新的血細(xì)胞可能有兩種來(lái)源：一是組織中血細(xì)胞被調(diào)動(dòng)進(jìn)入血淋巴中；二是造血組織的造血作用。感染的牡蠣血細(xì)胞的吞噬活性和粘合能力顯著下降，表明該病原體通過(guò)抑制血細(xì)胞的吞噬活性和粘合能力來(lái)躲避宿主的細(xì)胞免疫；弧菌感染還使顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞的ROS 含量均顯著升高，氧化代謝過(guò)程的失衡使機(jī)體產(chǎn)生氧化脅迫，這可能是發(fā)病機(jī)理之一[39]。櫛孔扇貝經(jīng)球狀病毒注射感染后，大顆粒細(xì)胞比例顯著下降，可能與組織損傷和炎癥反應(yīng)過(guò)程中大顆粒細(xì)胞的脫顆粒作用有關(guān)；注射病毒也導(dǎo)致血細(xì)胞死亡率顯著上升，對(duì)免疫功能有一定的抑制作用[31]。胞內(nèi)的原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)Bonamia ostreae 與其宿主歐洲扁牡蠣O.edulis 的血細(xì)胞進(jìn)行體外孵育，導(dǎo)致血細(xì)胞的非特異性酯酶活性和ROS 含量顯著下降，但對(duì)血細(xì)胞的死亡率和吞噬活力沒(méi)有顯著影響[40]。

4 FCM 在貝類生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

4.1 重金屬

流式細(xì)胞術(shù)在貝類生態(tài)毒理學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，現(xiàn)已研究了對(duì)重金屬、有機(jī)污染物、殺蟲(chóng)劑、有害藻類等的細(xì)胞毒性，以及其他水體環(huán)境脅迫因子的脅迫機(jī)制。Brousseau 等[41]分析了幾種重金屬離子對(duì)砂海螂Mya arenaria 離體血細(xì)胞吞噬活性的影響。結(jié)果顯示：對(duì)吞噬活性的抑制程度由強(qiáng)至弱依次為：ZnCl2＜CdCl2＜AgNO3＜HgCl2＜CH3HgCl；除Ag-NO3外，其他重金屬離子在10-9mol/L 和10-8mol/L的低濃度時(shí)可刺激血細(xì)胞的吞噬活性。Sauve 等[42]研究了重金屬對(duì)多種海洋和淡水貝類的毒性，結(jié)果顯示：不同物種對(duì)不同的重金屬具有敏感性，評(píng)估環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)時(shí)應(yīng)充分考慮物種間的差異。Gagnaire 等[38]研究了Cd 和Hg 對(duì)太平洋牡蠣血細(xì)胞活性和免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)條件下Cd 對(duì)血細(xì)胞的影響不顯著，Hg 顯著抑制血細(xì)胞活性，提高氨基肽酶陽(yáng)性細(xì)胞的比例，抑制酚氧化酶活性，Hg對(duì)雙殼類的免疫功能更具威脅。Mottin 等[43]研究表明：高濃度Zn（1 000 μmol/L）抑制了鮑Haliotis tuberculata 離體血細(xì)胞的免疫功能和ROS 的產(chǎn)生，但提高了非特異性酯酶活性。Foster 等[44]比較研究了離體和活體狀態(tài)下，Cu 對(duì)美洲牡蠣血細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：離體狀態(tài)下，Cu 誘導(dǎo)血細(xì)胞發(fā)生凋亡，但活體實(shí)驗(yàn)中Cu 反而抑制了血細(xì)胞凋亡，這可能是兩種脅迫方式的生物利用度不同。Cd 和苯并芘脅迫7 d 后，文蛤M.meretrix 血細(xì)胞的死亡率和活性氧水平上升，吞噬功能下降，顯著降低了文蛤血細(xì)胞的功能和免疫力[45]。

4.2 其他污染物

持久性有機(jī)污染物具有持久性和高毒性而受到高度重視。Gagnaire 等[46]將太平洋牡蠣血細(xì)胞分別暴露于23 種環(huán)境污染物中，包括多環(huán)芳烴（PAH）、多氯聯(lián)苯（PCB）和殺蟲(chóng)劑，結(jié)果PAH 導(dǎo)致血細(xì)胞的溶酶體數(shù)量和酯酶活性下降，顆粒細(xì)胞的比例上升，但細(xì)胞死亡率下降；PCB77 抑制溶酶體數(shù)量，對(duì)其他指標(biāo)沒(méi)有影響；殺蟲(chóng)劑中對(duì)氧磷抑制溶酶體數(shù)量和酯酶活性，誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS。Bouilly 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，太平洋牡蠣暴露于除草劑敵草隆中11周后，血細(xì)胞的死亡率、顆粒細(xì)胞比例、吞噬活性、活性氧含量和溶酶體數(shù)量均上升。納米材料作為新型的環(huán)境污染物已引起高度關(guān)注，其對(duì)生物體的毒性也不容忽視。Canesi 等[48]研究了納米碳對(duì)貽貝Mytilus galloprovincialis 的免疫毒性，結(jié)果顯示：經(jīng)45 min 孵育脅迫后，10 μg/mL 納米碳導(dǎo)致血細(xì)胞的線粒體數(shù)量減少，而5 μg/mL 納米碳導(dǎo)致線粒體膜電位下降。

4.3 有毒藻類

水體中，尤其是發(fā)生水華時(shí)，有害藻類產(chǎn)生的毒素影響貝類的免疫功能，甚至導(dǎo)致死亡。近年來(lái)，用FCM 研究有害藻類對(duì)貝類血細(xì)胞毒性的報(bào)道很多[49]。Hégaret 等[50]發(fā)現(xiàn)，微小原甲藻Prorocentrum minimum 對(duì)血細(xì)胞有免疫刺激作用，而用的其他藻則抑制血細(xì)胞免疫功能，包括降低其吞噬活性、活性氧含量和粘附能力，以及導(dǎo)致死亡率上升。

4.4 其他環(huán)境因子

水溫、鹽度、溶氧和pH 等環(huán)境條件也影響貝類生存和免疫功能。Chen 等[51]分別將櫛孔扇貝從17℃轉(zhuǎn)移至11℃，從23℃轉(zhuǎn)移至28℃72 h。結(jié)果顯示，28℃升溫脅迫導(dǎo)致扇貝血細(xì)胞吞噬活性下降，ROS含量上升，而11℃降溫脅迫對(duì)細(xì)胞活性無(wú)顯著的影響，表明櫛孔扇貝對(duì)低溫的耐受性更強(qiáng)。Donaghy 和Volety[25]研究了溫度脅迫對(duì)翡翠貽貝離體血細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，10℃對(duì)血細(xì)胞造成脅迫影響，抑制了其吞噬活性，提高了ROS 含量。Wang 等研究低氧和高溫[52]、低氧和低鹽[53]聯(lián)合作用對(duì)翡翠貽貝血細(xì)胞死亡率、吞噬活性、非特異性酯酶活性、ROS 含量以及溶酶體數(shù)量的影響。曲凌云等[54]建立了應(yīng)用FCM測(cè)定櫛孔扇貝血細(xì)胞HSP70（熱休克蛋白70）表達(dá)量變化的方法，測(cè)定了高溫刺激下櫛孔扇貝血細(xì)胞HSP70 表達(dá)量變化。結(jié)果顯示：高溫誘導(dǎo)了血細(xì)胞HSP70 表達(dá)量的上升，在誘導(dǎo)7 h 時(shí)最高[55]。杜俊鵬等[56]采用碘化丙啶（PI）/羅丹明123 雙染的方法，研究了不同鹽度脅迫對(duì)葡萄牙牡蠣Crassostrea angulata 精子質(zhì)膜完整性和線粒體活性的影響。結(jié)果顯示，鹽度脅迫先損傷精子質(zhì)膜，后傷害線粒體活性；10 和15 低鹽脅迫對(duì)精子損傷嚴(yán)重，精子受精率和卵裂率顯著降低。Jauzein 等[57]將光芒長(zhǎng)文蛤Macrocallista nimbosa 從鹽度30 轉(zhuǎn)移至18 的水體中7 d 后，血細(xì)胞吞噬活力顯著下降，死亡率升高。Andreyeva 等[28]研究顯示：24 h 的缺氧脅迫導(dǎo)致紫貽貝M.galloprovincialis 的無(wú)顆粒細(xì)胞數(shù)量下降，而顆粒細(xì)胞數(shù)量升高，但對(duì)血細(xì)胞死亡率沒(méi)有顯著影響；ROS 含量在無(wú)顆粒細(xì)胞中升高，而在顆粒細(xì)胞中下降。Parrino 等[58]比較了西西里島兩個(gè)棲息區(qū)紫貽貝種群的血細(xì)胞免疫與結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)種群的血細(xì)胞免疫特性存在一定的差異，可能是兩個(gè)棲息地的水環(huán)境參數(shù)的差異所導(dǎo)。Barjhoux 等[59]用Hoechst33342、PI 和黃綠色熒光微球熒光探針建立了斑馬紋貽貝Dreissena polymorpha 細(xì)胞毒性和血細(xì)胞吞噬活性的分析方法，用于評(píng)估化學(xué)或環(huán)境毒性。

5 FCM 在貝類DNA 含量和倍性分析中的應(yīng)用

貝類多倍體育種具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，用FCM 分析貝類的倍性起步較早[60,61]，技術(shù)已較為成熟，在此不再詳細(xì)敘述。國(guó)外學(xué)者對(duì)該方法有了新的應(yīng)用——用于診斷貝類血瘤細(xì)胞的形成，認(rèn)為散播性血瘤細(xì)胞的形成與多種貝類的大量死亡有關(guān)[62,63]。測(cè)定DNA 含量還可分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。

6 展望

隨著新型多功能流式細(xì)胞儀以及新型特異探針的開(kāi)發(fā)，F(xiàn)CM的功能將更為強(qiáng)大、數(shù)據(jù)更為精確、檢測(cè)指標(biāo)也將不斷地?cái)U(kuò)充。FCM為貝類血細(xì)胞的研究提供了一條準(zhǔn)確、快速的途徑，可望將進(jìn)一步成為貝類血細(xì)胞研究中不可或缺的重要技術(shù)手段。