孔凡華，王 軒，于連洋，白沙沙，徐佳佳，楊春雪，李 東，崔亞娟,

（1.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京 100069；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100083）

卵磷脂是從植物或動(dòng)物中提取出來(lái)的磷脂混合物，包括磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、鞘磷脂（SM）及其他磷脂[1]，天然卵磷脂廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，以蛋黃、大豆內(nèi)含量較多。按照原料的不同，分為蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂和菜籽卵磷脂。蛋黃卵磷脂是從蛋黃中提取并精制得到的天然磷脂混合物，主要為磷脂酰膽堿，蛋黃磷脂的脂肪酸組分大多為棕櫚酸、油酸，其次為硬脂酸、亞油酸，并且還含有微量的花生四烯酸（AA）和二十二碳六烯酸（DHA）等多不飽和脂肪酸及奇數(shù)碳脂肪酸[2]。蛋黃卵磷脂具有抗氧化[3]、抗菌[4]、抗炎[5]、提高人體記憶和認(rèn)識(shí)功能[6]、降低血壓[7]和預(yù)防肥胖癥[8]等重要的生理功能。

目前，磷脂的檢測(cè)方法主要有紫外可見(jiàn)分光光度法[9]、薄層色譜法[10]、液相色譜法[11?12]、核磁共振法[13]、紅外光譜法[14]和質(zhì)譜分析法[15?16]，其中高效液相色譜法靈敏度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，是最為有效的檢測(cè)方法?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法有GB/T 35867-2018[17]《糧油檢驗(yàn) 卵磷脂中磷脂含量的測(cè)定 高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法》適用于粗制含油卵磷脂、無(wú)油卵磷脂和從植物油脂中提取的卵磷脂的測(cè)定；GB 5009.272-2016[18]《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的測(cè)定》適用于含油大豆磷脂、脫油大豆磷脂、大豆油、菜籽油、花生油、葵花籽油中磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）的測(cè)定；SN/T 3851-2014[19]《出口食品中磷脂的測(cè)定 比色法》適用于肉制品、豆制品、乳制品、雞蛋、花生、糖果等中磷脂含量的測(cè)定，只能測(cè)定雞蛋中的總磷脂的含量，不能測(cè)定磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量；NY/T 2004-2011[20]《大豆及制品中磷脂組分和含量的測(cè)定 高效液相色譜法》適用于大豆及制品（豆腐、豆?jié){、腐乳等）中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的測(cè)定；GB/T 5537-2008[21]《糧油檢驗(yàn) 磷脂含量的測(cè)定》適用于植物原油、脫膠油及成品油中磷脂的測(cè)定。上述標(biāo)準(zhǔn)方法主要集中在大豆卵磷脂和菜籽卵磷脂的檢測(cè)，尚缺少蛋黃卵磷脂檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。

蛋黃卵磷脂具有重要的生理功能，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，蛋黃卵磷脂的研究起步較晚，目前國(guó)內(nèi)蛋黃卵磷脂的檢測(cè)多采用紫外分光光度法[22?23]，利用最大吸收波長(zhǎng)對(duì)卵磷脂進(jìn)行定量分析，由于卵磷脂的紫外吸收波長(zhǎng)較低，處于紫外吸收波長(zhǎng)的末端，容易受到其他溶劑的干擾，影響定量結(jié)果。劉穎等[23]通過(guò)薄層色譜法定性檢測(cè)蛋黃卵磷脂，但由于薄層色譜法需要較高的點(diǎn)樣技術(shù)，且成功率低，使結(jié)果重現(xiàn)性差。示差折光檢測(cè)器（RI）在定量分析卵磷脂時(shí)有一定的優(yōu)勢(shì)，但該檢測(cè)器對(duì)溫度敏感且靈敏度低，儀器平衡時(shí)間長(zhǎng)，基線不容易穩(wěn)定，限制了示差折光檢測(cè)器的使用。龔雁等[24]報(bào)道了蛋黃中卵磷脂測(cè)定的HPLC-ELSD法，但是只建立了蛋黃中PC的檢測(cè)方法，沒(méi)有建立PE的檢測(cè)方法，方法測(cè)得PC的加標(biāo)回收率為98.2%～128.2%，方法準(zhǔn)確度較低，且流動(dòng)相體系用到了正己烷，大部分液相系統(tǒng)的密封圈不耐受正己烷溶液，限制了方法的使用。ELSD是通用型檢測(cè)器，不容易受溶劑體系、梯度洗脫和基線干擾，具有高分辨率和快速分離的優(yōu)勢(shì)，是檢測(cè)卵磷脂的理想檢測(cè)器，本研究?jī)?yōu)化了HPLC-ELSD測(cè)定蛋黃卵磷脂的色譜條件，以雞蛋為研究對(duì)象，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，考察方法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和適用性，并通過(guò)測(cè)定已知磷脂含量的雞蛋樣品，對(duì)比研究蒸發(fā)光檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，以期建立雞蛋中磷脂的精準(zhǔn)分析檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋樣品 采自超市；乙腈、甲醇、異丙醇 色譜純，美國(guó)Fisher公司；磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%）、磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%）Sigma公司；氯化鈉、氯仿、甲醇、乙酸、乙醚 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

EYELA MMV-1000W振蕩器、EYELA N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化株式會(huì)社；Agilent 1260 高效液相色譜儀、蒸發(fā)光檢測(cè)器和ChemStation for LC systems（版本序列號(hào)：Rev.B.04.03-SP2 [105]）色譜工作站 美國(guó)Agilent公司；Cleanert氨基固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞蛋中總脂肪的提取 雞蛋樣品中總脂肪的提取參考Folch等[25]的方法。準(zhǔn)確稱取混勻的雞蛋樣品5 g（精確到0.0001 g），加入100 mL氯仿-甲醇（2:1,v/v），混勻并超聲（功率為100 W）35 min，抽濾并收集濾液，用氯仿-甲醇（2:1,v/v）溶液重復(fù)清洗濾渣，將所收集濾液全部混合并入分液漏斗中。向分液漏斗中加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液，振蕩搖勻，靜止30 min后，收集下層氯仿層，重復(fù)以上操作兩次，將氯仿層合并，旋轉(zhuǎn)蒸干。

1.2.2 雞蛋中磷脂的純化 磷脂的純化參考GB 5009.272-2016[18]方法，將50 mL氯仿加入到收集的總脂肪中，渦旋混合均勻，將10.0 mL油脂氯仿溶液移入氨基硅膠固相萃取柱中，然后依次用2.0 mL氯仿-異丙醇（2:1,v/v）混合溶液和3.0 mL的乙酸-乙醚（2:144,v/v）混合溶液淋洗小柱，然后用3.0 mL甲醇洗脫出磷脂，再重復(fù)4 次，收集洗脫液。洗脫液在45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸至近干，轉(zhuǎn)為氮吹，吹干后加入10.0 mL甲醇溶液溶解，在4000 r/min下離心5 min，取上清液用于液相色譜分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Intersil SIL-100A色譜柱（4.6 mm×100 mm,5 μm）；流速為0.8 mL/min；柱溫30 ℃，ELSD采用分流模式，以空氣作為霧化氣，氣體流速1.7 L/min，漂移管溫度45 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；流動(dòng)相A：乙腈-異丙醇（55:5,v/v），流動(dòng)相B：甲醇-異丙醇（35:5,v/v），洗脫程序?yàn)椋?～14 min，A由70%變換至0，B由30%變換至100%；14～24 min，100% B保留10 min；24～25 min，A由0 變換至70%，B由100%變換至30%；25～45 min，70% A保留20 min。

1.2.4 方法驗(yàn)證 按照GB/T 27404-2008 《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[26]方法學(xué)要求，建立校準(zhǔn)曲線及校準(zhǔn)曲線的工作范圍；逐步稀釋樣品上機(jī)測(cè)定，R（S/N）=3 時(shí)的測(cè)定濃度作為檢出限，R（S/N）=10 時(shí)的測(cè)定濃度作為定量限；稱取雞蛋樣品，按照實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的方法，平行測(cè)定6 次，計(jì)算磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的重現(xiàn)性；根據(jù)雞蛋中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量，按本底值的0.5 倍、1 倍、1.5 倍三個(gè)濃度水平，進(jìn)行三水平六平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以回收率的高低評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度。

1.2.5 ELSD和UV檢測(cè)方法比較研究 鑒于目前磷脂標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法多采用紫外檢測(cè)法[18?21]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了ELSD和UV檢測(cè)方法的比較研究，參照GB 5009.272-2016[18]，UV檢測(cè)波長(zhǎng)被選擇205 nm，其他色譜條件不變，選取已知PC和PE含量的雞蛋質(zhì)控樣品（質(zhì)控樣品由客戶提供），PC和PE標(biāo)示含量分別為20 mg/g和9 mg/g，按1.2.1 和1.2.2 前處理方法提取純化磷脂后，平行測(cè)定6 次，分別進(jìn)HPLCELSD和HPLC-UV液相系統(tǒng)分析，測(cè)定樣品中PC和PE的含量。

1.2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定 選取市售不同品種的雞蛋，按1.2.1 和1.2.2 提取純化卵磷脂，按1.2.3 色譜條件進(jìn)行液相色譜分析，計(jì)算不同品種雞蛋中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量。

1.3 卵磷脂含量的計(jì)算

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，按1.2.3 色譜條件進(jìn)行液相色譜分析，根據(jù)磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的保留時(shí)間定性，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。

1.3.2 結(jié)果計(jì)算 試樣中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量X以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，按下式計(jì)算：

式中：X-試樣中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺的含量，mg/g；ρ-從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺的濃度，mg/mL；V-試樣溶液的體積，mL；m-試樣的質(zhì)量，g；f-稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)與儀器配套的ChemStation for LC systems工作站軟件完成數(shù)據(jù)的采集與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

HPLC法是卵磷脂分離和定量的常用方法，基于磷脂分子頭部基團(tuán)極性大小和磷脂上脂肪酸酰基鏈?zhǔn)杷缘牟煌?，可以采用正相或反相系統(tǒng)洗脫。文獻(xiàn)報(bào)道[27]，磷脂分離常用的流動(dòng)相體系為正己烷-異丙醇-水、乙腈-甲醇-水、氯仿-甲醇-水（氨水），考慮到氯仿-甲醇-水（氨水）體系ELSD基線噪音比較高[24]，優(yōu)先選擇其他兩種流動(dòng)相體系。參考Zhou等[28]的方法，配制PC和PE混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，甲醇-乙腈等度洗脫，結(jié)果顯示，PC和PE可以達(dá)到基線分離，但兩個(gè)峰間隔近20 min，且PE的色譜峰與溶劑峰非常接近。異丙醇具有改善峰形的作用，在流動(dòng)相中加入少量異丙醇可以延長(zhǎng)溶劑峰與目標(biāo)峰的距離，故選擇甲醇/乙腈/異丙醇梯度洗脫，PC和PE的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和樣品色譜如圖1 和圖2，可見(jiàn)PC和PE在優(yōu)化的流動(dòng)相體系下峰形良好，適合定量分析。

圖1 PC和PE標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖（HPLC-ELSD）Fig.1 Chromatogram of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine（HPLC-ELSD）

圖2 雞蛋中PC和PE液相色譜圖（HPLC-ELSD）Fig.2 Chromatogram of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in egg（HPLC-ELSD）

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限 按1.2.1 和1.2.2提取純化卵磷脂，在1.2.3 色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，得到磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺分別在0.052～1.031、0.041～0.823 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，PE的線性回歸方程為y=0.0001x+0.0557，PC的線性回歸方程為y=0.0002x+0.0677，回歸系數(shù)均大于0.99，PC和PE的檢出限分別為0.75 mg/g和0.60 mg/g，定量限分別為2.50 mg/g和2.00 mg/g。

2.2.2 精密度和重復(fù)性 取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照1.2.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)測(cè)定6 次，PC和PE的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.55%和2.50%，表明儀器精密度良好，結(jié)果見(jiàn)表1。準(zhǔn)確稱取同一雞蛋樣品6 份，測(cè)定樣品中PC和PE含量，結(jié)果顯示雞蛋中PC和PE含量及保留時(shí)間的RSD均小于5%，表明方法重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 PC和PE的峰面積及其RSD%（n=6）Table 1 Peak area and RSD% of PC and PE (n=6)

表2 雞蛋中PC和PE的含量及保留時(shí)間（n=6）Table 2 Content and peak time of PC and PE in egg (n=6)

2.2.3 方法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 采用樣品加標(biāo)試驗(yàn)進(jìn)行本方法準(zhǔn)確度驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表3，由表3 知，雞蛋中PC的回收率為93.0%～101.8%，平均回收率為97.4%，RSD為2.66%，PE的回收率為96.7%～106.7%，平均回收率為102.1%，RSD為3.99%，結(jié)果表明PC和PE準(zhǔn)確度高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，適合雞蛋中PC和PE含量的測(cè)定。

表3 雞蛋加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Results of recovery rate in egg (n=6)

2.3 ELSD和UV檢測(cè)測(cè)定結(jié)果

選取PC和PE標(biāo)示含量分別為20、9 mg/g雞蛋質(zhì)控樣品，HPLC-ELSD測(cè)定PC和PE結(jié)果分別為21.9～24.2 mg/g和9.12～10.4 mg/g，HPLC-UV測(cè)定PC和PE結(jié)果分別為28.6～32.3 mg/g和13.7～14.8 mg/g，HPLC-ELSD測(cè)量結(jié)果更符合標(biāo)示值，HPLC-UV和真值差別較大，這可能是因?yàn)槁蚜字幱谧贤馕詹ㄩL(zhǎng)的末端，紫外檢測(cè)很容易受到溶劑和環(huán)境等因素的干擾，導(dǎo)致結(jié)果誤差大，可見(jiàn)，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器更適合蛋黃卵磷脂的測(cè)定，本研究與龔雁等[24]研究結(jié)果相吻合。

2.4 樣品的測(cè)定

不同雞蛋中PC和PE的含量見(jiàn)表4，由表4 可知，不同品種雞蛋中PC和PE含量差別較大，這是因?yàn)殡u的產(chǎn)地、品種和飼料等會(huì)影響蛋黃卵磷脂脂肪酸的組分，從而影響蛋黃卵磷脂的含量，張琳等[29]研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物可以提高蛋黃卵磷脂的含量。

表4 雞蛋中PC和PE的測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 4 Content of PC and PE in eggs (n=3)

3 結(jié)論

蛋黃卵磷脂被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健領(lǐng)域，目前，尚未建立蛋黃卵磷脂檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，本實(shí)驗(yàn)采用反相色譜系統(tǒng)梯度洗脫，ELSD檢測(cè)器檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋黃卵磷脂中PC和PE的準(zhǔn)確定量。甲醇-乙腈-異丙醇體系，對(duì)液相色譜儀器要求低，普適性強(qiáng)。建立的回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.99，PC和PE的檢出限分別為0.75 mg/g和0.60 mg/g，定量限分別為2.50 mg/g和2.00 mg/g；雞蛋中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.55%和2.50%，加標(biāo)回收率分別為93.0%～101.8%和96.7%～106.7%。測(cè)定已知磷脂含量的雞蛋樣品，結(jié)果顯示，與HPLC-UV相比，實(shí)驗(yàn)建立的HPLCELSD方法測(cè)定結(jié)果符合標(biāo)示值，表明實(shí)驗(yàn)建立的方法可以對(duì)蛋黃卵磷脂準(zhǔn)確定量。