王 崇，王連軍，田小海，雷 劍，柴沙沙，焦春海，楊新筍

(1 湖北省農(nóng)業(yè)科學院 糧食作物研究所/湖北省甘薯工程技術研究中心/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064； 2 長江大學 農(nóng)學院，湖北 荊州 434000； 3 湖北省農(nóng)業(yè)科學院，湖北 武漢 430064)

甘薯Ipomoea batatas是旋花科Convolvulaceae番薯薯Ipomoea雙子葉植物，主要起源于南美洲等熱帶、亞熱帶地區(qū)，是世界第七大糧食作物、中國第五大糧食作物[1]。甘薯富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、維生素、胡蘿卜素、花青素、氨基酸、鈣、磷、鉀等多種物質(zhì)，營養(yǎng)價值豐富[2-3]。甘薯抗旱性強，耐貧瘠能力強，具有極強的適應性，在中國具有悠久的栽培歷史[4]。甘薯是無性繁殖作物，染色體數(shù)目多，遺傳背景復雜，在遺傳上高度雜合，中國的甘薯栽培種94%以上具有‘南瑞苕’和‘勝利百號’的遺傳信息，造成中國甘薯遺傳背景狹窄，嚴重制約甘薯品種的遺傳改良[5]。甘薯近緣野生種種質(zhì)資源豐富，在世界范圍內(nèi)分布有600～700種，具有豐富的遺傳多樣性和潛在的基因資源，如高淀粉含量、抗病蟲、抗病毒、抗旱等優(yōu)良特質(zhì)，可為改良甘薯品種和拓寬甘薯基因庫提供重要的基因資源[6-7]。

伴隨現(xiàn)代生物技術不斷發(fā)展、更新，DNA分子標記技術在植物研究領域中廣泛應用于植物種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建、親緣關系鑒定和遺傳圖譜構建等[8]。Yang等[9]使用SSR標記分析了380個甘薯品種的遺傳多樣性和遺傳結構；蘇一鈞等[10]篩選出30對多態(tài)性豐富的SSR引物，對303份甘薯地方材料進行了遺傳多樣性和群體結構分析，發(fā)現(xiàn)303份甘薯材料間親緣關系較近，遺傳多樣性豐富；季志仙等[11]選用6個ISSR標記對17份甘薯品種進行分析，顯示同類型品種間的遺傳相似性較高，親緣關系密切。SSR和ISSR等分子標記技術主要是基于植物基因組DNA開發(fā)，在植物親緣鑒定和遺傳背景研究中具有極好的應用價值。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，基于線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)和葉綠體DNA(Chloroplast DNA，cpDNA)開發(fā)的分子標記技術也越來越廣泛地應用于植物遺傳分析[12-13]。

mtDNA具有細胞質(zhì)遺傳特性，一些mtDNA參與編碼具有重要生物學功能的蛋白或亞基，如核糖體和生物氧化鏈上某些重要酶的部分亞基，還與細胞生命周期、真核細胞抗藥性有關[14]。在植物細胞中，mtDNA參與調(diào)控子葉大小、葉片形狀、植物細胞質(zhì)雄性不育，還影響擬南芥、玉米和黃瓜等作物的葉綠體結構以及光合作用[15-16]。mtDNA具有進化速度快、缺少重組以及嚴格母系遺傳等特點，且線粒體基因組較小、易于測序，已經(jīng)成為研究植物遺傳進化和系統(tǒng)發(fā)育的理想工具[17]。cpDNA具有單倍型、母系遺傳、缺乏雜合細胞質(zhì)、不發(fā)生等位基因重組等特性，非編碼區(qū)不受選擇影響，核酸位點表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性和變異，與mtDNA序列廣泛用于研究植物的系統(tǒng)發(fā)育、種間或種內(nèi)的親緣關系鑒定等研究[18]。Godbout等[19]采用nad3、nad5 等mtDNA序列對北美短葉松進行了系統(tǒng)發(fā)育研究，結果表明mtDNA可反映北美短葉松的地理關系；Hu等[20]使用mtDNA非編碼區(qū)序列分析薯蕷屬的遺傳背景，結果表明線粒體基因重組時存在豐富的變異位點，可用于鑒別區(qū)分不同薯蕷品種；馬麗等[21]使用matK基因序列對59個石榴品種進行了鑒定和分類，結果表明matK可用于石榴的系統(tǒng)發(fā)育分析。

本研究通過對3個甘薯栽培種及8個近緣野生種進行mtDNA和cpDNAmatK序列分析，綜合分析3個甘薯栽培種及8個近緣野生種的親緣關系和遺傳多樣性，為甘薯近緣野生種的保護及利用提供參考，為甘薯遺傳育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為3個甘薯栽培種(‘浙紫薯3號’‘鄂薯6號’‘皖薯7號’)及8個近緣野生種(何魯牽牛I. holubii、‘黃蔦蘿’I. hederifoliavar. lutea、空心菜I. aquaticaForsk、‘月光花’I.alba、‘黃色朝顏’I. obscuraKeniak、變色牽牛I.ndica、旋轉牽牛I. digitata huge caudex、樹牽牛I.carnea)，種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所。長勢旺盛時進行樣品采集。

1.2 DNA 提取

采取試驗樣品新鮮、幼嫩葉片后，參考Yang等[9]的方法，使用改良CTAB法提取甘薯栽培種及近緣野生種的基因組DNA。使用分光光度計測量DNA的濃度，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。將 DNA 質(zhì)量濃度稀釋到 70～80 ng/μL，在?20 ℃冰箱中保存，備用。

1.3 PCR 擴增

本研究選用6對mtDNA和1對cpDNA通用引物(表1)，引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。將7對引物分別在試驗材料中進行擴增。PCR反應擴增體系：10× PAGE Buffer(Mg2+)2.5 μL，NTPs(10 mmol/L)2.0 μL，正向引物和反向引物各.0 μL，基因組 DNA(70～80 ng/uL)1.0 μL，EasyTaq?DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 補至總體積為5 μL。PCR 擴增程序：94 ℃ 預變性 5 min；94 ℃ 變性 30 s，56～57 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min；在 4 ℃ 條件下保存 min。使用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，以單一、清晰、明亮條帶作為檢測標準，將檢測合格的擴增產(chǎn)物送到武漢天一輝遠生物科技有限公司進行雙向測序。

表 1 試驗采用引物信息Table 1 The information of primers used in this experiment

1.4 數(shù)據(jù)分析

用軟件DNAstar對測序結果進行手動校對，刪除兩端冗余堿基，將正向序列和反向序列進行拼接，使用軟件MEGA X[25]對拼接好的序列進行比對，使用軟件 DnaSP 6.0[26]對序列進行多態(tài)性 (π)和單倍型(Hd)等序列特征分析。使用MEGA X軟件采用鄰接距離矩陣法(Neighbor-joining distance matrix method)構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，使用自展法(Bootstrap)進行可信度檢測，重復1000次。使用軟件NetWork的中介鄰接網(wǎng)絡(Median-joining network，MJ)算法構建單倍型關聯(lián)圖。

2 結果與分析

2.1 序列特征分析

對6個mtDNA序列和cpDNAmatK序列的測序結果進行多態(tài)性分析，mtDNA序列ccb256在3個甘薯栽培種及8個近緣野生種中無堿基差異，其余6個序列表現(xiàn)出多態(tài)性。對表現(xiàn)出多態(tài)性的序列進行分析，將ccb203、nad2/1-2、nad2/4-5、nad5/4-5、nad7/1-2和matK在11個材料中的擴增序列進行對位排列后，上述序列的長度分別為494、1 247、1 503、1 665、964 和 840 bp。6 個序列擴增片段GC堿基占比分別為46.52%～47.17%、53.90%～54.69%、48.02%～48.54%、45.93%～46.50%、56.39%～57.23%和32.90%～34.09%。在5個線粒體序列中，序列nad5/4-5的核酸多態(tài)性最高(0.003 95)，含有20個變異位點、10個單一突變位點、10個簡約信息位點、6個插入/缺失位點。ccb203、nad2/1-2、nad2/4-5和nad7/1-2序列的核苷酸多態(tài)性、變異位點數(shù)、單一突變位點數(shù)、簡約信息位點數(shù)和插入/缺失位點數(shù)分別為 0.003 20、0.000 17、0.003 43、0.001 86，5、1、12、4，2、1、3、0，3、0、9、4，6、11、63、24。matK序列的核苷酸多態(tài)性、變異位點數(shù)、單一突變位點數(shù)比mtDNA序列的高，簡約信息位點數(shù)和插入/缺失位點數(shù)比mtDNA序列的低。6個序列合并后，序列長度為 6 713 bp，共有變異位點 69 個，其中單一突變位點39個、簡約信息位點30個，插入/缺失位點111個(表2)。

表 2 試驗材料的序列多態(tài)性信息Table 2 Sequence polymorphism information of experiment materials

ccb203、nad2/1-2、nad2/4-5、nad5/4-5、nad7/1-2和matK序列中，單倍型數(shù)量最多的是cpDNA序列matK，9 個；ccb203、nad2/1-2、nad2/4-5、nad5/4-5和nad7/1-2的單倍型數(shù)量分別是5、2、8、8和5。6個序列的單倍型多樣性分別為0.818、0.182、0.927、0.927、0.818 和 0.945，matK 區(qū)域的單倍型多樣性最高。單倍型多樣性方差和單倍型多樣性標準差最大的區(qū)域是nad2/1-2，分別為0.020 61和0.144。6個序列合并后，單倍型數(shù)量、單倍型多樣性、單倍型多樣性方差和單倍型多樣性標準差分別是 9、0.945、0.004 34 和 0.066(表 3)。

表 3 試驗材料的單倍型多樣性Table 3 Haplotype diversity of experiment materials

對 6 個序列進行 Tajima’sD測驗和 Fu and Li’sD*/F*測驗，在5個mtDNA序列中，序列nad7/1-2 的 Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和 Fu and Li’sF*值最大，序列nad2/1-2 的 Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和 Fu and Li’sF*值最小，且 5 個mtDNA 序列的 Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和Fu and Li’sF*值均差異不顯著 (P>0.10)，符合中性進化模型。cpDNAmatK 的 Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和 Fu and Li’sF*值分別為?1.627 84、?2.009 96 和?2.168 40，在 0.050.10)，符合中性進化模型(表4)。

表 4 Tajima’s D 測驗和 Fu and Li’s D＊/F＊測驗Table 4 Tajima’s D test and Fu and Li’s D＊/F＊ test

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對3個甘薯栽培種及8個近緣野生種進行遺傳多樣性分析，11份試驗材料間的遺傳距離均在0.000 00～0.005 84 之間，‘月光花’與‘黃色朝顏’2個品種間的遺傳距離最大，為0.005 84，3個栽培種間的遺傳距離為0，3個栽培種及8個近緣野生種間的平均遺傳距離為 0.003 26 (表 5)。

基于鄰接法構建甘薯栽培種及近緣野生種的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，可將3個甘薯栽培種及8個近緣野生種分為2大類(Ⅰ和Ⅱ) (圖1)，第一大類包括7個近緣野生種，第二大類包括3個栽培種和1個近緣野生種。第一大類又可分為2類，何魯牽牛、‘黃色朝顏’、樹牽牛和旋轉牽牛被歸為一類，‘黃蔦蘿’‘月光花’和變色牽牛被歸為一類；第二大類可分為2類，第一類為空心菜，第二類為‘浙紫薯3號’‘鄂薯6號’和‘皖薯7號’(圖 1)。

圖 1 鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 1 The phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method

2.3 單倍型中介網(wǎng)絡

使用軟件NetWork中介鄰接網(wǎng)絡算法對3個甘薯栽培種及8個近緣野生種的單倍型繪制網(wǎng)絡圖，11份材料表現(xiàn)出9種單倍型，圖中無明顯主體單倍型(圖2)。單倍型H_1～H_8分別對應何魯牽牛、‘黃蔦蘿’、空心菜、‘月光花’‘黃色朝顏’、變色牽牛、旋轉牽牛和樹牽牛，單倍型H_9對應‘紫薯3號’‘鄂薯6號’和‘皖薯7號’。單倍型之間呈線狀排列，無主體單倍型，單倍型H_1與H_5有共同節(jié)點，單倍型H_3與H_8有共同節(jié)點，單倍型H_4與H_6有共同節(jié)點。中介鄰接網(wǎng)絡算法分析結果與鄰接聚類分析結果一致，甘薯栽培種與野生種之間存在界限。

圖 2 單倍型中介鄰接網(wǎng)絡圖Fig. 2 Median-joining network for haplotypes

3 討論與結論

甘薯近緣野生種是重要的育種資源，基于mtDNA和cpDNA序列特征對甘薯近緣野生種進行分析，可為甘薯育種提供新的資源。序列特征分析在甘薯及近緣野生種分析中被廣泛應用，劉崢等[27]以及俞立璇等[28]使用ITS序列對甘薯栽培種和近緣野生種進行序列特征分析，顯示ITS序列可用于旋花科的系統(tǒng)演化關系分析，為甘薯野生種的利用提供了理論依據(jù)。matK序列是葉綠體中進化速率較快的基因之一，存在一定程度的分化，由于葉綠體基因組較為保守，其進化速率遠低于核基因的進化速率[29]。低進化速率限制了matK及其他葉綠體基因在低級分類層面(如屬、亞屬)中的應用，matK序列不能應用于甘薯屬內(nèi)間的親緣關系研究。線粒體基因在系統(tǒng)學研究中應用較為廣泛，如nad1基因應用于探討稻族Oryzeae的系統(tǒng)發(fā)育[30]；nad5序列應用于秦艽組植物的分子系統(tǒng)發(fā)育分析及物種鑒定[31]；nad7/1-2序列用于分析突尼斯柑橘砧木種質(zhì)資源的遺傳多樣性[32]。與核基因相比，線粒體基因如nad1序列在較高等級類群的系統(tǒng)發(fā)育重建中有更高的信息量，變異水平更適于在高等級層面的系統(tǒng)發(fā)育重建。相較于核基因和葉綠體基因，線粒體基因變異速率低，結構不穩(wěn)定，但篩選出合適的線粒體序列片段仍能為植物的系統(tǒng)學研究和親緣關系鑒定提供新的證據(jù)。在植物系統(tǒng)學研究中，采用mtDNA對甘薯近緣野生種進行分析的報道較少，通過mtDNA和cpDNA對甘薯近緣野生種進行分析，可為研究旋花科的系統(tǒng)演化提供新的方法和指導。

本研究選用6個mtDNA序列和1個cpDNA序列的引物在3個甘薯栽培種及8個近緣野生種中進行擴增，結果顯示，在11個材料中，mtDNA序列ccb256無多態(tài)性，表現(xiàn)出多態(tài)性的序列占比為85.7%，表明基于mtDNA和cpDNA開發(fā)的通用引物在甘薯栽培種及近緣野生種的多態(tài)性分析中具有良好的多態(tài)性。具有多態(tài)性的5個mtDNA序列中，nad2/1-2和nad7/1-2序列中的GC占比大于AT占比，ccb203、nad2/4-5和nad5/4-5序列中的GC占比小于AT占比，表明nad2/1-2和nad7/1-2序列更為穩(wěn)定。matK序列的GC占比小于AT占比，matK序列的核苷酸多樣性高于mtDNA序列的，與Yang等[33]基于核基因組和葉綠體基因組分析中國橡樹的試驗結果基本保持一致。對mtDNA序列的變異位點進行分析，產(chǎn)生的變異位點以單一突變位點和插入/缺失突變?yōu)橹鳎蛄衝ad5/4-5的單一突變位點最多(10個)，序列nad2/4-5插入/缺失位點在6個序列中最多(63個)。與mtDNA序列相比，cpDNA序列matK的單一突變位點(23個)比mtDNA序列的多，而插入/缺失位點(1個)遠少于mtDNA序列的。對6個序列的單倍型多樣性進行分析，mtDNA序列中nad2/1-2序列的單倍型數(shù)量和單倍型多樣性最小(2、0.182)。matK序列的單倍型數(shù)量(9)和單倍型多樣性(0.945)比5個mtDNA序列的高，表明相較于mtDNA序列，cpDNA序列反映的序列特征信息更為豐富。對甘薯近緣野生種進行分析時，mtDNA和cpDNA序列結合獲得的結果更為準確。

中性檢驗(Neutrality test)是通過統(tǒng)計學的檢驗方法分析DNA數(shù)據(jù)，進而檢驗自然選擇[34]。本研究采用 Tajima’sD和 Fu and Li’sD*/F*檢驗，結果顯示基于 mtDNA 序列分析的 Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和 Fu and Li’sF*值均差異不顯著(P>0.10)，符合中性進化模型；matK序列的Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和 Fu and Li’sF*在0.050.10)，符合中性進化模型。中性檢驗的結果表明，甘薯近緣野生種在遺傳進化時表現(xiàn)穩(wěn)定，符合中性進化模型，沒有出現(xiàn)種群擴張的情況，單倍型網(wǎng)絡無中心再度證明甘薯近緣野生種在遺傳進化時無種群擴張的情況。本研究3個甘薯栽培種及8個近緣野生種間的遺傳距離在 0.000 00～0.005 84之間，平均遺傳距離為0.003 26，表明3個甘薯栽培種及8個近緣野生種的遺傳距離小，彼此間親緣關系近，遺傳多樣性低，如‘浙紫薯3號’‘鄂薯6號’和‘皖薯7號’之間的遺傳距離為0，親緣關系密切。使用5個mtDNA序列和1個cpDNAmatK序列對甘薯栽培種和近緣野生種進行分析時，栽培種之間的遺傳距離為0，栽培種與近緣野生種的遺傳距離和近緣野生種之間的遺傳距離在0.000 94～0.005 84之間，說明mtDNA序列和matK序列在同屬種間的系統(tǒng)發(fā)育和種內(nèi)材料的親緣關系分析中具有一定的參考價值。使用鄰接法構建3個栽培種及8個近緣野生種的系統(tǒng)進化樹，11個材料被分為2大類：7個近緣野生種歸為Ⅰ類，3個栽培種和空心菜歸為Ⅱ類。甘薯栽培種和近緣野生種聚類在不同組別中，表明mtDNA序列和cpDNA序列可用于甘薯栽培種和近緣野生種的關系鑒定?？招牟撕?個甘薯栽培種歸為一類，空心菜與3個栽培種的遺傳距離一致，四者之間的遺傳距離小于空心菜與‘月光花’‘黃色朝顏’、變色牽牛和旋轉牽牛之間的遺傳距離，大于空心菜與樹牽牛之間的遺傳距離，推測空心菜是旋花科植物進化的重要研究對象。系統(tǒng)發(fā)育樹中，‘黃色朝顏’與3個甘薯栽培種的親緣關系較遠，遺傳距離較大，‘月光花’與‘黃色朝顏’的親緣關系較遠，遺傳距離較大，‘黃色朝顏’與‘月光花’可用于甘薯育種的親本選配。

3個甘薯栽培種及8個近緣野生種的mtDNA和cpDNA序列分析顯示，mtDNA序列和cpDNA序列可用于甘薯栽培種及近緣野生種的遺傳多樣性和親緣關系研究，為旋花科植物的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究提供指導，還可為甘薯種質(zhì)資源的開發(fā)利用和篩選提供理論依據(jù)。