張雪琳 蔣晨 徐珊 田字彬

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 青島 266003)

幽門螺桿菌(HP)是一種革蘭陰性、螺旋狀、鞭毛狀細菌，屬于變形桿菌門，在嚴酷的胃酸環(huán)境中具有很強的生存能力[1]。HP感染是全世界人群中比較常見的感染之一，發(fā)展中國家的患病率為70%～90%，發(fā)達國家患病率為25%～50%[2-3]。既往研究集中于HP致消化性潰瘍、胃腺癌或黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(MALT)的臨床表現(xiàn)和相關(guān)機制的研究。近年來，HP感染與腸道菌群紊亂的相關(guān)性逐漸被關(guān)注，如實驗表明HP豐度與腸道共存微生物多樣性呈負相關(guān)[4-6]，并且HP感染可以導(dǎo)致諸如變形桿菌等細菌的異常增加[7]?，F(xiàn)有證據(jù)提示，在HP定植期間，除HP具有直接致病性外，其對于腸道微生物網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)的破壞也可能影響疾病的發(fā)生發(fā)展。

近年來，褐藻因其抗黏附、抗氧化、抗毒性、免疫調(diào)節(jié)、抗凝、抗感染等多種生物功能而被廣泛研究。巖藻多糖是從海洋食用褐藻中提取的一種復(fù)合硫酸多糖，由巖藻糖和硫酸鹽與少量的半乳糖、甘露糖、木糖以及糖醛酸等形成的聚合物[8-9]，已經(jīng)證實巖藻多糖具有抗炎作用[10]，可刺激菌群產(chǎn)生含有促進健康成分的短鏈脂肪酸(SCFAs)，以增強腸道屏障的完整性[11]。巖藻多糖干預(yù)可增加腸道糞球菌、利肯菌和丁酸球菌的豐度，提高厚壁菌門/擬桿菌門的豐度比例，防止致病菌入侵腸道黏膜[12]。但巖藻多糖作為一種功能性食品，是否也具有改善HP感染后紊亂的腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用，目前還沒有明確的研究報道。本研究通過基因組測序分析，探討巖藻多糖是否通過調(diào)控腸道菌群并參與HP感染的治療，為從分子水平揭示巖藻多糖調(diào)節(jié)腸道菌群的機制提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級C57BL/6小鼠22只，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[許可證號：SCXK(魯)2019 0003]。飼養(yǎng)條件為標準實驗條件[SPF級，溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%，12-12 h晝夜周期,完全營養(yǎng)顆粒飼料飼養(yǎng)]。分析純級別巖藻多糖來自于青島明月海藻集團有限公司國家重點實驗室。HP PMSS1標準菌株來自于青島市市立醫(yī)院。本研究獲得青島大學(xué)動物倫理委員會批準。

1.2 方法

22只小鼠按干預(yù)方式不同隨機分為5組：空白對照組(A組)4只小鼠每天灌胃3 mL雙蒸水，持續(xù)5周；單純感染組(B組)每天先灌胃1×1014CFU/L的HP菌懸液3 mL，持續(xù)3周，然后再每天灌胃3 mL雙蒸水，持續(xù)2周；單純干預(yù)組(C組)每天灌胃40 g/L的巖藻多糖3 mL，持續(xù)2周，后3周每天灌胃3 mL的雙蒸水；預(yù)防干預(yù)組(D組)每天灌胃40 g/L的巖藻多糖3 mL，持續(xù)2周，后3周每天灌胃濃度1×1014CFU/L的HP菌懸液3 mL；治療干預(yù)組(E組)每天灌胃濃度1×1014CFU/L的HP菌懸液3 mL，持續(xù)3周，后2周每天灌胃40 g/L的巖藻多糖3 mL。采集實驗結(jié)束當天的小鼠糞便樣品。

小鼠的糞便樣品進行16S rDNA菌群測序 (由北京百邁克生物科技有限公司完成，https：//international.biocloud.net/zh/project/detail/324153/)，使用 Illumina HiSeq 測序平臺完成操作分類單位(OTU)聚類與注釋，每個OTU代表一個菌種，通過OTU-Venn分析，獲得腸道菌群的微生物多樣性和不同微生物的豐度；利用QIIME軟件生成不同分類水平的物種豐度表，再利用R語言工具繪制成樣品各分類學(xué)水平的物種分布柱狀圖；使用Mothur(version v.1.30)軟件進行α多樣性分析，獲得衡量腸道菌群豐度的指標Chao1和衡量物種多樣性的指標Shannon指數(shù)；使用QIIME軟件，通過非度量多維標定法(NMDS)對各組小鼠的腸道菌群進行β多樣性分析；通過LEfSe技術(shù)分析計算各組小鼠腸道菌群中各菌類的LDA值，并繪制菌類分布柱狀圖，比較各組間腸道菌群菌類構(gòu)成是否有差異；再利用Metastats分析各組小鼠的腸道菌群相對豐度并進行t檢驗，獲得各組間差異較大的生物標志菌屬。

2 結(jié) 果

2.1 腸道菌群OTU數(shù)量和物種分布

菌群測序和OTU聚類與注釋分析結(jié)果顯示，所有小鼠的糞便樣本中共有腸道菌群OTU為604個，其中A組小鼠的腸道菌群的OTU為395個，B組為341個，C組為454個，D組為401個，E組為344個，同時每組小鼠腸道菌群中均含有的OTU為258個。

利用QIIME軟件和R語言工具繪制成各組樣品門屬分類水平的物種分布柱狀圖(圖1)。圖中顯示，所有小鼠腸道菌群的優(yōu)勢菌門主要為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、Epsilonbacteraeota、Patescibacteria、放線菌門(Actinobacteria)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、柔膜菌門(Tenericutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)等(圖1a)；優(yōu)勢菌屬主要有杜氏桿菌屬(Dubosiella)、Muribaculaceae、乳桿菌屬(Lactobacillus)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、毛螺菌科NK4A136菌(LachnospiraceaeNK4A136group)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、疣微菌科(Ruminococcaceae)、Ileibacterium和乳球菌屬(Lactococcus)等(圖1b)。

a：門水平腸道菌群分布柱狀圖，b：屬水平腸道菌群分布柱狀圖，A～E分別為A～E組圖1 各組小鼠門、屬水平的腸道菌群分布柱狀圖

2.2 各組小鼠腸道菌群的α多樣性分析

A～E組的小鼠腸道菌群的Chao1指數(shù)分別為334.715±28.530、249.306±42.753，369.473±89.737，281.579±78.247，268.863±23.176，組間比較差異有顯著性(F=3.045,P<0.05)，其中A組與B、E組比較、C組與B、E組比較，Chao1指數(shù)值均顯著增高(t=-2.634～3.833，P<0.05)。各組小鼠腸道菌群的Shannon指數(shù)分別為3.503±0.415，2.825±0.482，2.744±0.933，3.025±0.722，3.368±0.112，各組之間比較均無顯著差異(F=1.435,P>0.05)。

2.3 各組小鼠腸道菌群β多樣性分析結(jié)果

β多樣性分析結(jié)果顯示，各組小鼠腸道菌群菌屬構(gòu)成存在顯著差異(P<0.01)，且結(jié)果的可靠程度高(Stress<0.2)，其中A組和E組的差別最小，B、C、D組與A組比較差異有顯著性(P<0.01)。見圖2。圖中不同顏色小圓點分別代表A～E組，點與點之間的距離表示各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)之間的相似度，距離越近相似度越高。

圖2 各組小鼠腸道菌群的β多樣性分析結(jié)果

2.4 各組小鼠腸道菌群的LEfSe分析結(jié)果

對各組小鼠腸道菌群中相對豐度較高的菌類LDA值進行比較，同樣顯示各組小鼠腸道菌群菌類構(gòu)成存在顯著差異(LDA值>2)。LEfSe分析結(jié)果顯示,A～E組小鼠腸道菌群中具有顯著性差異的菌類共有67種(LDA值>2)，其中A組中的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、理研菌屬(Rikenella)、Negativibacillu屬、Butyricicoccus、Ruminiclostri-dium、Negativibacillus、螺旋桿菌、Parabacteroi-des屬、Alloprevotella屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳桿菌科(lactobacteriaceae)等19種菌類相對豐度較高；B組中的梭菌屬(Clostridium)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、Flavobacteriales、Weeksel-laceae科等7種菌的相對豐度也較高；C組中紅蝽菌科(Coriobacteriaceae)、Atopobiaceae、產(chǎn)糞甾醇真細菌(Eubacteriumcoprostanoligenes)、Marvinbryantia屬、腸桿菌屬(Enterorhabdus)、伊格爾茲氏菌(Eggerthellaceae)等16種菌類相對豐度較高；D組中芽孢桿菌科(Bacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、Erysipelotrichaceae科、Faecalibaculum屬、CandidatusStoquefichus、斷鏈真桿菌屬(Eubacteriumfissicatena)等14種菌類相對豐度較高；E組中梭菌目(Clostridiales)、梭菌屬(Clostridia)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Parasutterella屬、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、β變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)、lachnoclostridium屬等11種菌類LDA值較高。

2.5 各組小鼠腸道菌群的Metastats分析結(jié)果

根據(jù)Metastats分析獲得各組小鼠的腸道菌群相對豐度，進行t檢驗后各組小鼠腸道菌群間差異較大的生物標志菌屬有Bifidobacterium、Faecalibaculum、Desulfovibrio、Alistipe和Chryseobacterium。其中A組與C組、C組與D組進行比較，Bifidobacterium的相對豐度顯著增高(P<0.05)；C組與A、B、E組比較，F(xiàn)aecalibaculum的相對豐度顯著增高(P<0.05)；A組與C組及B組與C、D、E組比較，脫硫弧菌(Desulfovibrio)的相對豐度顯著增高(P<0.05)；A組與C、D組比較，澤瀉屬(Alistipe)的相對豐度顯著增高(P<0.05)；A、C組與E組比較，Chryseobacterium的相對豐度顯著增高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腸道菌群中差異較大的微生物菌屬相對豐度比較

3 討 論

微生態(tài)調(diào)節(jié)在HP感染治療中的作用愈發(fā)受到重視。隨著抗HP藥物治療的普及，HP耐藥率也逐年增高[13-14]，因此，亟需一種經(jīng)濟、有效、安全且基于非抗生素的治療方法，目前專家學(xué)者多采用益生菌作為抗生素治療的輔助添加劑[15]。研究表明，一些益生菌可以顯著降低HP感染及藥物治療不良反應(yīng)的發(fā)生率，還有一些益生菌能夠有效提高HP的根除率。L.gasseri是一種在抗耐克拉霉素HP感染中發(fā)揮重要作用的益生菌[16]，LactobacillusacidophilusDDS-1J在體外對HP具有生長抑制的作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)輔助使用Lactobacillusspecies等益生菌，HP的根除率可能會升高[18-22]。S.boulardii作為根除HP的輔助劑，效果顯著[23-24]。

益生元是不可消化的食物成分，可以從水果、蔬菜、谷物和其他可食用植物中獲得。它們在通過上消化道時不會被代謝或吸收，而是由結(jié)腸中的細菌發(fā)酵，以增強有益菌(如雙歧桿菌和乳酸桿菌)的生長和活性[25-27]。過往的研究顯示，一些輔助添加劑可作為益生元調(diào)控益生菌在腸道中的相對豐度，添加魔芋低聚糖可顯著增加腸道雙歧桿菌的豐度[28]。攝入黃烷醇可以增加有益的腸道細菌，如乳酸桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)，而降低致病性細菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)的豐度[29]。食物成分如多酚會提高益生菌如Bifidobacteriaceae等菌的相對豐度,而降低致病性細菌如大腸桿菌(E.coli)、梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)和HP的相對豐度[30]。

盡管如此，鮮有揭示益生元對HP感染后腸道菌群紊亂調(diào)節(jié)作用的研究。為研究益生元如巖藻多糖對HP感染后腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用，本研究選用C57BL/6品系小鼠感染HP，研究巖藻多糖不同干預(yù)方式對小鼠腸道菌群數(shù)量及構(gòu)成的影響。本研究采用α多樣性分析反映樣品中的物種豐度及物種多樣性，α多樣性中的Chao1指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少,Shannon指數(shù)用于衡量物種多樣性；同時以物種分布柱狀圖體現(xiàn)樣品中門屬水平的物種種類和豐度組成；通過LEfSe分析比較各組間Biomarker的LDA值是否具有統(tǒng)計學(xué)差異；最后通過Metastats軟件分析篩選出各組樣品中有差異的物種。本研究中α多樣性分析結(jié)果顯示B組樣品的生物多樣性顯著低于A組，提示HP感染降低了腸道菌群的生物多樣性，而D組和E組生物多樣性均出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)，物種豐度均顯著高于B組，說明HP感染前后應(yīng)用巖藻多糖干預(yù)均能增加腸道生物多樣性，可調(diào)整腸道菌群紊亂狀況，而HP感染前預(yù)防性巖藻多糖干預(yù)對腸道生物多樣性保護作用更明顯。本研究Metastats分析結(jié)果提示，C組相對于A、B、E組，SCFAs糞便桿菌Faecalibacterium的相對豐度增高，說明巖藻多糖的干預(yù)會增加有益細菌如Faecalibacterium的相對豐度；C組相對于A、B組，D、E組相對于B組，Desulfovibrio相對豐度降低，說明巖藻多糖的干預(yù)會減少小鼠腸道有害菌屬如Desulfovibrio相對豐度；C、D組相對于A組，Alistipe的相對豐度降低，說明巖藻多糖的干預(yù)會減少小鼠腸道有害菌屬如Alistipe的相對豐度。

菌群發(fā)酵中最重要的代謝物是SCFAs[31]。對于微生物群落而言，SCFAs為微生物交叉服務(wù),可被細菌(如還原乙酸菌、硫酸鹽還原細菌和產(chǎn)甲烷菌)用作碳和能源[32]。SCFAs是由1～6個碳組成的飽和脂肪族有機酸，其中乙酸鹽(C2)、丙酸酯(C3)和丁酸酯(C4)含量最高(95%)[33]，丁酸和丙酸可以調(diào)節(jié)腸道生理和免疫功能。巖藻多糖可促進產(chǎn)SCFAs細菌，如Faecalibacterium的豐度，提示巖藻多糖干預(yù)可作為一種緩解HP感染后腸道菌群紊亂的輔助治療方法。

綜上所述，HP感染可致腸道生物多樣性下降，通過巖藻多糖干預(yù)后，增加了腸道微生物的多樣性，改善了腸道菌群結(jié)構(gòu)的紊亂狀況，使產(chǎn)SCFAs細菌的相對豐度增加，有害菌屬的相對豐度降低。本研究從分子水平揭示了巖藻多糖調(diào)節(jié)腸道菌群的機制，為巖藻多糖參與HP感染的綜合治療提供了數(shù)據(jù)支持。