陳 緯，袁文靜，關(guān) 雪，胡瓊波

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

廣泛分布在自然界的蟲生真菌是害蟲生物防治的重要資源[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球已記載的蟲生真菌約100屬1000多種，一些有代表性的種類已被開發(fā)成環(huán)境友好型真菌殺蟲劑[2]，如球孢白僵菌Beauveria bassiana、金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae、玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea(原名玫色擬青霉Paecilomyces fumosoroseus)、蠟蚧輪枝菌Lecanicillium lecanii等[3]。作為一種重要的昆蟲病原真菌屬，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的棒束孢屬真菌有100多種，在生物防治和生產(chǎn)生活中發(fā)揮著重要作用。蟬棒束孢I. cicadae和細(xì)腳棒束孢I. tenuipes是一種藥食兩用真菌，在東亞地區(qū)被用于制作傳統(tǒng)中草藥和保健品[4]，具有降血糖、抗腫瘤、抗菌、抗抑郁、抗氧化、抗衰老、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用[5]。粉棒束孢分布范圍廣、寄主多，已被應(yīng)用于防治溫帶農(nóng)林害蟲和線蟲等[6]。玫煙色棒束孢已應(yīng)用于對(duì)粉虱、蚜蟲等刺吸式口器害蟲的生物防治，并有多種商品試劑開發(fā)問世[7]。環(huán)鏈棒束孢I. cateinannulata對(duì)螨蟲和鱗翅目害蟲有較好的防效，在森林害蟲的調(diào)控中起著重要作用[8]。爪哇棒束孢I. javanica制成的顆粒劑能有效控制稻飛虱的種群數(shù)量。我國(guó)地理環(huán)境復(fù)雜多樣，氣候復(fù)雜多變，為各類蟲生真菌的形成提供了有利條件。白僵菌屬與綠僵菌屬的相關(guān)研究較多，也更成熟，而棒束孢屬的報(bào)道相對(duì)較少。

黃曲條跳甲Phyllotreta striolata是十字花科蔬菜的主要害蟲，幼蟲和成蟲均能為害植株，幼蟲生活在地下，啃食植物根系，導(dǎo)致植株萎蔫，成蟲為害植物葉片和嫩稍，造成芽株干枯甚至死亡，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可對(duì)苗期蔬菜造成毀滅性的危害[9-10]。本研究利用天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于2013至2019年采集到的國(guó)內(nèi)部分地區(qū)土壤，對(duì)這些土壤中的棒束孢屬菌進(jìn)行分離、鑒定，并從中挑選9種棒束孢屬真菌菌株對(duì)黃曲條跳甲進(jìn)行生物活性測(cè)定，以期了解國(guó)內(nèi)地區(qū)棒束孢屬菌的多樣性及分布規(guī)律，為蟲生真菌資源的保護(hù)和農(nóng)林害蟲的生防產(chǎn)品合理開發(fā)提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 土壤的采集

采集福建、廣東、廣西、云南、貴州、湖南、湖北、河南、河北等地區(qū)的土壤。記錄采集地點(diǎn)、生境、經(jīng)緯度等信息，每個(gè)采集地點(diǎn)都分3處位置采集地表下15～20 cm的土樣各100 g，土樣用自封袋封裝，于4 ℃條件下保存。

1.2 菌株的分離純化

將采集回來的土壤樣品用孔徑0.45 mm的篩子篩出細(xì)土，每份土壤樣品準(zhǔn)確稱量3份10.0 g細(xì)土，用 100 mL 0.1%(φ)的吐溫?80 溶液制成土壤懸浮液，漩渦震蕩搖勻，靜置15 min。在超凈工作臺(tái)中，將制備好的選擇培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g/L、葡萄糖 20 g/L、瓊脂 20 g/L、放線菌酮 4 mL/L、氯霉素4 mL/L、孟加拉紅 0.013 g/L)倒平板，待培養(yǎng)基靜置凝固后用移液槍吸取100 μL土壤懸浮液至選擇培養(yǎng)基，用玻璃刮鏟涂抹均勻，晾干。在(28±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待選擇培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落后，用接種環(huán)挑取，接種至PDA(馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L)培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)，不斷重復(fù)，直至菌株被純化。成功純化后，將菌株接種到試管斜面培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)滿斜面后于4 ℃冰箱中保存。

1.3 菌種鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的菌株接種至PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，(28±1) ℃ 條件下培養(yǎng) 3～5 d，待菌株開始產(chǎn)孢時(shí)，挑取菌絲到載玻片上，蓋上蓋玻片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察其分生孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，并拍照記錄。繼續(xù)培養(yǎng)到12 d，觀察記錄菌落的大小、表面形態(tài)特征，并拍照記錄。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 菌種種屬鑒定利用rDNA-ITS基因序列進(jìn)行真菌ITS1-5.8S-ITS4 rDNA同源性分析，PCR通用引物為：ITS1(5′-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3′)。反應(yīng)擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 33 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序。收集真菌rDNA-ITS基因序列(長(zhǎng)度為550～580 bp)，將擴(kuò)增所得到的ITS序列進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)分析，記錄序列相似性最高的真菌種屬，用MEGA-X軟件構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹，最終確定真菌種屬。

1.4 對(duì)黃曲條跳甲的活性測(cè)定

供試黃曲條跳甲采集自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，置于養(yǎng)蟲籠內(nèi)用新鮮菜心飼養(yǎng)，保持適宜的光照、濕度和溫度，3～5 d后選擇生長(zhǎng)期一致的成蟲供生物活性測(cè)定。

將分離純化后的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，(28±1) ℃ 條件下培養(yǎng) 7～14 d，待菌株充分產(chǎn)孢后，刮取菌落表面分生孢子，用0.05%(φ)吐溫?80 溶液配制成 1.0×108mL?1孢子懸浮液備用。

參考標(biāo)準(zhǔn)[11]測(cè)定孢子懸浮液對(duì)黃曲條跳甲的生物學(xué)活性。將大小基本一致、健康的黃曲條跳甲成蟲用CO2麻醉后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，加入1 mL制備好的孢子懸浮液，迅速蓋好并上下顛倒30次后，將黃曲條跳甲取出轉(zhuǎn)移到鋪有濾紙的一次性塑料碗中，置于 (25±1) ℃、光周期為 14 h 光∶10 h暗，相對(duì)濕度(95±5)%的人工氣候箱中飼養(yǎng)。浸泡后的黃曲條跳甲用白蘿卜塊飼養(yǎng)，每2 d更換1次，每天記錄1次試蟲的死亡數(shù)，并將死蟲轉(zhuǎn)移到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿上(己滅菌，加適量無菌水保濕)，置于相同條件人工氣候箱中培養(yǎng)，根據(jù)蟲體體表長(zhǎng)出的特征菌絲確定是否為真菌侵染致死。以高溫滅菌后的0.05% (φ)吐溫?80溶液處理為對(duì)照，每個(gè)處理包括10頭黃曲條跳甲成蟲，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2010計(jì)算生物多樣性指數(shù)，包括多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù)，H)、均勻度指數(shù)(Pielou指數(shù)，J)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù) (Berger-Parker指數(shù)，d)。計(jì)算公式如下：

式中，S為物種數(shù)，ni為物種i的個(gè)體數(shù)，Pi為物種i的個(gè)體數(shù)占群落總個(gè)體數(shù)的比例 (即物種i的多度)，Hmax為H的最大理論值，N為群落物種個(gè)體總數(shù)，nmax為群落中最大物種的個(gè)體數(shù)。

致病力用校正死亡率來進(jìn)行判斷，計(jì)算公式如下所示：

死亡率=死蟲數(shù)/試蟲數(shù)×100%，

校正死亡率=(處理死亡率?對(duì)照死亡率)/(1?對(duì)照死亡率)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中棒束孢屬的多樣性

蟲生真菌的分離鑒定結(jié)果表明，這些菌株分屬于棒束孢屬的4個(gè)種，分別是玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea、粉棒束孢I. farinosa、爪哇棒束孢I.javanica和環(huán)鏈棒束孢I. cateniannulate。菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)如圖1所示。

圖 1 4種棒束孢菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)Fig. 1 Sporulation structure and spore morphology of four Isaria strains

玫煙色棒束孢菌株的菌落正面呈現(xiàn)杏色粉質(zhì)狀，背面呈現(xiàn)淡杏色，環(huán)鏈棒束孢菌株的菌落形態(tài)與玫煙色棒束孢相似，正面呈現(xiàn)淡杏色，比玫煙色棒束孢菌株顏色淺，而粉棒束孢菌株的菌落背面呈現(xiàn)白色，爪哇棒束孢菌株的菌落正面和背面均呈現(xiàn)白色，棒束孢屬的孢子形狀均為橢圓形。

對(duì)41株棒束孢菌株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，結(jié)果顯示分離純化得到的菌株中含爪哇棒束孢34株，玫煙色棒束孢5株，環(huán)鏈棒束孢和粉棒束孢各1株。

圖 2 基于棒束孢菌株ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on ITS sequence of Isaria strains

2.2 棒束孢菌多樣性指數(shù)分析

從土壤中共分離得到棒束孢屬菌41株，其中爪哇棒束孢數(shù)量最多(34株)，玫煙色棒束孢次之(5株)，粉棒束孢和環(huán)鏈棒束孢最少，均為1株。結(jié)果表明爪哇棒束孢為所分離棒束孢菌中的優(yōu)勢(shì)菌株，占總數(shù)量的82.93%，玫煙色棒束孢次之，占總數(shù)量的12.2%，粉棒束孢和環(huán)鏈棒束孢各占2.44%。多樣性指數(shù)(H)為0.593，均勻度指數(shù)(J)為0.160。

5種不同生境條件下，優(yōu)勢(shì)種均為爪哇棒束孢，休耕地、耕地、果園、草地和林地的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)分別為 0.889、1.000、1.000、0.889和 0.545。休耕地、耕地、果園、草地和林地的多樣性指數(shù)(H)分別為0.349、0、0、0.349 和 1.121，林地的H最大，說明林地的物種豐富度最高。休耕地、耕地、果園、草地和林地的均勻度指數(shù)分別為0.159、0、0、0.159和0.468，林地的均勻度指數(shù)最大，說明林地的棒束孢菌種間分配最均勻。

2.3 棒束孢菌的生境分布特征

對(duì)棒束孢屬菌的生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在東經(jīng) 101.14°～119.65°，北緯 20.42°～31.030°分離得到這些棒束孢屬菌株，福建、廣東、廣西地區(qū)分離出來的棒束孢屬菌株數(shù)量高于其他省份地區(qū)(表1)，而在這些地區(qū)中，可以看出草地、休耕地和林地等環(huán)境更有利于棒束孢菌的生長(zhǎng)(圖3)。

圖 3 棒束孢菌的生境分布特征Fig. 3 Habitat distribution characteristics of Isaria

表 1 棒束孢菌株的具體信息Table 1 Specific information of Isaria strains

2.4 棒束孢屬真菌對(duì)黃曲條跳甲成蟲的致病力

從土壤樣品分離出來的所有棒束孢屬真菌菌株中，隨機(jī)選取了9株不同的菌株對(duì)黃曲條跳甲成蟲進(jìn)行生物活性測(cè)定。結(jié)果如表2所示，其中玫煙色棒束孢IfH6102菌株在處理黃曲條跳甲成蟲11 d后，校正死亡率最高，達(dá)60.87%。

表 2 棒束孢菌株對(duì)黃曲條跳甲的致病力Table 2 Pathogenicity of Isaria strain to Phyllotreta striolata

玫煙色棒束孢IfH6102菌株處理黃曲條跳甲出現(xiàn)死蟲后，將死蟲轉(zhuǎn)移到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿上，在光學(xué)顯微鏡下，可觀察到白色菌絲首先從黃曲條跳甲尸體的觸角、足關(guān)節(jié)、胸部、胸足等剛毛濃密部位和節(jié)間膜上伸出體外，隨著時(shí)間推移，整個(gè)蟲體被白色菌絲包裹，如圖4所示。

圖 4 菌株IfH6102侵染黃曲條跳甲不同時(shí)間的形態(tài)Fig. 4 Characteristics of Phyllotreta striolata after infected by strain IfH6102 for different time

3 討論與結(jié)論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人類活動(dòng)對(duì)自然的影響越來越大，加之氣候不斷變化，許多物種生境發(fā)生了較大變化，環(huán)境保護(hù)、綠色健康發(fā)展變得越來越重要，生物防治也受到廣泛關(guān)注。作為一種重要的生防資源，昆蟲病原真菌也是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，了解和保護(hù)昆蟲病原真菌資源有利于人與自然的和諧相處。爪哇棒束孢能有效防控褐飛虱Nilaparvata lugens、美國(guó)白蛾Hyphantria cunea、薊馬等農(nóng)業(yè)害蟲的種群數(shù)量[12]。玫煙色棒束孢對(duì)粉虱(煙粉虱Bemisia tabaci、溫室白粉虱Trialeurodes vaporariorum等)、蚜蟲(梨黃粉蚜Aphanostigma iaksuiense、桃粉蚜Hyalopterus arundimis等)、象甲(茶芽粗腿象甲Anthonarainae quari maculate、茶大灰象甲Sympiezomias citri等)、柑橘木虱Diaphorina citri等多種害蟲均有較高的控制潛力[13-17]。粉棒束孢又名蟲草棒束孢，可入侵包括蜱螨目、鞘翅目、同翅目、鱗翅目等在內(nèi)的100多種昆蟲[18]。環(huán)鏈棒束孢對(duì)白蜘蛛Tetranychus cinnabarinus、斜紋夜蛾Spodoptera litura、小菜蛾P(guān)lutella xylostella等農(nóng)業(yè)害蟲具有較好防效[19-20]。從現(xiàn)有報(bào)道來看，棒束孢屬真菌更易入侵鱗翅目昆蟲，對(duì)鞘翅目昆蟲防效相對(duì)較弱，可能是因?yàn)轺[翅目昆蟲結(jié)構(gòu)更利于真菌孢子黏附，而鞘翅目昆蟲有鞘翅，真菌孢子吸附入侵相對(duì)困難。目前鮮見棒束孢屬菌對(duì)黃曲條跳甲的致病力研究相關(guān)報(bào)道。華南地區(qū)十字花科蔬菜連作指數(shù)高，黃曲條跳甲的危害非常嚴(yán)重，已經(jīng)成為廣東近年來防治次數(shù)最多的主要害蟲之一，給廣東農(nóng)業(yè)發(fā)展帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[21]。黃曲條跳甲的防治方法主要有物理防治、農(nóng)業(yè)防治、生物防治和化學(xué)防治，物理防治主要利用黃板和黑光燈進(jìn)行誘集殺滅；農(nóng)業(yè)防治主要從耕作方式入手，利用十字花科蔬菜與非十字花科蔬菜輪作，減輕黃曲條跳甲為害；生物防治手段目前仍不夠成熟，并沒有實(shí)現(xiàn)大量的田間應(yīng)用，如黃曲條跳甲的寄生天敵繭蜂，在施放后并未得到該蜂建立種群的有效依據(jù)，有報(bào)道稱白僵菌、綠僵菌能侵染黃曲條跳甲的幼蟲和成蟲，但研究仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段[22-23]；化學(xué)防治目前依然是黃曲條跳甲的主要防治手段，主要的化學(xué)藥劑有噻蟲嗪、噻蟲胺、阿維菌素、噠螨靈、啶蟲脒和氯蟲苯甲酰胺等，但由于農(nóng)戶長(zhǎng)期大量地不合理施藥，黃曲條跳甲對(duì)大部分化學(xué)農(nóng)藥均產(chǎn)生了較高的抗性[24]。對(duì)于黃曲條跳甲的防治，不應(yīng)局限于某一種單一的防治手段，而應(yīng)從實(shí)際出發(fā)，多種防治相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)十字花科蔬菜的綠色安全生產(chǎn)。

本研究從我國(guó)多個(gè)省區(qū)不同環(huán)境的土壤中分離棒束孢屬真菌的菌株，共得到4個(gè)種，其中爪哇棒束孢菌株數(shù)量最多、分布最廣，粉棒束孢、玫煙色棒束孢和環(huán)鏈棒束孢菌株數(shù)量較少，說明爪哇棒束孢菌株是優(yōu)勢(shì)菌種。從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，從我國(guó)不同地區(qū)分離得到的棒束孢菌相似性較高，說明我國(guó)棒束孢菌種間的遺傳差異并不明顯，可能是因?yàn)椴杉瘶悠穮^(qū)域棒束孢菌并沒有形成地理隔離，其種間仍存在基因交流，也可能由于棒束孢菌對(duì)生境依賴性較高，種群穩(wěn)定性較好，遺傳變異發(fā)生較少。另有研究表明，棒束孢屬對(duì)單一的生境有較強(qiáng)的依賴性[25]。從選取的9株菌株對(duì)黃曲條跳甲的致病力結(jié)果來看，大部分供試菌株對(duì)黃曲條跳甲都有一定的致病力，由于黃曲條跳甲幼蟲階段是生活在土壤中為害植株，而化學(xué)農(nóng)藥則對(duì)土壤中的黃曲條跳甲幼蟲防效較差，可以考慮使用蟲生真菌來防治土壤中的幼蟲，化學(xué)農(nóng)藥防治地面上的成蟲，化學(xué)農(nóng)藥與生防真菌相互結(jié)合以控制害蟲為害，減少化學(xué)農(nóng)藥施用量，進(jìn)一步減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染，延緩害蟲抗藥性的發(fā)展。

在自然環(huán)境中, 蟲生真菌的生長(zhǎng)、分布與氣候條件、土壤性質(zhì)、動(dòng)植被豐富度、海拔高度、人類活動(dòng)以及歷史環(huán)境變遷等多種因素有關(guān)[26]。氣候條件豐富、人類活動(dòng)少的地區(qū)更有利于蟲生真菌的生長(zhǎng)。本研究對(duì)菌株的鑒定是從菌落形態(tài)、分生孢子結(jié)構(gòu)及ITS序列方面著手的，還需要通過其他方式進(jìn)一步準(zhǔn)確地鑒定菌株的種類，進(jìn)而了解其生物多樣性。